羧甲基纤维素酶测定原理
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定（CMC糖化力法）1、定义：1克固体酶粉（或1毫升液体酶），在40℃pH﹦4.6条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠（CMC-Na），产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g（u/ml）表示。
2、原理：CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖，还原糖能将3，5﹣二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下测定吸光度值A，吸光度与酶活成正比。
CMC-Na糖化力主要代表内切β-1.4-葡聚糖的活力和外切酶活力总和。
3、试剂：3.1 0.1mol/LpH﹦4.6醋酸﹣醋酸钠缓冲溶液：将49.0ml0.2mol/L醋酸钠溶液和51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸馏水。
注意：0.2mol／L醋酸钠溶液：称取27.22g结晶乙酸钠（AR）定容至1000ml。
0.2mol／L醋酸溶液：称取冰乙酸（AR）11.5ml定容至1000ml。
3.2 3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。
3.3 葡萄糖标准溶液（1.0mg /ml）：称取1.000克葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用蒸馏水溶解后定容至1000ml，冰箱保存备用。
3.4 羧甲基纤维素钠溶液：称2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸馏水中，加醋酸缓冲溶液100 ml,混匀后存于冰箱内备用。
配后隔天使用。
4、仪器4.1 分光光度计4.2 恒温水浴，50℃4.3 25 ml具塞刻度试管5、分析步骤：5.1标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法
一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法一、概述羧甲基纤维素酶（carboxymethylcellulase，CMCase）是一种重要的木质素酶，它可以将木质素分解为更小体积的产物，从而可促进木质素利用。
因此，测定CMCase活性对于研究木质素加工过程和利用资源至关重要。
二、试剂①P-nitrophenyl 葡糖苷（PNPG）：20 mg/ml;②NaHCO3：0.1 mol/L;③Tris-HCl buffer：50 mmol/L, pH 7.2;④凝胶分离 Buffer：30 mmol/L Tris-HCl，1.5 mmol/L EDTA，10 mmol/L Na2SO4，pH=7.2三、实验步骤1.溶质处理：将木质素细胞壁材料（包括原料和残渣）用凝胶分离buffer缓慢搅拌，直至得到悬浮液。
2.仪器设置：将悬浮液100 μL加入定量瓶中，并加入足量的Tris-HCl缓冲液（50 mL）。
然后安装溶解度仪，并调节机器的参数，使水温调节在28-30℃，波速调节在400 Hz左右，进行10min的研磨处理。
3.测定：将研磨后的悬浮液取出，加入0.1mol/L NaHCO3 10 ml和P-nitrophenyl 葡糖苷（100 μL），搅拌均匀，测定其吸光度，以425nm波长，示定测定CMCase活性。
4.计算：根据吸光度值计算CMCase活性：CMCase活性（U/ml）=A/B，其中A为PNPG测定液的吸光度，B为研磨后悬浮液的吸光度。
四、安全措施1.实验时应戴好实验手套，操作时要注意卫生。
2.羧甲基纤维素酶属于酶分类，易挥发，操作时应尽量避免空气污染。
3.在实验室进行实验时，应注意实验室温度和湿度，使实验条件尽量达到推荐的实验要求。
4.搅拌完毕后，实验材料用大量水冲洗，然后再投入污水处理系统处理。
五、结论本实验介绍了一种简便、高效的羧甲基纤维素酶活性测定方法，建立的方法可以准确、灵敏地测定羧甲基纤维素酶活性，可广泛应用于木质素加工过程和资源利用的研究中。
纤维素酶活力的测定
β-糖苷酶活力的测定（CMC）一目的：掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。
原理：纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。
二试剂：1．3，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）：称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。
贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。
2．0.1mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（CH3COONa.3 H2O）13.61g，醋酸（CH3COOH）6.00g，用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。
3．1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。
4．代测酶液：称取酶粉1.0g（或吸取酶液1.00ml），先用少量的0.05mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40℃水浴锅中浸提1h，用四层纱布或脱脂棉过滤，滤液供测定用。
5．底物：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区0.5000g羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至0.001g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。
三仪器：分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。
四方法步骤：1．标准曲线的绘制分别吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4ml的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸馏水补充体积至2.oml,各加3，5-而硝基水杨酸1.5ml,在沸水浴中煮沸5min，冷却后分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。
三种主要酶活测定方法
土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。
在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。
所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。
纤维素酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂1）甲苯2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。
3）pH5.5醋酸盐缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天），5）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
纤维素酶活力的测定(sdu)
纤维素酶活力的测定高熹 168615140001一、实验原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。
酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
二、实验试剂1、3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。
加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。
存于棕色瓶中，放置一周后使用。
2、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
3、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。
使用前摇匀。
4、标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。
三、实验器材1、紫外可见分光光度计2、胶头滴管3、水浴锅4、试管5、移液管四、实验步骤1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8.0、1.0毫升的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1毫升,加3.5-二销基水杨酸显色剂3毫升,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21毫升,摇匀.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,在550nm处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。
2、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液。
洗衣粉中羧甲基纤维素含量测定方法的研究
洗衣粉中羧甲基纤维素含量测定方法的研究定方法曲jIf交口毛素青一,前言教甲基纤维紊(以下简称CMC)是一种有机助剂,它能将污垢保持在溶液中,使污垢不会再沉积在织物上,因此,它是洗衣粉中不可缺少的抗再沉积剂.我们查阅了一些国内外资料,发现目前洗衣粉中CMC含量的测定方法有下列三种.一是萘酚法,二是蓖酮法,三是苯酚法.三种方法的原理基车相同,都是与浓硫酸反应,再加入显色剂显色,测定其消光度,只是操作方法上有差别,其中萘酚法在加入萘酚试剂后,需在沸腾的水浴中加热几小时,显色时问太长,而蓖酮法在测定CMC含量时,虽然非常灵敏,但在有淀粉,蔗糖醋一类化舍物及其衍生物存在时,这一方法就不适用了.从查回到的外文资料中了解到,苯酚法测定CMC含量发色时间短,可用于生产过程中的中问控制分析.而目前国内只有原料CMC的标准测定方法,尚无有关洗衣粉中CMC含量的分析方法研究报告,因此,找到一种快速准确的方法测定洗衣粉中CMC含量,对于指导生产有着现实意义.二,苯酚法测定洗衣粉中CMC的含量反应机理:教甲基纤维紊在浓硫酸中加热分解,定量地生成乙醇酸,乙醇酸与苯酚接触时,呈砖红色,通过测定其吸光度,求褐CMC的百分含量.方法验证:按照DetergentAtlalysis中介绍,如有非离子存在时,必须知道或能够测定出非离子含量t我们首先选用标准CMC溶液进行实验条件的初步确定.cMc标准溶液:用原料CMC溶解配制成cMc标准溶液,此溶液lml含0.5mgCMC.非离子标准溶液:用原料非离子配制戒溶液,此溶液1ml含5mg非离子.波长选择试验:通过波长扫描可得标准CMC液处于最大吸收峰时的波长为486.5nm,固此,选择波长为490nnl.测定条件试验:在波长已确定的情况下,严格控制好显色反应的条件是十分重要的.为此,做了显色剂用量,浓硫酸用量,硫酸钠用量及显色时间对视I定结果的影响试验.(1)显色剂用量试验为了找到显色剂的最佳用量,以使吸光度达到最大值,采用保持浓硫酸15ml,CMC标准溶液4ml,硫酸钠2.00±0.05g,显色时间5分钟不变,而改变显色剂苯酚溶液的用量测其吸光度.表1:吸光度与显色剂用量的关系序号显色剂ml吸光度1l0.549220.710330.766440.724袁2:吸光度与浓硫酸用量的关系由表1可以看出,当显色剂苯酚溶液为3ml时,吸光度达到了晟大值,用量再大,吸光度值反而降低,因此选择使用3ml显色剂.(2)浓硫酸用量对吸光值的影响试验CMC在浓硫酸中加热分解,定量地生成乙醇酸,如果浓硫酸用量不够,则会使结果偏低,为了找到浓硫酸的最佳用量,我们采用了保持显色剂3ml,CMC标准溶液4ml,硫酸钠2.00±0.05g,显色耐间5分钟不变,而改变浓硫酸的毫升数,测定其吸光度.从上表可以看出,当浓硫酸用量为15mI时,吸光度达到了最大值,用量增加到20mI耐,吸光度反而降低了,因此选择浓硫酸用量为15ml.{3)无水硫酸钠加量对吸光度的影响保持CMC标准溶液4ml,苯酚溶液3ml,浓硫酸15ml不变,改变硫酸钠的加量,测定其吸光度.袁3无水硫酸钠加量厦吸光度的影响袁4显色时『可对吸光度的影响从表3可以看出,加无水硫酸钠1.00±0.05g与2.00±0.05g时的吸光度基车一样,而加量为300±005g时,吸光度明显降低,为了保证硫酸钠的用53量,叉要使吸光度达到最大,选择无水硫酸钠的加量为2.00±0.05g.(4)显色时间对吸光度的影响显色反应的速度有快有慢,有的几乎可以瞬间完成.并能保持较长时间,将表二中的三只样品延长表5标样粉中cMc音量卑号01l2J3l4j5}6l平均吸光度f06207l06501】0.6317l05968l05954}06323l062】0 c%10981103l10010舛10941t0010船标准偏差0036相对标准偏差%【37显色时间,测定其吸光度,以便找到一个既能显色充分, 叉能得到最大吸光度的最佳显色时间.从表4可看出,显色反应速度很快,在硫酸钠的溶解过程中,已基本显色完全,且较稳定,随着时间的增长, 吸光度值井无明显增加,所以显色时间定为5分钟.从上述实验条件验证结果可知,苯酚法测定洗衣粉中CMC含量时,显色剂苯酚溶液用量为3ml,浓硫酸用量为15ml,无水硫酸钠的用量为2O0±005g,显色时间为5分钟,为测试最佳条件.测定方法:称取10g样品于250ml烧杯中,加适量水溶解(若不溶可加热),并转移至50~tmi容量瓶中,用水稀释至刻度, 摇匀.备用.将上述制备液用滤纸过滤,吸取过滤液5m]于100ml小烧杯中加2O0±0.o5g无水硫酸钠,3ml苯酚溶液,再用移液管加15ml浓硫酸,立即摇匀至溶液澄清透明,放置5分钟后,在49Ohm处测其吸光值,通过标准曲线计算CMC含量.标准曲线的绘制:分别移取0.5ml,lml,2ml,3ml,4mlCMC标准溶液于lOOml烧杯中,再分别加入H20至5ml,各加入2.O0±0.05g无水硫酸钠,15ml浓硫酸迅速摇动,至硫酸钠完全溶解,且溶液澄清,透明.放置5分钟用石英比色皿在波长490nm处测定各自的吸光度,绘制成标准曲线.三,非离子对测定CMC含量的影响目前市场销售的洗衣粉,其中的活性物有些是全阴离子的表面活性剂,有些是全非离子的,还有的是两种表面活性剂复配型的,而非离子的存在,前面已经提到对测定CMC时的吸光度有很大的影响,通过CMC标准溶液和非离子标准溶液做不同非离子含量时的CMC标准曲线(非离子含量分别为2.5%,5.o%,10O%)可知:若洗衣粉中有非离子存在,则必须知道或能够测定出非离子的含量,根据洗衣粉中非离子含量的不同,在制作曲线时,相应地吸取适量的非离子标准溶液.四,苯酚法测定洗衣册中CMC含量的精密度和准确度1,方法精密度精密度标准偏差表示,用测去污用的标样粉不含非离子的CMC标准曲线进行了6次平行I定.由表5数据可以看出,测定结果与配方值(标样粉中CMC为1%)吻合的相当好,说明了本方法的实用性.本方法的相对误差为±4%.2,方法准确度由于分析测定过程相当复杂,影响因素较多,而对所有的或可想象的影响因素都进行系统研究是不经济的,有时也是不可能的,因而在大多数情况下难以对分析结果的准备度作出全面的评价.在实际分析工作中,常用标准物质或准确的方法回收率来核验,评价分析结果的准确度,我们以标样粉中加入标准CMC溶液酣定其回收率的方法桉对,检验苯酚法分析结果的准确度.分别称取标样粉log溶解稀释至50Oral,移出75IIll至10Oral容量瓶中,加入25mlCMC标准溶液,测其吸光度,计算其CMC含量(表6)袁6CMC加入回收率试验敷据汇总表序标样粉加入理论测得回收C眦:CMC0lC号加S率%后ABSmgmgl0565060638.938.298.220.5870.62740339798530601063241.040.097.640594062940.7398978袁7五种洗袁粉_刹定结果汇总表喾非离配方值子吸光度C眦:%%l无0.42040.8l_02无0.5,3111.6l_43有0.6269l5l44无0.5056l5l_45.有O.441.82.0五,不同品种的洗衣粉所测CMC台■与配方中加入的CMC含量作对照由表7数据可以看出,测定出的CMC含量与配方中加入的CMC量基本相符,而洗衣粉本身在配制过程中活性物加量或其它助剂加量有时偏高或偏低,只要是在配方值上下适当范围浮动都是正常的,也说明了该种方法的可行性.六,讨论洗衣粉中含有无机助剂硅酸盐,加入浓硫酸后,硅酸盐以SiO2形式沉淀干扰显色测定,我们按照测定方法,将洗衣粉样品溶解稀释后,同时对未过滤和过滤后的试液进行显色测定,结果发现,加入浓硫酸后,未过滤的样品混浊,吸光度值增大,且几分钟后,就会有结晶析出,而过滤后的试液,加入浓硫酸后澄清,透明,30分钟内不会有结晶析出,因此,只要将样品试液过滤,然后再发色测定,就可得到满意的结果.●{作者单拉:上海白猫有限套司质量部)。
纤维素酶活的测定(优选.)
纤维素酶活的测定一纤维素酶活力单位定义在37℃、pH值为5.50的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
二测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中的纤维素酶的活力。
三试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
3.1 葡萄糖溶液，c（C6H12O6）=10.0mg/ml称取无水葡萄糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。
3.2 乙酸溶液，c(CH3COOH)=0.1mol/L吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。
3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）=0.1 mol/L称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml。
3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）=200g/L称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100ml。
3.5 乙酸-乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH-CH3COONa）称取三水乙酸钠11.57g，加入冰醋酸0.85ml，加水溶解，定容至1000ml，测定溶液的pH值，如果pH偏离5.50，用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调至5.50.3.6 羧甲基纤维素钠溶液，0.8%（w/v）称取羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.40g，加入到盛有30ml3.5缓冲溶液的烧杯中，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过50ml），停止搅拌，用3.5缓溶将其定容至50ml，羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为3天。
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纤维素酶活力的测定
一、目的
学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。
二、原理
纤维素酶是一种多组分酶，包括C1 酶、CX 酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。
其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。
纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
（1）纤维素酶制剂 500mg
（2）新华定量滤纸 50mg / 份× 4
（3）脱脂棉花 50mg / 份× 4
（4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg
（5）水杨酸苷 500mg
2．主要仪器
（1）722 型或其他型号的可见分光光度计
（2）恒温水浴2 台
（3）沸水浴锅
（4）电炉子
（5）剪刀
（6）万分之一分析天平
（7）恒温干燥箱
（8）冰箱
（9）试管架
（10）胶头滴管
（11）具塞刻度试管20mL×24
（12）移液管或加液器0.5 mL×3；2mL×7
（13）容量瓶100 mL×6；1000 mL×3
（14）量筒50 mL×2；100 mL×1；500 mL×1
（15）烧杯100 mL×6；500mL×3；1 000 mL×1
3．试剂（均为分析纯）
（1）浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液
将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。
4℃冰箱中保存（可用12～15 天）。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
准确称取DNS 6.3g 于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。
贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。
（3）0.05 mol/L pH4.5 的柠檬酸缓冲液A 液（0.1 mol/L 柠檬酸溶液）：准确称取C6H8O7 · H2O （MW=210.14）21.014g 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。
4℃冰箱中保存备用。