DNS法测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
纤维素酶活力的测定
实验二十纤维素酶活力的测定一、目的学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。
二、原理纤维素酶是一种多组分酶，包括C 酶、C 酶和 |?-葡萄糖苷酶三种主要组分。
其中C1 X 1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成X纤维寡糖，|?-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。
纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料（1）纤维素酶制剂 500mg（2）新华定量滤纸 50mg / 份 4（3）脱脂棉花 50mg / 份 4（4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg（5）水杨酸苷 500mg2．主要仪器（1）722 型或其他型号的可见分光光度计（2）恒温水浴 2 台（3）沸水浴锅（4）电炉子（5）剪刀（6）万分之一分析天平（7）恒温干燥箱（8）冰箱（9）试管架（10）胶头滴管（11）具塞刻度试管 20mL24（12）移液管或加液器 0.5 mL3；2mL7（13）容量瓶 100 mL6；1000 mL3（14）量筒 50 mL2；100 mL1；500 mL1（15）烧杯 100 mL6；500mL3；1 000 mL13．试剂（均为分析纯）（1）浓度为 1mg/mL的葡萄糖标准液将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至 100mL，充分混匀。
4℃冰箱中保存（可用 12～15 天）。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液 262mL，再加到 500mL含有 185g酒石酸钾钠（C H O KNa ! 4H O，MW=282.22）的热4 4 6 2水溶液中，再加5g结晶酚（C H OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na SO ，MW=126.04），6 5 2 3搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。
DNS法测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。
选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
530nm比色。
2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。
单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。
目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。
根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。
两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
DNS法测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。
选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
530nm比色。
2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。
单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数；
K：曲线斜率；
T：反应时间，min；
1000：mg换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。
目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。
根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。
纤维素酶活力的测定实验报告
生物化学实验报告题目：纤维素酶活力的测定-----3、5—二硝基水杨酸法姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科3班同组者：张刚刚时间：2011/4/22一、【实验目的】学习和掌握3、5—二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。
二、【试验原理】纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物,在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
实验中定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为1个酶活力单位。
N×OD值对应的葡萄糖量纤维素酶活力单位＝——————————————30×LN——酶液的稀释倍数30——糖化所用时间L——反应酶液毫升数三、【试验器材】比色管10支，5ml移液管，移液枪，500ml大烧杯，水浴锅，电炉，搅拌振荡器，722 型或其他型号的可见分光光度计。
四、【实验试剂】1．酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待测（用PH4.5乙酸—乙酸钠缓冲溶液配制）。
2．0.1mol/L PH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
3．3、5—二硝基水杨酸显色液：称取10克3、5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。
dns法测定纤维素酶活力原理
dns法测定纤维素酶活力原理纤维素酶，这个名字听起来就像高大上的科学词汇，其实它在咱们的日常生活中可是大有来头。
想想看，咱们的衣服、纸张，甚至一些食品里，都和它有着千丝万缕的联系。
说白了，纤维素酶就是一种能把纤维素这个“大块头”分解成小分子的“超级英雄”。
要不然，这些纤维素可真是“难啃的骨头”，光靠我们自己的牙口可没法啃下去。
所以，这种酶的活力就显得尤为重要了。
现在，咱们来聊聊用DNS法测定纤维素酶活力的原理，听起来有点复杂，其实也并不难，咱们慢慢道来。
DNS法其实就是一种颜色变化法。
嘿，你没听错，颜色变化！你想啊，咱们日常生活中，很多东西都是通过颜色来判断的，比如熟不熟、甜不甜，甚至是“这件衣服合不合适”。
所以，这个方法就是借助颜色变化，来观察纤维素酶的活力到底有多强。
这里的“DNS”指的是一种化学试剂，名字比较长，不想说了，简单点，叫它“变色剂”就行。
这个“变色剂”能跟分解后的纤维素反应，形成一种深红色的物质。
就像调色板上的颜色，越深的颜色，说明分解得越彻底，酶的活力就越强。
这个过程是怎么发生的呢？想象一下，纤维素在水中，纤维素酶像一个勤劳的小工人，正在不停地工作。
它一边“啃”着那些纤维素，一边把分解出来的小分子释放到水里。
好比咱们吃饭，吃了一口又一口，最后把盘子清理得干干净净。
然后，DNS法就是通过测量水里的颜色来评估纤维素酶的工作效率。
颜色越深，酶的活力越高，反之，颜色浅，就说明这位小工人可能今天状态不佳，干得不够。
可能有人会问，咱们为什么要关心纤维素酶的活力呢？这可是个好问题。
因为纤维素酶在许多行业里都有广泛的应用，比如说造纸、酿酒，甚至在生物燃料的生产中，都是不可或缺的“好帮手”。
如果咱们知道它的活力，就能调整工艺，优化生产，省时又省力，简直就是为生产效率加了一把火。
说说这个DNS法的操作步骤。
咱们得准备好一堆材料，包括纤维素、酶、还有那个神秘的“变色剂”。
然后，把纤维素和酶混合，放到特定的温度下，让它们好好亲密接触。
DNS法测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案
DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。
选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
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530nm比色。
2、酶活测定方法：
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考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。
单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
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测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。
目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。
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根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。
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两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
纤维素酶活力的测定实验报告
纤维素酶活力的测定实验报告实验名称：纤维素酶活力的测定实验目的：1.掌握测定纤维素酶活力的方法；2.了解纤维素酶的作用机制；3.探究不同条件对纤维素酶活力的影响。
实验原理：纤维素是植物细胞壁的主要组成部分之一，其主要成分是纤维素聚合物。
纤维素酶是一种能够水解纤维素的酶，通过降解纤维素将其转化为可利用的单糖。
纤维素酶活力可以通过测定其在特定条件下降解纤维素的速度来评估。
实验步骤：1.准备纤维素酶的测定液：将一定浓度的纤维素酶和适量的底物溶液混合。
2.将测定液分装到各个试管中，同时设置对照组。
3.将各个试管放置在恒温水浴中，控制温度为37℃。
4.在一定的时间间隔内，取出各个试管，加入一定量的酶停止液，停止反应。
5.将反应液和纤维素酶残余液通过离心仪离心，分离清除残余纤维素。
6. 取出上清液，加入Fehling试剂，进行加热反应。
7. 记录Fehling试剂发生颜色变化的时间，并用同样的方法测定对照组。
8.根据对照组的结果进行归一化处理，计算每个试管中的纤维素酶活力。
实验数据处理与结果分析：将实验数据整理成表格或图表，根据不同条件下的纤维素酶活力进行比较分析。
探究不同因素对纤维素酶活力的影响，如温度、pH值、底物浓度等。
分析结果可以得出，当温度和pH值处于一定范围内时，纤维素酶的活力最高。
底物浓度对纤维素酶活力也有一定影响，但超过一定浓度时，酶的反应速率将达到饱和状态。
实验结论：通过测定纤维素酶在不同条件下的活力1.温度和pH值对纤维素酶活力有显著影响，适宜的温度和pH值可以提高纤维素酶的活力。
2.底物浓度对纤维素酶活力也有一定影响，但过高浓度会使酶的反应速率达到饱和状态。
3.该实验结果可以对纤维素酶的应用提供参考，有助于优化纤维素酶的工业生产过程。
实验总结：通过本次实验，我们成功测定了纤维素酶的活力，并得出了温度、pH 值和底物浓度对其活力的影响。
实验结果对于纤维素酶的应用具有重要意义，可以为其在生物制造、生物能源等领域的应用提供参考。
纤维素酶活力测定方法
素酶是起协同作用的多组分酶系 , 可以促进纤维素的分 解 。纤维素酶主要来自于真菌和细菌 。按照其作用机 理 , 可分为内切葡聚糖苷酶 、外切葡聚糖苷酶和 β2葡萄 糖苷酶 3类 [5 ] 。 11211 内切葡聚糖苷酶 又称 Cx酶 、CMC 酶 、 endo2 1042β2D 2glucanase (来自真菌的简称 EG, 来自细菌的简 称 Cne) 。Cx酶作用于纤维素内部的无定型区域 , 随机 水解 1042β2葡萄糖苷键 , 将长链纤维素分子切短 , 产生 大量非还原性末端的小分子纤维素 。 11212 外切葡聚糖苷酶 又称 C1 酶 、 exo21042β2D2glu2 canase (来自真菌的简称 CBH, 来自细菌的简称 Cex) 。 C1酶作用于纤维素线状分子的末端 , 水解 1042β2D 2葡 萄糖苷键 , 每次切下 1个纤维二糖分子 , 又称纤维二糖 水解酶 ( cellobiohydrolase) 。 11213 β2葡萄糖苷酶 又称纤维二糖酶 、β21042gluco2 sidase (简称 BG) 。这类酶将纤维二糖或可溶性纤维糊 精水解成葡萄糖分子 。
22纤维素酶活力测定的主要方法近年来国内通用的和新提出的一些纤维素酶活力测定方法大多利用dns法原理即纤维素经纤维素酶水解后生成的还原糖能将35二硝基水杨酸dns中的硝基还原为氨基生成棕红色的氨基化合物
河北农业科学 , 2010, 14 (4) : 151 - 153 Journal of Hebei Agricultural Sciences
纤维素酶 除 了 将 纤 维 素 水 解 成 葡 萄 糖 等 有 效 成 分 外 , 还能通过提高植物细胞壁的通透性 , 来提高植物细 胞内含物的提取率 , 所以 , 纤维素酶广泛应用于以植物 为原料的工农业生产中 。
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DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。
选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
530nm比色。
2、酶活测定方法：
蒸馏水/ml 5 5 5
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。
单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
y = 0.56x - 0.0087
R 2 = 0.9976
-0.1
00.10.20.30.40.50.60
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
系列1
线性 (系列1)
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
浓度 mg/ml 吸光值
总酶活（10ml ） 单位 酶活
浓度mg/ml
吸光值
总酶活（10ml ） 单位 酶活 R2上清（未破碎）
0.229 0.125667 76.45772 7.645772 183上清（未破碎）
0.402 0.22 133.8517 13.38517 0.239
0.130667
79.4998
7.94998
0.405
0.222
135.0685
13.50685
测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。
目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。
根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。