凯氏定氮法
凯氏定氮法
凯氏定氮法中文名称：凯氏定氮法英文名称：Kjeldahl determination定义：测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4凯氏定氮法反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4（其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法（英语：Kjeldahl method，全称凯耶达尔定氮法，简称凯氮法）是分析化学中一种常用的确定有机化合物中氮含量的检测方法。
这种方法是由凯耶达尔于在1883年发明。
凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。
要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变成无机氮，再进行测定。
一、原理：凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。
为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。
硫酸铜起催化剂的作用。
凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。
使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。
消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。
在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。
测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。
以蛋白质为例，反应式如下：消化：蛋白质+ H2SO4→（NH4）2SO4+ SO2↑+ CO2 ↑+ H2O蒸馏：（NH4）2SO4 + 2NaOH→ Na2SO4+ 2 H2O + 2NH3 ↑2NH3 + 4H3BO3→（NH4）2B4O7+ 5H2O滴定：（NH4）2B4O7+ 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4 H3BO3蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量[约在14％~18％，平均为16％（质量分数）]。
凯氏定氮法
2.4 注意事项
（1） 所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加
指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈 酸性。 （2） 若样品含脂肪或糖较多时，应注意 发生的大量泡沫 应加入少量辛醇或液体 石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外， 并注意适当控制热源强度。 （3） 若样品消化液不易澄清透明，可加 入300g/L2~3ml 过氧化氢后再加热。
消化反应方程式如下： 2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4 ＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2 COOH＋ ＋16H2O 浓硫酸具有脱水性: 浓硫酸具有脱水性:使有机物脱水后被炭化为碳、氢、 氮。 硫酸又具有氧化性: 硫酸又具有氧化性:将有机物炭化后的碳化为二氧化 碳，硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。 H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4
③ 滴定 滴定：取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标 准溶液滴定至微红色为终点。
(V1 − V0 ) × c × 0.014 × F (5) 结果计算： W = ×100% V2 m× 100
式中W—蛋白质的质量分数，%； V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL； V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL； C—盐酸标准液的浓度，mol/L； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数； m—样品质量，g。
② 蒸馏 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性， 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： 2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O OH＋
凯氏(Kjeldahl)定氮法
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。
1. 2 特点
凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
1. 原理
凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：
CH2COOH
| + 3H2SO4——2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
凯氏定氮法
凯氏定氮法
称取大米试样m克(0.65 g左右)（建议称取1.00-1.50g左右的样品），置于干燥的250mL 定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20mL浓硫酸，由GB/T5009.5-2003第一法，试样消化完全后（消化变绿之后继续消化半小时即可）移入100mL容量瓶中，并用蒸馏水定容，移取50 mL试样处理液加入定氮蒸馏装置中，加入50 mL氢氧化钠溶液(400 g/L)，以硼酸溶液(20 g/L) 50 mL作为吸收液，并加入3滴甲基红-亚甲基蓝指示液，蒸馏，用c (1/2H2SO4) =0.04526 mol/L硫酸标准滴定溶液滴定，同时进行空白试验，并在结果中加以校正。
计算公式：X=(V1-V2)×c×0.0140m×V50/V100×100(1)
其中：X—样品中蛋白质的含量(以氮计)，单位：g/100g；V1—试样消耗硫酸标准滴定溶液的体积，单位：mL；V2—试剂空白消耗硫酸标准滴定溶液的体积，单位：mL；c—硫酸标准滴定溶液的浓度，单位: mol/LV50—用50 mL移液管移取试样消化液的体积，单位: mL；V100—用100 mL容量瓶定容的试样消化液体积，单位：mL；m—样品的质量，单位：g0.0140~ 1.0 mL硫酸[c (1/2H2SO4) =1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位：g。
通过以上公式就能够准确的测定出大米中的蛋白质含量。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法是一种广泛用于土壤、水、肥料和动物组织中测定氮含量的方法。
该方法是由德国化学家凯斯于1883年首次提出的。
凯氏定氮法的原理是利用氮在含钾氢氧化物中的氧化反应。
将样品中的氮以铵离子（NH4 +）的形式存在，加入烧化的硫酸钾，硫酸钾中产生的氢氧根离子（OH-）将氨气与水反应生成氢氧化铵，并将硫酸钾还原成硫酸亚铁（Fe2+）。
然后向还原的溶液中滴加过量的高浓度二氧化钠，使溶液中的氢氧化铵被完全氧化成氮气（N2），同时钠离子（Na+）与氢氧根离子（OH-）中和生成水。
通过测定生成的氮气体积或气压，计算出原样中氮的含量。
凯氏定氮法的步骤如下：1. 取100g样品，加入含有15mL浓盐酸的锥形瓶中，用热板加热溶解。
2. 过滤后将滤液倒入蒸发皿中，置于水浴上加热，使溶液蒸干。
3. 将蒸干的样品装入蒸发皿，加入一定量的硫酸钾和硝酸，加热至燃烧，使硫酸钾氧化氨气和有机氮化合物，同时硝酸氧化硫酸钾。
4. 然后加入一定量的水，将溶液转移到滴定瓶中，用含NaOH的滴定液滴定溶液中的酸，使溶液呈中性。
5. 加入过量的NaOH，使氢氧化铵完全转化为氨气。
6. 用滴定管向滴定瓶中加入用水稀释过的二氧化钠，使溶液中氧化铵转化为氮气并与钠离子中和。
7. 通过测定生成的氮气体积或气压，计算出原样中氮的含量。
凯氏定氮法的优点是测定结果稳定可靠，精度高，操作简便快捷，适用于各种类型的样品。
但是，该方法存在着一些局限性，例如可能会受到含有硫酸盐或硝酸盐的干扰。
此外，由于该方法不能分离不同形式的氮，因此不能区分有机氮和无机氮。
总之，凯氏定氮法是一种简便快速、精度高的测定氮含量的方法，已广泛应用于农业、环境和生物学等领域。
凯氏定氮法
凯氏定氮实验一．实验背景柯达尔定氮法又称为凯氏定氮法。
凯氏定氮法是一种测总的有机氮的方法，可用于所有的动植物食品的分析，在国内外的应用都较为普遍，迄今被作为法定的标准检验方法。
测定的原理是：样品中的含氮有机化合物，经浓硫酸加热硝化，有机质被破坏，之中的C和H变成CO2和H2O逸出，而NH3则与H2SO4结合生成(NH4)2SO4或者NH4HSO4留在溶液中。
将溶液中的NH3碱化，游离，然后蒸出。
放出的NH3用硼酸吸收，以混合指示剂指示终点。
用H2SO4或HCL标准溶液滴定上述溶液，呈淡紫红色为终点，这样可计算出总氮量，进而计算出蛋白质的含量。
二．实验仪器和药品Hcl标准溶液、H3BO3饱和溶液、浓 H2SO4、40%NaOH溶液、 K2SO4（固体）CuSO4（固体）、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，未知样、煮解瓶。
烧瓶、升降台、锥形瓶、定氮装置三．实验步骤（1）煮解。
在煮解瓶总加入K2SO4-CuSO4(1:3)约15㎎，浓硫酸2ml：在加入未知样，在煮解瓶上加分液漏斗后在通风橱中加热煮解样品，等反应物变成淡蓝绿或几乎无色时，继续煮解30min，冷却后加入3ml蒸馏水，继续冷却。
（2）蒸馏。
在烧瓶中加入2/3的蒸馏水，沸石，2滴浓硫酸后加热。
等水沸腾后让水蒸气流遍整套装置5-10min。
用蒸馏水润洗仪器两遍。
（3）在锥形瓶中加入10ml饱和硼酸溶液，4滴混合指示剂。
在冷凝管中通冷水，末端浸入液面以下，自蒸馏瓶上端漏斗中加入煮解液，用蒸馏水淋洗煮解瓶两遍，并将煮解液全部移入蒸馏瓶中。
（4）自漏斗中加入10ml40%NaOH溶液，关闭漏斗，并用蒸馏水液封。
（5）收集约30ml蒸馏液时，测一样冷凝管末端的pH,如果是中性，则降低锥形瓶，转入下一步滴定。
（6）用0.0025mol/l 标准盐酸，用10ml微量滴定管滴定收集的蒸馏液。
终点时溶液由蓝色变为灰色。
（7）用完全相同的手续与试剂用量进行两次空白试验。
凯氏定氮法
（3）滴定过程
以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色为终点 若呈粉红色，表明已超越滴定终点，可在已滴定 耗用的标准盐酸溶液用量中减去0.02mL，每组样品 的定氮终点颜色必须完全一致。空白对照液接受瓶 内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以 不滴定。记录每次滴定耗用标准盐酸溶液毫升数， 供计算用。
（2）蒸馏，吸收过程
首先在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使 其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许 沸石以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入 反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封， 防止漏气。蒸气发生后，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸 气只能进入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由 反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置 一个锥形瓶接收冷凝水。 从定氮球发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移开煤气灯。 冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于 气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打 开废液排出口夹子放出废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下 换放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口完全浸 没在溶液中，蒸馏1～2min，观察锥形瓶内的溶液是否变色。如 不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去锥形瓶，再蒸馏1～ 2min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测 样品使用。
凯氏定氮装置图
1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管 10.蒸汽发生瓶
凯氏定氮法包括四个过程：
海能K9860全自动凯氏定氮仪
（1）消化、 （2）蒸馏、 （3）吸收、 （液晶显示屏 4、微型打印机
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1、消化
取两个凯氏烧瓶标号，一只加1.0ml蒸馏水作为空白对照，另一只加1.0ml样液。
各加硫酸钾和硫酸铜混合物约20mg、浓硫酸2ml。
烧瓶口插一漏斗（冷凝用），烧瓶置于电炉上加热。
开始时应注意火力，以免使瓶内液体冲至瓶颈。
待瓶内水气蒸完，硫酸开始分解生成SO2白烟时，适当加强火力，直至消化液透明并呈但旅色为止（约2~3h），用木夹取出，冷却，准备蒸馏。
2、蒸馏
取50~100ml锥形瓶3只，先按一般方法洗净，再用蒸汽洗涤数分钟，冷却。
用移液管各加入2%硼酸溶液5.0ml和指示剂4滴。
如瓶内液体呈葡萄紫色，可再加硼酸液5ml，盖好备用。
如锥形瓶内液体呈绿色，需用蒸汽重新洗涤。
1.安全管
2.导管
3.汽水分离管
4.样品入口
5.塞子
6.冷凝管
7.吸收瓶
8.隔热液套
9.反应管10.蒸汽发生瓶
微量凯氏蒸Array馏装置如图
所示，蒸汽
发生器内盛
放有滴加数
滴H2SO4
的蒸馏水和
数粒沸石。
加热后，产
生的蒸汽经
储液管、反
应室至冷凝
管，冷凝后
的液体流入
接受瓶。
每
次使用前，
需用蒸汽洗
涤10min左右（此时可用一小烧杯盛接冷凝的水）。
然后将一只盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶放置在冷凝管的下端，并使冷凝管之管口插入酸液面下，继续蒸馏1~2min，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净，否则需再洗。
移去酸液，蒸馏1min，用水冲洗冷凝管口吸去反应室残夜。
将消化好的消化液，由小漏斗加入反应室，用蒸馏水洗涤凯氏烧瓶2次（每次约2ml），洗涤液均经小漏斗加入反应室，再在冷凝管下置一盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶，并使冷凝管口插入酸液面下0.5cm处（10mL酸液置于50~100mL锥形瓶内，液体深度不大，可将锥形瓶斜放。
冷凝管口必须插在液面下，但也不宜太深，这样，万一发生倒吸现象时，硼酸液也不致被吸入反应室内）。
用小量筒取10~15mL30%的NaOH溶液，倒入小漏斗，放松弹簧夹，让NaOH溶液
缓缓流入反应室，当小漏斗内剩下少量NaOH溶液时，夹紧夹子，再加入约3mL蒸馏水于
小漏斗内，同样缓慢放入反应室，并留少量水在漏斗内做水封，即可蒸馏。
开始蒸馏后，即应注意硼酸溶液颜色变化。
当酸液由葡萄紫色变成绿色后，再蒸馏约3min，然后降低锥形瓶，使冷凝管口离开酸液面约1cm，再蒸馏1min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管口，移去锥形瓶，盖好，准备滴定。
3、定氮仪的洗涤
每次使用定氮仪后必须先把反应室内的残液洗去，洗净。
用电炉加热，就及时切断电源电炉余温仍较高，倒吸结果不好，为此在蒸汽发生器和储液管间加一个三通活塞，蒸馏时可使蒸汽发生器仅与储液管相通，蒸汽进入反应室。
需倒吸时，转动三通活塞使蒸汽外逸（进入大气），不进入储液管，此时由于储液管温度突然下降，即可将反应室残液吸至储液管。
4、滴定
用0.01mol/L的HCl溶液滴定锥形瓶中的硼酸液至浅葡萄紫色，记录所耗HCl溶液量。
仪器——
微量凯氏定氮仪，移液管，滴定管，烧杯，量筒，三角烧瓶，凯氏烧瓶，电炉，分析天平
试剂——
0.9%的NaCl溶液；
98%分析纯浓硫酸；
硫酸钾和硫酸铜的混合物。
硫酸钾和硫酸铜按3:1~4:1（m/m）混匀，研成粉末；
30%NaOH溶液。
30g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100mL；
2%硼酸溶液。
2g硼酸溶于蒸馏水，稀释至100mL；
混和指示剂。
0.1%甲基红酒精溶液和0.1%甲基蓝酒精溶液按4:1的比例（V/V）混合；
0.01mol/L标准盐酸溶液；
待测样液。
1g的螺旋藻粉溶于0.9%的NaCl溶液中，并稀释至100mL。
如有不容物，离心取上清液备用。