2015版中国药典无菌检验-中翎易
2015版中国药典无菌检查概述merck
2015版药典无菌检查概述默克生命科学2016/04/28中国药典与国外药典的差别ChP2010USP38EP8.0ChP2015检验条件总体10000级、局部100级应在无菌条件下进行应在无菌条件下进行应在无菌条件下进行（B级背景下的A 级单向流洁净区域或隔离器）人员具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训经培训和认可经培训和认可具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训培养基培养条件与时间硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃（20-25 ℃）改良马丁培养基23-28 ℃均培养14天接种后细菌培养2天、真菌培养3天硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃胰酪大豆胨液体培养基20-25 ℃均培养不少于14天接种后培养均不少于4天硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃胰酪大豆胨液体培养基20-25 ℃均培养不少于14天接种后培养均不少于7天硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃胰酪大豆胨液体培养基20-25 ℃均培养不少于14天接种后培养均不少于7天培养基灵敏度检查与方法验证用菌株CMCC ATCC ATCC CMCC检验方法只要性状允许，应采用薄膜过滤法只要性状允许，应采用薄膜过滤法只要性状允许，应采用薄膜过滤法只要性状允许，应采用薄膜过滤法稀释剂与冲洗液1、0.1%蛋白胨水溶液2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液3、其他经验证过的溶液A. 0.1%蛋白胨水溶液D. A+1ml吐温80K.动物组织消化液+牛肉浸膏+吐温801、0.1%蛋白胨水溶液2、0.1%蛋白胨水溶液+0.1%（聚乙氧基乙醇、0.1%吐温80）3、十四烷酸异丙酯1、0.1%蛋白胨水溶液2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液3、其他经验证过的溶液结果判断与复试一次检出结果为准（设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。
单倍量重试）2015版药典无菌检查法修订概况逐版发展提高的主要部分实验环境、设备的无菌保证；培养基品种及其适用性检查要求；检验数量、检验量的增加；检验方法和仪器发展；验证试验要求；培养时间保证受损微生物的生长；结果判断规定；取消复试、及重试的规定。
2015年版中国药典微生物限度检查法
2. 薄膜过滤法
– 除另有规定外，按计数方法适用性试验确认 的方法进行供试液制备。取相当于1g、1ml 或10 cm²供试品的供试液，若供试品所含的 菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照 方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液 中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌 面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡 萄糖琼脂培养基上培养。 – 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.1 总则：
• 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供
试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认
其有效性及对微生物无毒性。 • 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其
对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的
相容性。
1.2计数方法：
• 平皿法 • 薄膜过滤法 • 最可能数法（Most-Probable-Number Method， 简称MPN 法）。
沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培 养基，20～25℃，2～3 天 【10版：改良马丁（琼脂）培养基，23~28 ℃ ，24~48h】 沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂 培养基 ，20～25℃，5～7天 ，或直接获得 丰富孢子 【10版：改良马丁琼脂斜面培养基，23~28 ℃ ，5~7天】
中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典的差异分析与讨论_潘友文
中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典的差异分析与讨论潘友文（罗氏/基因泰克，美国南旧金山，94080）2016年07月29日摘要目的：分析中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的之间的差异性，为评价不同药典中无菌检查法的等效性提供参考。
方法：对无菌检查法的主要实验步骤和参数进行一对一比较，对有差异的步骤和参数进行科学论证和评价。
结果：中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的主要参数和步骤是一致的，但中国药典无菌检查法还需要做阳性对照和厌氧需氧菌的额外培养。
并且，中国药典用大肠埃希菌代替美、欧、日药典中的铜绿假单胞菌参与无菌检查法的适用性试验。
结论：各药典的无菌检查法是等效的。
在不影响方法等效性的前提下，中国药典2015版无菌检查法在阳性对照和培养方法上还可以进一步简化。
关键词:无菌检查法；中国药典；美国药典；欧洲药典；日本药典Gap Assessment and Discussion on Sterility Tests in Chinese Pharmacopoeia 2015, United States Pharmacopoeia, European Pharmacopoeia, and Japanese PharmacopoeiaYouwen Pan (Genentech, a Member of Roche, South San Francisco, USA 94080)Abstract Objective：Gap assessment and discussion on the sterility test methods in Chinese Pharmacopoeia 2015 edition (CP2015), United States Pharmacopoeia (USP), European Pharmacopoeia (EP), and Japanese Pharmacopoeia (JP). Method：The test procedures and key parameters in the sterility test methods in different pharmacopoeia were compared step by step and the differences were identified. The identified differences are scientifically evaluated for their impact to the equivalence of the methods. Result：The sterility test method in CP2015 is largely harmonized with that in USP, EP and JP except for a few differences. Positive control and extra incubation bacteria are required in CP2015 only, and Escherichia coli is used in method suitability test in CP2015 while Pseudomonas aeruginosa is used in USP/EP/JP. Conclusion：The Sterility Test Methods in CP2015, USP, EP, and JP are equivalent. The method in CP2015 could be simplified more without compromising the validity, accuracy and reliability of the method.Key words：sterility test；Chinese Pharmacopoeia 2015；United States Pharmacopoeia；European Pharmacopoeia； Japanese Pharmacopoeia无菌检查法是用于检查药典规定的无菌物品是否被微生物污染的检测方法。
2015版中国药典检验操作规程
• • •
2.7.2预培养（增菌培养）：
• 取供试液10mL（相当于1g样品），加在 定）中，30〜35℃培养24〜48小时。 ml增菌液体培养基（经方法适用性试验确
•
• •
耐胆盐革兰阴性菌 肠道菌增菌液体培养基
大肠埃希氏菌 沙门菌 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪大豆胨液体培养基
2.7.3选择和分离培养
（3）物品取出,
• 随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉、包装有明显的水浸者,不可作为无菌物 品使用。培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。 取出的物品掉落在地或误放不洁处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使 用。取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。凡属 合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。
•
有毒有菌污物处理要求
• 1.4.5污染的工作服或进行强致病菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒 袋内，经高压灭菌后方能洗涤。
•
• •
1.5培养基制备要求
1.5.1根据培养基配方的成分按量称取（可根据产品说明书用量和方法进行），然后溶 于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。 1.5.2因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太 多，以免影响培养基的质量。
1.3.2装放
• （1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
•
（2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不 能过挤。
1.3.3设备检查
• • • （1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。 （2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察 是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。 （3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于 进行灭菌处理的要求。
2015版中国药典无菌检查法课件
（二）、无菌检查的特点和意义 由于抽样概率的限制，通过无菌检查发现产品 微生物污染的可能性极低，而当前坚持无菌检查的 意义在于： 产品上市前发现重大污染事件的最后一道关口； 通过无菌检查的执行情况可以窥视其无菌控制存 在的问题。
三、无菌检查法的有关概念和新理念
(三)、无菌检查的新理念 1.全过程控制
（二）中国药典无菌检查法的发展 1953年版 1963年版
直接接种 法 直接接种法 无阳性对照菌 三种培养基培养基 阳性对照－金葡
1977年版 培养基质量检查－金 葡、 白念。 阳性对照－金葡
培养基质量检查－藤黄、 生孢、白念。 2支（瓶） 或以上 直接接种法 4管+2管+1管 薄膜过滤法 膜剪4片，2+1+1 1990版－金葡10－6
2015版《中国药典》 无菌检查法
主要内容
一、药品无菌检查所面临的形势 二、无菌检查法的发展历史 三、无菌检查法的有关概念和新理念 四、2015年版《中国药典》无菌检查法的重大修订 五、2015年版《中国药典》无菌检查法 六、医院制剂进行微生物控制的必要性
一.药品微生物检验所面临的形势
1.医药产品的发展 2.注射用药品的挑战 3.药品微生物污染的反思 4.2015版中国药典的修订
12Biblioteka 三、无菌检查法的有关概念和新理念
（一)、 无菌检查法的有关概念
5、无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止 各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施， 其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。 6、无菌检查法的局限性 若供试品符合无菌检查法的
规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。也 就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无菌性，但是它可 用于确定批产品不符合无菌要求。
无菌检测方法
四川乐至贵均卫生材料有限公司医疗器械产品无菌检测方法1.目的建立无菌检测标准规程，对灭菌后的医疗器械产品进行无菌检测，以确定灭菌的有效性。
2.范围本规程适用于本公司对医疗器械产品的无菌检测。
3.依据《中国药典》2015版4.设备、器皿、药品的准备4.1 设备的准备电子天平、干热灭菌箱、高压灭菌箱、洁净工作台、放大镜、移液枪、电热培养箱、霉菌培养箱、冰箱、斜口钳、接种环、酒精灯4.2 器皿的准备锥心瓶（500ml）、烧杯（1000ml）、试剂瓶（60ml）、量筒（50ml、1000ml）、培养皿（Ф90mm ×15mm）、斜口钳、玻璃棒。
4.3 药品的准备硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、纯化水、pH7.0 无菌氯化钠溶液。
5.器皿的清洗将所需的锥形瓶、烧杯、试剂瓶、培养皿、玻璃棒放入超声波清洗机中用纯化水清洗两次，每次15分钟，将清洗完的器皿在180℃条件下进行干热灭菌2小时。
6.取样按灭菌批次或者生产批次进行取样，随机抽取同一型号的产品4件作无菌检测样品7.培养基的制备7.1 硫乙醇酸盐流体培养基的制备取15g硫乙醇酸盐流体培养基和1000ml纯化水于烧杯中混合，加热至微沸（注意加热过程中要不断地搅拌，使其混合均匀）用棉花塞塞紧复用无尘布和绳子绑好后转移至高压灭菌锅内灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间30分钟。
灭菌后摇均，冷却至45℃待用。
7.2 胰酪大豆胨液体培养基的制备取15g胰酪大豆胨和1000ml纯化水于烧杯中混合，操作方法同6.1。
8. 培养基灵敏度检查8.1 菌种的要求培养基灵敏度检查所用的菌株（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）传代次数不得超过5代。
8.2 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30-35℃培养24小时；接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基上，20-25℃培养24小时。
将上述经24小时培养后的培养物用0.9﹪无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。
2015药典无菌、微限检验
方法适用性试验
• 当建立产品的无菌检查法时，应进行方 法适用性试验，以确认所采用的方法适合于 该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生 变化可能影响检验结果时，应重新进行方法 适用性试验。方法适用性试验按“供试品的 无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对 每一试验菌应逐一进行方法确认。
方法适用性试验
光学显微镜
过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）
环境及人员要求
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必 须达到无菌检验的要求，检验全过程应严格遵守 无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不 得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、 工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区 ）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现 行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按 相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符 合无菌检查的要求，日常检验还需对试验环境进 行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术的培训。
促生长试验：用于证明生长培养基能够支持微生物 生长的技术操作。 假阴性：实际阳性的无菌试验结果被变成了阴性。 假阳性：实际阴性的无菌试验结果被变成了阳性。 需氧菌：在代谢中，有氧条件下才能生存的微生物。 厌氧菌：在代谢中，没有氧的条件下才能生存的微生物。 无菌保证水平（SAL）:灭菌后产品上存在单个活微生物 的概率。“无菌医疗器械”表示为医疗器械中，有残存微生物的医疗器械的概率小于10 ，即一百万件中小于1件。
无菌检查法 试验前准备
硫乙醇酸盐流体培养基:主要用于厌氧菌的培养
，也可用于需氧菌培养。
无菌检查法 试验前准备
硫乙醇酸盐流体培养基:
在供试品接种前, 培 养基氧化层的高度不得超 过培养基深度的1/5，否则 ,须经100℃水浴加热至粉 红色消失（不超过20分钟 ）迅速冷却,只限加热一次 ，并应防止被污染。其装 量与容器高度的比例应符 合培养结束后培养基氧化 层（粉红色）不超过培养 基深度的 1/2。30℃ ~ 35℃培养14天。
2015版药典无菌检查法与微生物鉴定
• 无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各 类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施， 其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。
• 无菌检查法的局限性 由于无菌是一个相对的概念， 因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识－即产品 通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发现 有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的。反之， 当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物 污染风险相当高。
豆木瓜蛋白酶消化物
浸出粉…….…2.0g
白酶水解物
………………………………….3.0g 葡萄糖…………....20.0g 磷 „„„„„„„„„3.0g
氯 化 钠 …..…………….…….…5.0g 酸氢二钾………..1.0g
氯化钠 „„„„„„5.0g
磷 酸 氢 二 钾 …………………....2.5g 硫酸镁 一水葡萄糖……………….……2.5g (MgSO4.7H2O)….0.5g
Dextrose(葡萄糖)............................................5.0 g Sodium Chloride(氯化钠).....................................2.5 g L-Cystine( L-胱氨酸) .......................................0.5 g Sodium Thioglycollate (硫乙醇酸钠)..........................0.5 g Agar( 琼脂).................................................0.75 g Resazurin( 刃天青) .........................................1.0 mg Water（水）............................................. ...1000ml
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环境及人员要求
2015版中国药典四部 9203药品微生物实验室质量管理指导原则（P388）
从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的 教育背景。 实验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认他们可以承 担某一试验前，他们不能独立从事该项微生物试验。应保证所有人员 在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术等方面的 培训，如无菌操作、培养基制备、消毒、灭菌、注平板、菌落计数、 菌种的转种、传代和保藏、微生物检查方法及鉴定基本技术等。经考 核合格后方可上岗。 实验人员应经过实验室生物安全方面的培训，保证自身安全，防止 微生物在实验室内部污染。
无菌操作:是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或 无菌器械进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰 的一种常规操作方法。 培养条件：用于促进微生物发育、生长和繁殖的生 长培养基和培养方式的组合。 抑细菌/抑霉菌试验：用选定的微生物来演示某些物 质的存在能够抑制这些微生物的繁殖。 培养基: 是人工配制的生物营养物质，即用人工的 方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配成的一 种混合营养物。
恒温培养箱（至少2台）
医疗器械无菌检验所需设备
压力蒸汽灭菌器 压力蒸汽灭菌锅
医疗器械无菌检验所需设备电热干燥箱来自医疗器械无菌检验所需设备
集菌仪
医疗器械无菌检验所需设备
医疗器械无菌检验所需设备
红外电热灭菌器
医疗器械无菌检验所需设备
电子天平 精确度：0.01g
医疗器械无菌检验所需设备
光学显微镜
培养基：可按药典中的处方制备培养基，亦 可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基 。应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的 培养基应保存在2 ℃ ~ 25℃、避光的环境， 若保存于非密闭容器中，一般在3 周内使用； 若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）
环境及人员要求
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必 须达到无菌检验的要求，检验全过程应严格遵守 无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不 得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、 工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区 ）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现 行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按 相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符 合无菌检查的要求，日常检验还需对试验环境进 行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术的培训。
什么是无菌检查法？
用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗 器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法 。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在 该检验条件下未发现微生物污染。 无菌试验的目的：将供试品或其浸提液接种于培 养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染。
灭菌: 杀灭或除去特定环境或物品中一切微生物的过 程。目前国际上规定，灭菌过程必须使灭菌物品污染的微 生物存活率减少到10-6及以下。 微生物: 必须用光学显微镜或电子显微镜才能观察到 的微小生物。微生物具有一定的形态与结构,并能在适宜的 环境中迅速地生长和繁殖,如细菌、病毒、真菌等。 无菌：是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。 无菌技术:是指在微生物试验工作中，控制或防止各类 微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其 中包括无菌环境设施、无菌试验器材以及无菌操作。
环境及人员要求
2015版中国药典四部 9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 （P396） 9206无菌检查用隔离系统验证指导原则（P398）
无菌检查法 环境要求
无菌检查法 环境要求
隔离系统
无菌检查法 环境要求
无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。 TSA琼脂平皿 在30℃~ 35℃培 养48h证明无菌 取3只放无菌操作 台或超净工作台平 均位置打开上盖， 暴露30min后盖好 3只培养皿上 生长的菌落 数平均应不 超过1个
环境及人员要求
2015版中国药典四部 9203药品微生物实验室质量管理指导原则（P391） 微生物实验的各项工作应在专属的区域进行，以 降低交叉污染、假阳性结果和假阴性结果出现的 风险。无菌检查应在B 级背景下的A 级单向流洁 净区域或隔离系统中进行，微生物限度检查应在 不低于D级背景下的B 级单向流空气区域内进行。
促生长试验：用于证明生长培养基能够支持微生物 生长的技术操作。 假阴性：实际阳性的无菌试验结果被变成了阴性。 假阳性：实际阴性的无菌试验结果被变成了阳性。 需氧菌：在代谢中，有氧条件下才能生存的微生物。 厌氧菌：在代谢中，没有氧的条件下才能生存的微生物。 无菌保证水平（SAL）:灭菌后产品上存在单个活微生物 的概率。“无菌医疗器械”表示为医疗器械中，有残存微生物的医疗器械的概率小于10 ，即一百万件中小于1
2015版中国药典无菌检验
2015 《中国药典》无菌检查法修订说明 1. 无菌检查法收载于《中国药典》一、二、三部附录中， 一部和二部内容一致。 2. 2015版中国药典以2010 年版二部的“无菌检查法”为基 础,将一、二及三部内容整合，并进行了修订。保留了生物 制品无菌检查法的特点，如检验数量、硫乙醇酸盐培养基 接种份数和培养温度等。 3. 检验环境修订为“必须达到无菌检查的要求”。 4. 改良马丁培养基修订为“胰酪胨大豆液体培养基”。 5. 方法验证试验修订为方法适用性试验。 6. 由于培养基的改变，培养基的灵敏度和方法适用性试验 也进行了修订。 7. 修订了表1、表2、表3 的内容。
-6
件。
细菌：为单细胞微生物,其细胞分化不完善，无完 整细胞核及核膜、核仁，直径一般为1μm ~ 10μm。
真菌：为多细胞或单细胞微生物，其细胞分化完善， 有细胞核和各种细胞器，故易在体外生长繁殖，直径一般为 10μm ~ 100μm。
医疗器械无菌检验所需设备
超净工作台
医疗器械无菌检验所需设备
无菌试验过程中也应检查空气中的菌落数，方法要求同上
无菌检查法 试验前准备 器具灭菌：与供试液接 触的所有器具应采用可靠方 法灭菌，置压力蒸汽灭菌器 内121℃30min，或置电热干 燥箱内160℃2h。
无菌检查法 试验前准备
配制培养基所需器具:
无菌检查法 试验前准备
常用器具与稀释液:
无菌检查法 试验前准备