生物化学实验报告
一、实验目的：
1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项；
2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法；
3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；
4、掌握酶蛋白分离提纯的原理；
5、掌握酶的比活力测定及其计算方法；
6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法；
7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。
称量技术：
1、了解电子天平的用途
2、了解电子天平的工作原理
3、掌握电子天平的使用方法
4、掌握电子天平使用前后的注意事项
离心技术：
1、了解离心机的基本原理和用途
2、了解离心机的类型和用途
3、了解离心机的型号和控制版面
4、掌握离心机的使用方法
5、掌握离心机使用的注意事项
层析技术：
1、了解层析技术的基本原理
2、了解层析技术的分类情况
3、了解各种层析技术的原理
4、掌握凝胶层析技术
光谱分析技术：
1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理
2、了解仪器结构和分类
3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项
电泳技术：
1、了解电泳的基本原理
2、了解电泳的类型
3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理
4、掌握垂直板电泳的操作技术
5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术
6、了解转移电泳的基本原理和操作方法
7、了解双向电泳的基本原理和操作方法
二、实验原理：
1、蔗糖酶的提取：
①酵母菌的基本特征：
单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。
②生物材料破碎方法：
（1）机械（匀浆）法
①研钵
②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯
先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。
③高速组织捣碎机（0.5-1L）
将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
④高压匀质机（XL）
高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。
优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上
（2）超声波处理法
用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（3）反复冻融法
将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！
（4）化学处理法
有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。
（5）溶胞作用(酶溶解法)
用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。（6）自溶法
将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。
2、蔗糖酶的纯化：
①酶与蛋白质纯化过程的独有特点：
（1）特定的一种酶在细胞内的含量很少……纯化困难
（2）可以通过测定活力的办法加以跟踪……寻找关键
②酶的纯化方法：
1.酶的蛋白属性；
两性电离：
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
等电点(isoelectric point, pI)：
当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点。
大分子(胶体)：
分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。
稳定的因素：
颗粒表面电荷
水化膜
2.调节酶溶解度的方法；有机溶剂分级沉淀
（1）改变离子强度；盐析硫酸铵分级沉淀（反抽提法）
反抽提法（Back Extraction）
例：E.coli RNA聚合酶42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀
通常方法：先33%-------再50%
反抽提法：再42%
将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。蛋白从溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特异性。
（2）改变pH或温度；
改酶变在介未电纯常化数之；前PI也是未知的，pH不宜变化过大，以免失活。Cu,Zn-SOD的纯化可在70 oC，10 min。
（3）改变介电常数；
有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。
有机溶剂分级沉淀操作条件的控制：
溶剂选择：
常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。
温度：
使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。
样品浓度的控制：
一般认为蛋白质的初始浓度为0.5%-2% 为好。
3.根据酶分子大小、形状不同的分离方法；透析、凝胶层析
（1）离心分离；最为常用分布在细胞器匀浆后离心
（2）透析、超滤；
利用具有一定孔径的亲水膜，在常压下依靠小分子物质的扩散运动，将含有高分子和
其他小分子的溶液与纯水或缓冲溶液分隔的一种方法.用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐。用于去除大分子溶液中的溶剂，此称为浓缩。
（3）凝胶层析；
凝胶层析的定义：
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析
凝胶层析
常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。
凝胶层析的基本原理：
凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而
沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。
凝胶层析的应用范围：
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。
凝胶层析的特点：
凝胶层析操作简便，所需设备简单；
分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％；
分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响；
应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。
分离的分子量范围很宽，如Sephadex G类为102～105D；Sepharose类为105～108D。
4.根据酶分子电荷性质的分离方法；离子交换层析
离子交换层析
基本原理：
以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换分离的基本步骤---平衡-上样-吸附-洗脱-再生
如何选择离子交换介质：
对pI=5的某酸性蛋白质，
当蛋白质为阴离子时，在pH5.5-9.0 的范围内应选阴离子交换剂；
当蛋白质为阳离子时，在pH3.5-4.5 的范围内应首选阳离子交换剂
离子交换纤维素：
树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类；特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高；
离子交换纤维素的预处理：
适量水浸泡，漂洗，使之充分溶涨；数十倍的0.5mol/L氢氧化钠液反复浸泡0.5～1h，
每次换液皆须用水洗至近中性；按交换的需要用平衡离子处理；最后以交换用缓冲液平衡备用。
5.根据酶分子专一性结合的方法;
（1）亲和层析技术；Bioaffinity 生物亲和作用
a. 寻找可与蛋白专一性结合的配基（L）；
b. 将配基（L）通过共价键偶联到载体，并使L与P亲和力不变；
c. L与P吸附并与杂质分离，将杂质洗出；
d. 洗脱目标物，实现纯化。
（2）亲和超滤；
亲和——高度专一性
超滤——高处理能力
（3）金属亲和层析
利用金属离子的配合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。蛋白表面暴露的供电子氨基酸残基咪唑基、巯基、吲哚基。Cu 和Zn 可以很好的与咪唑基和巯基结合。
优点：
①蛋白质吸附容量大；
②价格便宜投资低；
③具有普遍适用性；
（4）拟生物亲和层析
利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附目的蛋白的亲和层析，尤以氨基酸（包括多肽）亲和层析为代表。
3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定：
①酶活力(enzyme activity)
酶催化某一反应的能力——V
V——单位时间内单位体积中底物(substrate) 的减少量或产物(product) 的增加量。
②条件：
1、催化反应总的反应式；
2、酶是否需要某种辅助因子(cofactors)；
3、酶最适时的pH和温度。
哺乳动物的酶，最适温度通常在25 —37℃。
1、测定酶活力时应注意几点
（1）应测反应初速度(initial velocity or initial speed)(如每分钟底物转换的μmol)
（2）酶速度(velocity)：酶催化反应的速率，酶速度通常记录为时间为0 时的值(符号V0 :μmol
／min)，以零时点为起点作一与曲线的线性部分相切的直线，这一直线的斜率即等于V0。
（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。
（4）测定酶反应速度时，应使[S]>>[E]。
[S]的选择原则：线性范围越宽越好，但不宜太大
2、酶活力和比活力表示方式
酶活力单位：
国际单位（IU）：在特定的条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量。
催量单位（kat）：在特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需的酶量。
1 IU= 16.67×10-9 kat
酶的比活力(specific activity，也称比活性）
比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示。
比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）
比活力有时也可用每g或每ml 酶含多少个活力单位来表示
活力(或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是酶纯度的量度，是每毫克酶的催化活力数(U/mg蛋白)。在酶的纯化过程中它的比活力逐渐升高，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定。
3、酶活力的测定方法
最方便的测定：测量产物出现的速率或底物的消失速率
1、底物(或产物)在特殊波长下吸收光
2、NADH 和NADPH
3、酶联测定法
没有适用于底物和产物的合适吸收波长，或者说“无色”
4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白浓度测定：
①紫外吸收法：
原理：大多数蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm 有吸收峰，可以进行蛋白质含量的测定。
计算公式：蛋白质含量(mg/ml)=1.55A280―0.76A260紫外吸收法
优点：样品不需要经过预先处理，即可直接进行测定。方法简单而快速，又不损害样品中的蛋白质，测定之后的样品仍可作他用。样品中有硫酸或其他盐类存在也不影响测定。在柱层析分离酶或蛋白质时，常为人们所采用。
缺点：核酸在280nm 也有吸收，干扰测定，但核酸的最大吸收峰在260nm。不
同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来误差。
②双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，至令仍广泛采用。
原理: Cu2+ 与蛋白质的肽键络合，形成紫红色络合物，此络合物在540nm波长处有最大吸收，是一种快速测定蛋白质的方法，但其灵敏度较低。
优点：是一种快速测定蛋白质的方法。
缺点：灵敏度较低。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris 缓冲液等。
③Folin-酚法(Lowry法)
这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一，由于方法简便，灵敏度高，常为实验室所采用，也是文献上用得最多的方法之一。
(A) 凡含有两个及两个以上肽键(-CO-NH-) 的化合物在碱性溶液中(如Folin-甲试剂) 都能与Cu2+ 作用，形成紫色的复合物；
(B) 所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应形成紫色的铜-蛋白质复合物；
(C) 铜-蛋白质复合物在pH=10 的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸(Folin-乙试剂) 还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅(在一定范围内)与蛋白质的含量成正比。
干扰物质与双缩脲法相同，而且受它们的影响更大。
④三种蛋白质测定方法比较
方法灵敏度原理干扰物质
紫外吸收法灵敏度较高50～100
μg，比色杯的最小测
量体积为0.1ml 蛋白质中的酪氨酸和
色氨酸残基在280nm
处的光吸收
各种嘌吟和嘧啶、
各种核苷酸
双缩脲法（Biuret法）灵敏度低
1～20mg 多肽键＋碱性Cu2＋
产生紫色络合物
硫酸铵、各种硫醇
Tris缓冲液、
Folin-酚法（Lowry法）灵敏度高
～5μg 双缩脲反应；磷钼酸
－磷钨酸试剂还原成
兰色的钼蓝和钨蓝混
合物
硫酸铵、Tris缓冲
液、各种硫醇、酚
类、柠檬酸
⑤蛋白含量测定的计算
样品的测定：取两支试管（平行）各加入样品液（稀成一定浓度的）1ml ，其他操作（反应和比色测定）同工作曲线的制作
蛋白含量测定的计算
稀释倍数数
溶液的数值对应的*ml Pro 10*(Pr))/(Pro 3
650-=ug A ml mg
5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响： ①正交试验设计 (Orthogonal experimental design)
是研究多因素多水平的一种设计方法，它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分析式因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。 全面试验法的优缺点：
缺点：(1) 试验次数太多，费时、费事，当因素水平比较多时，试验无法完成。 (2) 不做重复试验无法估计误差。 (3) 无法区分因素的主次。
优点：对各因素于试验指标之间的关系剖析得比较清楚 简单比较法的优缺点 优点：实验次数少 缺点：
(1) 试验点不具代表性。考察的因素水平仅局限于局部区域，不能全面地反映因素的全面情况。 (2) 无法分清因素的主次。
(3) 如果不进行重复试验，试验误差就估计不出来，因此无法确定最佳分析条件的精度。 (4) 无法利用数理统计方法对试验结果进行分析。 ②正交试验的提出：
考虑兼顾全面试验法和简单比较法的优点，利用根据数学原理制作好的规格化表－正交表来设计试验不失为一种上策。用正交表来安排试验及分析试验结果，这种方法叫做正交试验法。 ③正交试验法优点：
（1）试验点代表性强，试验次数少。 （2）不需做重复试验，就可以估计试验误差。 （3）可以分清因素的主次。
（4）可以使用数理统计的方法处理试验结果。 ④正交试验（表）法的特点： （1）均衡分散性─代表性。
（2）整齐可比性─可以用数理统计方法对试验结果进行处理。
⑤指标、因素和水平：
实验需要考虑的结果称为实验指标（简称指标）可以直接用数量表示的叫定量指标；不能用数量表示的叫定性指标。定性指标可以按评定结果打分或者评出等级，可以用数量表示，称为定性指标的定量化。
实验中要考虑的对实验指标可能有影响的变量简称为因素，用大写字母A、B、C…表示每个因素可能出的状态称为因素的水平（简称水平）
正交实验结果分析－极差分析法：
分析内容：
3个因素中，哪些因素对转化率影响大，哪些因素影响小；
如果某个因素对实验数据影响大，那么它的哪个水平对提高转化率有利。
6、蔗糖酶酶促反应动力学研究：
①酶促反应动力学(Kinetics of enzyme-catalyzed reaction )
酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学，是酶工程研究中的一个重要内容。
②影响酶促反应速度的因素
pH值
在一定的pH 下,酶具有最大的催化活性, 通常称此pH为最适pH。
①带电状态；
②酶的稳定性；
温度
温度升高，酶促反应速度加快。温度升高，酶的高级结构将发生变化，导致酶活性降低甚至丧失。大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下，反应速度最大。在适宜的温度范围内，温度每升高10℃，酶促反应速度可以相应提高1～2倍。
酶浓度
如果底物浓度足够大，足以使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。
底物浓度
低底物浓度：正比—一级；
所有的酶都与底物结合: Vmax,反应速度恒定—零级反应。在实际测定中：底物浓度足够高，再升高酶的浓度，反应速度未增加（抑制）。
原因：
①高浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子扩散性，降低了酶促反应速度；
② 过量的底物聚集在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而也会降低反应速度；
酶促反应动力学方程式——米氏学说：
]
S [K ]S [V V m max 0+=
[S]： 底物浓度Ｋm ： 米氏常数Vmax ：最大反应速度V ： 不同[S]时的反应速度 ③米氏常数（Km ）的意义：
Km 值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的浓度无关。
Km 值作为常数只是对一定的底物、一定的pH 、一定的温度条件而言，测定酶的Km 值可以作为鉴别酶的一种手段。
1/ Km 可以表示酶对底物亲和力的大小, 1/ Km 越大, 表明亲和力越大, 多底物酶有不同的 Km 值, 最适底物的Km 值最小。
当V=Vmax/2 时，米氏方程变换为：
]
S [K ]
S [V 2V m max
max += V = 1/2 Vmax, Km = [S]
米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。 米氏常数的单位为mol/L 。 Km 和 Vm 的测定： 双倒数作图法：
将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：
max
max 1
][1V 1V S V K m +
?= 以1/V 对1/[S]作图得一直线，其斜率是Km/Vm ，在纵轴上的截距为1/Vm,横轴上的截距为-1/Km 。
④抑制剂对酶活性的影响：
使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。 能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：
在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。 能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。
抑制剂的作用方式
不可逆抑制：抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。 可逆抑制：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。
根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性抑制和非竞争性抑制) 加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反应Vmax 不变。
加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，但由于Vmax 减小，所以酶促反应速度也下降了。
⑤激活剂对酶活性的影响
凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂，分为三种：
1、无机离子：金属离子、阴离子（氯离子、溴离子）和氢离子等。
2、中等大小的分子：谷胱甘肽、EDTA （乙二胺四乙酸）等。
3、具有蛋白质性质的大分子物质，如酶原的激活中起作用的酶。
⑥SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳Sodium Dodecyl Sulfate, Polyacrylamid Gel Electrophoresis, SDS-PAGE
电泳：是指带电粒子在电场的作用下，发生定向 泳动的现象。
-4
-2
2
4
6810
0.0
0.20.40.6
0.8
1.0
1/[S](1/mmol.L -1
)
1/v
电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。
蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子, 在电场下向自身电荷相反的方向移动。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：
聚丙烯酰胺凝胶 (polyacrylamide gel) 是由单体 (monomer) 丙烯酰胺(acrylamide ，简称Acr) 和交联剂 (crosslinker) N,N ’-甲叉双丙烯酰胺(N,N ’,methylenebisacrylamide ，简称Bis) 在催化剂过硫酸铵 (AP) 和加速剂 (TEMED) 作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (简称PAGE) 。 聚丙烯酰胺凝胶优点： 孔径可调节;
透明，有弹性，机械性能好; 化学性能稳定; 具有高分辨率和灵敏度; 重复性好; 凝胶杂质少; 连续系统电泳体系
缓冲液pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统电泳体系
由于缓冲液离子成分，pH ，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）： 1、还原剂的解聚作用
-4
-2
24
6810
0.00.2
0.40.6
0.8
1.0
1/[S](1/mmol.L -1
)
1/v
在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂— -巯基乙醇( - mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothretiol, DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一的单链亚基。
2、电荷效应
SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基，包裹蛋白形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质-SDS复合物，消除不同分子之间原有的电荷差异。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS: 1g 蛋白质。
蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状象一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小成正比。
在电场下，蛋白质-SDS复合物就会向正极移动，可以测定蛋白质的分子量。
3、浓缩效应
凝胶层的不连续性；浓缩胶：大孔胶；分离胶：小孔胶
缓冲液离子成分及pH的不连续性；
电位梯度的不连续性。
4、分子筛效应
当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH= 8.8，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度超过蛋白质－SDS 复合物，甘氨酸和Cl-的界面很快超过蛋白质－SDS复合物。
蛋白质－SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由聚丙烯酰胺的分子筛作用而被分离。
分子筛效应：是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而迁移率不同而被分离。
四、结果及讨论
1.DNS比色定糖法工作曲线的制作
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 浓度0 0.4 0.8 1.2 2 2.8 3.6 4 A540 0 0.046 0.139 0.192 0.374 0.546 0.705 0.770
2.folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作
试管号 1 2 3 4 5 6 7
mBSA 0 25 50 100 150 200 250
A650 0 0.075 0.169 0.292 0.418 0.584 0.724
3.E1.E2.E3酶活力及蛋白质浓度的测定
E1.E2.E3酶活力的测定
样品稀释倍数A540 葡萄糖含量/mg [E]/U/ml
E1 10 0.3282 2.9332 131.9400 20 0.1919 1.7945 161.5050 50 0.1354 1.3225 297.5625
E2
50 0.4211 3.7093 834.5925
100 0.1508 1.4511 652.9950
E3
5 1.6605 14.0635 316.4288 20 0.9880 8.4453 760.0770 50 0.2688 2.4369 548.3025
数据处理
1）[E] = 葡萄糖mg数×（4.5/0.5）×E的的稀释倍数/2ml=（）U/ml 2）总活力：[E]×V
3）[Pr]：查标准曲线
4）总Pr量：[Pr]×V
5）比活力：[E]/[Pr] or 总活力/总Pr量
6）阶段收率：E2活力/E1活力、E3活力/E2活力
7）总收率：E3总活力/E1总活力
8）提纯倍数：比活力n/比活力n-1，n=1，2，3
蔗糖酶酶样品
样
品
体
积
（m
l）
酶浓度
（u/ml）
总活力
（u）
蛋白浓
度
（mg/m
l）
总蛋
白量
（mg
）
比活力
（u/mg）
提纯倍
数
阶段收
率（%）
总收率
（%）
E1 67 87.9750 5894.3250 19.015 1274 4.627
E2 15 445.8375 6687.5625 0.500 7.5 59.445 12.847 5.068
E3 10 328.7250 3287.2500 0.094 0.94 349.707 5.883 0.737 55.77%
E1.E2.E3蛋白质浓度的测定
样品 稀释倍数 A650 Pro(mg/ml) ×10-4
A650
A650值对应的μg
数(Pr)
Pr(mg/ml)
E 1 100 0.5419 191.0714 19.107 200 0.2903 101.2143 20.243 E 2 20 0.0656 20.9643 0.419 50 0.041 12.1786 0.609 E 3
1
0.2804
97.6786
0.977
4.蔗糖酶米氏常数的测定
反应物
活力测定 数据处理 管号 0.1m ol/L 蔗糖液 pH4.6 buff er 酶液 （ml ） 1mo l/L NaO H(m l) 吸取
反应
物
(ml)
DNS
试剂 (ml ) 水
(ml
)
A540 底物浓度(S)
1/S 1/A
0 0 2 2 0.5 0.5 3 1.5 0 0 1
0.4 1.6 2 0.5 0.5 3 1.5 0.173 0.01 100 5.78 2 0.5 1.5 2 0.5 0.5 3 1.5 0.281 0.0125 80 3.56 3 0.6 1.4 2 0.5 0.5 3 1.5 0.320 0.015 66.7 3.12 4 0.8 1.2 2 0.5 0.5 3 1.5 0.382 0.02 50 2.62 5 1 1 2 0.5 0.5 3 1.5 0.449 0.025 40 2.23 6 1.5 0.5 2 0.5 0.5 3 1.5 0.606 0.0375 26.7 1.65 7
2
2
0.5
0.5
3
1.5
0.706
0.05
20 1.42
与X 轴交点为-4.818，即-1/Km=-4.818,故：Km=0.2076 斜率为0.2358，即1/Vmax=0.2358，故：Vmax=4.241
Kcat=Vm/酶的mol 浓度=4.241x0.2076=0.8804 5.正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响 列号 1 2 3 实验结果Yi ：A540 试管号 A:温度℃ B:pH C:浓度 1 40 2.6 0.05 0.877 2 40 4.6 0.1 1.064 3 40 6.6 0.15 0.849 4 50 2.6 0.1 0.674 5 50 4.6 0.15 0.698 6 50 6.6 0.05 0.671 7 60 2.6 0.15 0.017 8 60 4.6 0.05 1.229 9 60 6.6 0.1 0.016
K1 2.790 1.568 2.777 6.095 K2 2.043 2.991 1.754 K3 1.262 1.536 1.564 k1 0.930 0.523 0.926 k2 0.681 0.997 0.585 k3 0.421 0.512 0.521 R 0.509
0.485
0.405
A 因素列
B 因素列
C 因素列
K1 y 1+ y 2+ y 3 =2.790 y 1+ y ４+ y ７ =1.568 y 1+ y ６+ y ８ =2.777 K2 y ４+ y ５+ y ６ =2.043 y ２+ y ５+ y ８ =2.991 y ２+ y ４+ y ９ =1.754 K3 y ７+ y ８+ y ９ =1.262 y ３+ y ６+ y ９ =1.536 y ３+ y ５+ y ７ =1.564
k1 K1 ／３=0.930 K1 ／３ =0.523 K1 ／３=0.926 k2 K2 ／３=0.681 K2 ／３=0.997 K2 ／３=0.585 k3 K3 ／３=0.421 K3 ／３=0.512 K3 ／３=0.521 R kmax.-kmin.=0.509 kmax.-kmin.=0.485 kmax.-kmin.=0.405 T=∑Yi= y 1+ y 2+ y 3+ y ４+ y ５+ y ６+ y ７+ y ８+ y ９ =6.095
由以上数据，R A =0.509 R B =0.485 R C =0.405，影响大，则该因素的不同水平对应的平均转化率之间差异大，因素对实验结果的影响就大，故：因素的主次排序为：A 温度>B PH>C 浓度。
由K1、K2、K3、k1、k2、k3 的值，指标越大越好，应该选取最大的水平，从表可知，本实验应该选取每个因素中k1、k2、k3最大的值，即：最佳实验条件为：40℃、PH=4.6、浓度为0.05mol/L 。
由上述数据k值分析，对蔗糖酶活性影响由大到小依次是温度、PH值和浓度，由R A为0.509、R B为0.485、R C为0.405可知，相较缓冲液浓度来说，温度和PH值对酶活力影响更大一些，在本实验中蔗糖酶在PH4.6而稍偏酸性条件下活力更强一些，由表中图像可直观看到各因素对酶活性的影响，并由图可读出，在温度40℃、PH=4.5、浓度为0.05mol/L左右时条件最适。
五、现象分析
1、在酶制备过程中离心后取出离心管后分三层
当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。产生下层透明，中间为蛋白层，上层为有机层。
2、加入Folin-乙试剂后溶液呈蓝色。
凡含有两个及两个以上肽键(-CO-NH-) 的化合物在碱性溶液中(如Folin-甲试剂) 都能与Cu2+ 作用，形成紫色的复合物；所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应形成紫色的铜-蛋白质复合物；铜-蛋白质复合物在pH=10 的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸(Folin-乙试剂) 还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅(在一定范围内)与蛋白质的含量成正比。
3、加入3,5-二硝基水杨酸后，血糖管中的液体呈黄色（3,5-二硝基水杨酸的颜色），在沸水中加热后，血糖管内液体颜色呈棕红色。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系。
4、收集E3时走柱记录纸和现象及其解释
收集E3时记录纸上出现尖峰，上升至17又下降，收集示数为7-17、17-13的收集液共10ml。
紫外检测仪工作原理的依据是光吸收定律。从光源发出的光经狭缝、滤光片、样品池到光电培增管上，使束由于样品浓度不同所引起光强的变化转换成光电流的变化，此光电流经放大器输入到对数转换器，使透光率T转成A输出，即A=1g —=εCL式中ε为待测样品的克分子消光系统，C 为样品浓度，采用克分子/升单位，L为光程，用厘米作单位。根据上式就知测出了A，就知样品浓度C。若从放大器直接输入记录仪，绘出的是样品透光率T变化的图谱，若从对数转换器输入到记录仪绘出的是样品光密度A变化的图谱。故，尖峰处的酶活力最大。
生物化学实验报告 2011
孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料小麦面粉(1000 g) 2．主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20 mL×11 （2）滤纸（3）烧杯：100 mL×2 （4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2； 10 mL×1 （7）恒温水浴锅（8）煤气炉（9）漏斗（10）天平（11）分光光度计 3．试剂 （1）1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL 容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。 （4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。 （5）6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分别取59.19 mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步骤 1. 制作葡萄糖标准曲线 批阅教师：年月日
生物化学实验报告
一、实验目的： 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项； 2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法； 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术： 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术： 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术： 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术： 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术： 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型
3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理： 1、蔗糖酶的提取： ①酵母菌的基本特征： 单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法： （1）机械（匀浆）法 ①研钵 ②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。 ③高速组织捣碎机（0.5-1L） 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④高压匀质机（XL） 高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。 优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 （2）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（3）反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！ （4）化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。
生物化学实验报告册
生物化学实验报告册 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入
水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。 实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。 实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。 1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2．实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料、③实验步骤要求在实验课前预习后撰写，作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 3．每项内容的基本要求 实验原理：简明扼要地写出实验的原理，涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 实验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪
浙江大学生物化学丙实验报告1
实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 蔗糖酶的提取 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法； 2、巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 1、实验内容： 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理： ①酵母细胞破碎 细胞破碎的常用方法 液体剪切法固体剪切法压力和研磨 物理法、化学渗透法、酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 ②蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯 操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。 三、实验材料与试剂
1、实验材料 市售干酵母粉10g/组(3～4人） 2、实验试剂 石英砂，95%乙醇(-20℃），20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平（称量干酵母粉）；研砵（每组一套）；50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）；高速冷冻离心机；恒温水浴箱（50℃）；量筒（50ml）、微量移液枪（1000ul)及枪头或移液管（1ml)、玻棒、滴管等;1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架；制冰机；－20℃冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹（干磨法） ①称量：称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨(干磨)：至尽可能成细粉末状（约15min） ③加液+研磨：量取总体积40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加研磨10min， 使呈糊状液体； ④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后(托盘天平上)，离心10min （条件：4℃、12000r/min） ⑤收集+测量：收集上清液并量出体积V1（样品I），另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理：将上步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴，保温30min， 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min。 （条件：4℃，12000r/min） ④收集+测量：收集上清液并量出体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀 ①冰浴：将热处理后的上清液加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，
生化实验报告模版
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
高级生物化学与分子生物学综合实验报告优选资料p
5. 按表1中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。注意一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应快速操作。 6. 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净梳子。 7. 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1：1体积比加入样品处理液，在100℃加热5min以使蛋白质变性。 8. 浓缩胶聚合完全后（30-60 min），小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 二、上样电泳 1. 按预定顺序加样，加样量通常为10～25μL。 电泳检测样品至少包括：蛋白Marker、上样液（原液）、上样后的穿透液、10mM 咪唑冲洗液、50mM咪唑冲洗液、100mM咪唑冲洗液、250mM咪唑冲洗液。 2. 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/ cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/ cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm，然后关闭电源。 3. 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 三、用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色 染色时间：现温度下不少于2h。 脱色需3～10小时，期间应多次更换脱色液直至背景清楚。为了永久性记录，应尽快对凝胶进行拍照。 四、实验结果与讨论 1、质粒的提取、酶切电泳图谱 1 2 M 图1-1 第四组电泳图谱图1-2 第三组电泳图谱 1：酶切后的质粒2：质粒M ：Marker 1、2：质粒4、5：酶切后质粒 观察结果：通过对比第三组和第四组电泳图谱，可以发现酶切后的质粒条带在原质粒条带的前面，并且质粒泳道条带比较多；电泳条带模糊，呈凹凸形状，拖尾现象比较严重，不能很明显地观察结果。 原因分析：
生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法
生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定— —凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗
入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求得；Vi可g×Wr求得。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。
生物化学实验六——酵母RNA的提取与含量测定 山东大学实验报告
实验六——酵母RNA的提取与含量测定 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-10 同组者：张奕 一、实验目的 1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用。 3.了解和掌握紫外吸收法测定RNA浓度的原理。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在260nm 左右，且一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比（浓度为5μg/ml—45μg/ml吸光度与浓度成正比），利用此性质，可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线(标准曲线的斜率为0.022-0.024左右)，测定样品RNA浓度。由于蛋白质在280nm的光吸收，对核酸测定有一定的干扰作用，最大吸收峰在280nm处，原因是蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白质的干扰必须得先测260nm处的吸光度，再测280nm处的吸光度，通过计算消除其对核酸的影响。 三、实验器材 干酵母粉 电子天平 量筒 容量瓶100ml 磁力搅拌器 试管 100℃水浴锅pH试纸（pH1-14）烧杯 离心机 722型分光光度计锥形瓶 离心管 四、实验试剂 0.2%氢氧化钠溶液95%乙醇 无水乙醚酸性乙醇（5ml浓Hcl加入到500ml95%乙醇中混匀）RNA标准蛋白溶液（200μg/ml）
1.RNA的提取 （1）称取4g干酵母粉，放入200ml锥形瓶中，加入40ml0.2%的氢氧化钠溶液混匀，在沸水浴中煮沸30min中并冷却； （2）冷却后，把液体倒入离心管中，在4000r/min的条件下离心15min； （3）离心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml，边加边搅拌，静置5min左右，再4000r/min的条件下离心5min； （4）离心后保留沉淀，用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后在3000r/min的条件下离心5min； （5）离心后的沉淀再用无水乙醇10ml洗涤两次，每次用3000r/min离心5min； （6）离心结束后，收集沉淀与滤纸上，称重备用。 2.RNA样液的配制 （1）取粗RNA0.2-0.25g与烧杯中，加入5mlNaOH溶液，搅拌，溶解，调成糊状。 （2）再加入蒸馏水40ml，搅拌混匀，调PH至7.0后，放入100ml容量瓶中定容。 （3）再分3-4次分别取2ml定容后溶液于100ml容量瓶中继续定容待测,并且把容量瓶依次编号为A、B、C。 3.RNA标准曲线的绘制 （1）取洁净的试管，依次标号为1-10、A、B、C后，按照下表分别往各试管中加所需液体，并用磁力搅拌器混匀。 （2）混匀后以0号试管为参比液，在260nm下测各试管的吸光度A，并根据0-9试管的吸光值绘制出RNA标准曲线，并最终得出样品的浓度。 六、注意事项 1.离心机的使用，使用前一定要将两离心液（包括外壳）在天平上调平，对称放置在离 心机上，防止力臂不对称而损坏离心机。 2.紫外分光光度计的使用，要先预热10分钟，往比色皿中到液体只需到三分之二即可， 防止液体溢出腐蚀仪器，爱护仪器。
生化大实验实验报告
生化大实验 实验报告 姓名： 学号： 专业： 班级： 实验班级： 单位： 指导老师：
实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取 一、实验原理： 多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。 植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。 二、实验目的： 通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。 三、材料与试剂： 1.材料：马铃薯（两小组共称200g） 2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2） 3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机； 四、操作步骤： 1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min； 2.用两层纱布将所得的浆液过滤； 3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min； 4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min； 5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min； 6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。 五、结果和分析： 实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。 六、讨论与结论： 1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化； 2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净；
大学生物化学实验
生物化学实验安排 实验一蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、实验原理 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 3.苯环的黄色反应 Tyr + 浓硝酸黄色 Trp Phe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色 4. 乙醛酸的反应： 检测Trp或含Trp蛋白质的反应。当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时，产生分层现象，界面出现紫色环。主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。 5. 偶氮反应
偶氮化合物都含有-N=N-这样结构，通常作为染料。 6. 醋酸铅反应 ()↓ --→+--+Pb COO NH Pb COOH N H 2222Pr Pr 三、实验步骤 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清：水= 1：9）约1ml 和10%NaOH 约2ml ，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。观察现象，记录。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) （1）取2支试管分别加入蛋白质溶液（蛋清：水= 1：9）和甘氨酸溶液1ml ，再各加0.5ml0.1%茚三酮，混匀，沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。 （2）在一块小滤纸上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液，风干后再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察是否有紫红色斑点的出现。 3. 苯环的黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。鸡蛋清溶液（蛋清：水= 1：9） 4. 乙醛酸的反应： 向3个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。蛋白质溶液（蛋清：水= 1：20）
生物化学实验报告
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验报告
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
生化实验报告资料
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
浙江大学生物化学丙实验报告.
. 实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 质粒DNA 的微量制备及电泳检测 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握质粒DNA 的提取原理和方法； 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作； 3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。 二、实验内容和原理 1、实验内容 ①质粒DNA 的提取 ②DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 2、实验原理 ①质粒： 质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA 分子，大小在1-200kb 之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA 编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。 ②从细菌细胞中抽提质粒DNA 的步骤： a 细菌培养使质粒大量扩增； b 收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ； c 进一步除去蛋白、脂类、RNA 等杂质，分离和纯化质粒DNA 。 ③碱裂解法来分离纯化质粒DNA ： 在EDTA 存在下，经过SDS 处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH ）， 使核质体DNA 与质粒DNA 的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA 与质粒DNA 又存在复性的差异，质粒DNA 很快得以复性，而细菌核质体DNA 分子难以复性，核质体DNA 会缠绕附着在细胞膜碎片上专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡 学号： 3130100246 日期： 2015.6.9 地点： 生物实验中心310 装 订 线
浙江大学生物化学丙实验报告1
专业：农业资源与环境 姓名：李佳怡 ____________ 学号：_J6 _______________ 日期： __________________ 地点：生物实验中心310课程名称：生物化学实验（丙） 实验名称：蔗糖酶的提取 一、实验目的和要求（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 七、实验结果与分析（必填） .指导老师：方祥年 成绩:_ _同组学生姓名：金宇尊、鲍其琛 二、实验内容和原理（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 六、实验数据记录和处理 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法; 2、 巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 订 1、实验内容: 线 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理: ① 酵母细胞破碎 液体剪切法―超声波法.机械搅拌法.高压匀浆法 固体剪切法一压力和研磨 非机械法——> 物理法.化学渗透法.酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取岀 来。 ② 蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集 样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯 操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。 实验报告 细 胞 破碎 的 常 用 方 法
三、实验材料与试剂 1、实验材料 市售干酵母粉10g/组（3?4人） 2、实验试剂 石英砂，95%乙醇（-20*0,20mmol/L Tris-HCl 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平（称量干酵母粉）：研碎（每组一套）：50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）：高速冷冻离心机：恒温水浴箱（50°C）；量筒（50ml）、微量移液枪（lOOOu 1）及枪头或移液管（1ml）、玻棒、滴管等;离心管（留样品I、II用）及离心管架：制冰机：一20°C冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹（干磨法） ①称量：称取市售干酵母粉10計约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨（干磨）：至尽可能成细粉末状（约15min） ③加液+研磨：呈:取总体积40 ml的20mmol几Tris-HCl缓冲液，分2次加研磨lOmin, 使呈糊状液体； ④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后（托盘天平上），离心lOmin （条件:4°C、12000r/min） ⑤收集+测量：收集上淸液并量出体积VI （样品I）,另留1ml上淸液（样品I ）放置一20°C冰箱保存 用于蔗糖酶蛋白含量测眾、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理：将上步抽提液（样品I）,迅速放入50°C恒温水浴，保温30min, 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min a （条件：4°C, 12000r/min） ④收集+测量：收集上淸液并量出体积V2 （样品II）,另留1ml上淸液（样品II ）放宜一20°C冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测左、测左蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀 ①冰浴：将热处理后的上淸液加入相同体枳的一20°C的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，
浙江大学生物化学丙实验报告
. 实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验内容和原理 （1）实验原理 1、离子交换层析： 以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 基质 基质 — ＋ — ＋ 可逆交换 可逆交换 溶液中的离子 （交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖) 阳离 阴离子交
由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测） 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），能催化非还原性双糖（蔗糖）裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。 本实验采用 3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热（100℃）被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 （2）实验内容 1、离子层析分离纯化实验1中粗分离纯化的蔗糖酶样品Ⅲ； 2、定性检测判断所提取的蔗糖酶纯化样品多少。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、实验试剂 ① DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)； ②20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；
浙江大学生物化学丙实验报告3、4
实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法 ①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； ②掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量； ③掌握分光光度计的使用方法。 2、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法 ①掌握酶活力测定的基本原理和方法； ②学习酶的比活力的计算。 二、实验内容和原理 1、Folin-酚测定法 Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm 波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L 。 优点： 简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。 缺点： 该反应受多种因素的干扰。 2、蔗糖酶活力测定 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol 蔗糖，就能生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉试剂比色法，斐林试剂法等。 专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡 学号： 3130100246 日期： 2015.5. 26 地点： 生物实验中心310 装 订 线
细菌的生理生化反应实验报告
细菌的生理生化反应实验报告 【实验目的】 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。了解生理生化反应在鉴别细菌中的意义。 【实验原理】 通过测定微生物校内某些酶类的有无、对某些第五的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物带血的多样性。某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚， 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛发生反应，形成红色的玫瑰吲哚，为吲哚反应阳性。微生物发酵葡萄糖成丙酮酸，2分子丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下与 肌酸类物质反应，生成红色化合物为.反应阳性。有些细菌发酵糖类产生有机酸较多，使发 酵液的pH下降到以下，当加入甲基红试剂后，时发酵液变红色，为甲基红反应阳性。某种 微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。 【实验材料和用具】 1.菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌。 2.培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗 糖）、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂 3.仪器：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液枪、滴管、 杜氏小管。 【实验方法】 （一）V-P反应 1.试管标记取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录去除以上培养物，分别取出2ml培养液加入另外5支相应编号的空试管中，加入与培养液等量的V-P试剂，充分震荡2min。放置37度恒温培养箱中培养30min观察记录结果。 （二）甲基红实验 于V-P实验留下的培养液中，分别加入2-3滴甲基红指示剂，立即观察培养液的颜色变化（三）吲哚实验 1.试管标记取5只装有蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变 形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录在培养基中加入乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙 醚层浮于培养液的上面，此时沿试管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂。观察记录结果 （四）糖发酵试验 1.试管标记取分别装有葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵培养液试管各4支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录 【实验结果与分析】 （一）V-P 大肠产气枯草变形对照 结果—+———