原位杂交组织化学
原位杂交
原位杂交原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry,ISHH) 简称原位杂交(InSitu Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定：目的是(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
原位杂交技术(in situ hybridization)
原位杂交的基本原理原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。
RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。
该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。
其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。
RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。
尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。
原位杂交技术（in situ hybridization）是以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。
这一技术不需要从组织细胞中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的结构完整，反映特异核酸分子的定位。
特别是配合使用能定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，就能对生理或病理条件下从DNA 到mRNA到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是基因表达研究强有力的手段。
（一）原位杂交技术的原理原位杂交技术的原理是：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
原位杂交组织化学技术的基本方法
原位杂交组织化学技术的基本方法一、核酸分子杂交技术1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。
自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。
按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。
固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybri dization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ N orthern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。
液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。
二、原位杂交组织化学技术的由来及发展原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。
但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。
菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。
Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。
它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。
1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。
原位杂交
原位杂交核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项技术。
它以带标记物的核酸作为探针，在一定条件下，在组织细胞原位与待测核酸序列（如DNA，RNA）进行杂交形成杂交体，然后通过与标记物相应的检测系统，从而在原位对组织细胞中待测的核酸序列进行定性、定位和相对定量的研究。
分子生物学技术中的杂交液相杂交: 参加反应的二条核酸都游离在溶液中固相杂交: 将一条核酸链固定(点样或吸印转移)到固体的支持物上, 再与溶液中的核酸探针杂交菌落原位杂交Colony in situ hybridization斑点杂交Dot blotSouthern 印迹杂交Northern 印迹杂交原位杂交又称原位杂交组织化学依照细胞化学的原则, 在保持组织、细胞或染色体结构的条件下，在原位检测特异的核酸分子原位杂交原理变性(denaturation)---双螺旋DNA分子在某些因素作用下, 双链间的氢键解开或断裂, 解离成二条单链的过程复性(renaturation)---变性的二条DNA单链在合适的条件下, 又可按原来碱基互补配对, 再结合在一起形成双螺旋结构退火杂交(hybridization)---不同来源但具有同源性的二条DNA或RNA单链, 按碱基配对原则结合在一起⏹探针(probe)---一段已知序列的DNA、RNA或寡核苷酸片段靶核酸分子---所要检测的核酸分子或核苷酸序列，可以是DNA或RNA原位杂交基本原理利用标记的核酸探针与组织细胞中的待测核酸进行杂交，然后用放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行检测，从而在组织细胞原位显示某种特定基因、或mRNA分【原位杂交优点】既有分子杂交技术特异性强、灵敏度高的特点，又具有组织细胞化学染色的可见性既可用新鲜组织做，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究所用标本量少，可用活体穿刺和细胞涂片标本应用范围广探针及其制备探针的长度：以选择50～300bp最为适宜（一）探针的种类与制备➢根据标记方法不同，分为放射性探针和非放射性探针➢原位杂交的探针分子：cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针cDNA探针（complementary DNA）双链cDNA探针是最常用的核酸探针通常容易得到的cDNA探针是克隆于质粒载体中的特异cDNA分子用生物工程技术获取特异的cDNA片段从mRNA逆转录生成cDNA→构建cDNA文库→筛选和克隆特异cDNA分子特异cDNA分子与载体（质粒）DNA在体外重组•质粒转化•质粒扩增•质粒抽提、酶切、纯化→得到特异的cDNA探针【优点】1. cDNA探针不含内含子序列, 特别适用于基因表达的研究2. DNA探针一般较RNA探针敏感3. 克隆于质粒载体中, 使用方便, 不需再次克隆4. 多种标记方法, 可靠易行5. 杂交适宜温度范围较宽, 较稳定, 不易降解【缺点】1. 要用凝胶电泳移除载体序列2. 探针需变性3. 杂交反应中可能存在自身复性RNA探针---体外转录技术制得一类新型的载体: 噬菌体pSP和pGEM这类载体在多克隆位点的二侧分别带有SP6启动子和T7启动子, 在SP6 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶作用下, 可以进行RNA转录将外源特异cDNA片段插入多克隆位点接头处→DNA重组体→转化细菌→质粒扩增→质粒抽提→体外转录合成RNA探针【优点】单链分子, 在组织内通透性好, 杂交效率比DNA探针高RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定通过改变外源DNA插入方向, 或选用不同的RNA聚合酶, 可转录出正义RNA链和反义RNA链反义RNA链---又称cRNA链, 用作杂交的探针正义RNA链---用于杂交的阴性对照杂交体所需解链温度高, 能耐受杂交过程中的较高温度及杂交后的洗涤【缺点】1. 容易受RNA酶污染2. 制备过程复杂3. 杂交适宜的温度范围较宽寡核苷酸探针根据靶核酸序列而设计, 在DNA合成仪上用化学方法合成的短链探针【优点】1.10~50bp, 在组织内通透性好2. 单链DNA寡核苷酸, 杂交时无需变性, 无自身杂交3. 一次合成, 可使用多时, 价格低廉4. 对RNase不敏感, 比RNA探针更稳定, 便于操作【缺点】1.与mRNA形成的杂交体不如RNA-RNA稳定2. 探针较短, 所携带的标记物较少, 特异性、敏感性都低3.标记方法受限制, 只能采用末端标记法探针的标记1. 标记物理想的标记物应具备的条件:标记后探针的分子结构尽可能与原来的分子结构相同标记后探针的检测方法要简便, 准确, 可靠, 重复性好安全无害目前常用标记物有同位素和非同位素二大类⏹同位素标记探针: 35S, 32P, 33P 和3H非同位素标记探针⏹生物素:生物素广泛的存在于动物体内内源性生物素对杂交信号的干扰地高辛:半抗原, 从洋地黄植物的花和叶中提取杂交信/噪比高, 敏感性高非同位素标记物中的最佳选择2.标记方法⏹(1) 双链cDNA探针的标记随机引物法(random primed DNA labelling)⏹(2) RNA探针标记---在体外转录技术中与探针制备同时完成(3) 寡核苷酸探针标记---主要是末端标记法(end-labelling )标记探针的纯化与检验纯化: 将标记反应中未被结合的,即游离的标记dNTP,与掺入cDNA或cRNA的标记核苷酸分开,并将游离的部分去除纯化的方法:普通凝胶柱层析, 离心凝胶层析, 乙醇沉淀法检验:斑点印迹法，液闪法原位杂交方法(一) 探针及其标记(二) 组织样品制备1.去除或抑制RNA酶物理方法: 1. 对耐高温的实验器具高温烘烤180℃3小时以上2. 实验用试剂, 耐热塑料器具120℃30min化学方法: 杂交用试剂均应用DEPC水配制对不耐热的器具可浸于DEPC水中, 室温处理2~3h实验中注意戴口罩和手套操作DEPC---焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)通过与组氨酸结合而使蛋白质变性配制: 0.1%DEPC水37℃水浴恒温振荡过夜2.取材及固定取材：组织要求新鲜如有可能尽量使用灌流固定手术材料最好在组织离体后30min内取材并立即进行固定取材过程中防止RNA酶的污染固定1. 目的：避免组织细胞中核酸的降解，保存组织细胞形态结构的完整2. 固定方法: 灌流法, 浸泡法浸泡法: 一般将组织块切成0.5~1.0cm3大小, 浸泡于15倍左右体积的固定液中, 固定24hr冰冻切片或细胞培养标本, 固定20~30min3.固定时间4.常用固定剂: 4%多聚甲醛, 10%甲醛包埋和切片石蜡包埋和切片方法同常规操作过程中防止RNA酶污染➢戴手套操作➢切片刀用DEPC水擦拭，镊子消毒后使用➢切片时，用0.1%DEPC水展片➢新鲜切片60℃烘烤16~24hr玻片的处理❑玻片上涂上粘附剂❑常用粘附剂: APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)多聚赖氨酸明胶❑防脱处理后高温消毒原位杂交实验1.杂交前处理目的:提高组织的通透性，增加靶核酸分子的可及性常用方法:脱蜡，去污剂，表面活性剂：Triton X-100，SDS，Tween蛋白酶：蛋白酶K，胃蛋白酶2.预杂交: 将不含探针和葡聚糖的杂交液与组织孵育3. 探针和靶核酸的变性杂交滴加含有探针的杂交液(20μl/片), 盖上盖玻片或无菌的石蜡膜, 置于湿盒内, 在合适温度的烘箱内杂交❑杂交液钠盐: 5 X SSC (标准柠檬酸钠-氯化钠溶液)50%去离子甲酰胺硫酸葡聚糖牛血清白蛋白, 鲑鱼精DNA等❑探针浓度放射性标记探针---0.5ng/μl非放射性标记探针---2ng/μl⏹PH值: 通常使用缓冲液PH7.2~7.4❑杂交温度: 一般低于相应杂交体的Tm值25℃❑杂交时间❑杂交环境: 湿盒内加少量与杂交液相同渗透压的SSC (5X SSC)杂交后漂洗在高严格度条件下，漂洗除去未参与杂交体形成的过剩探针，消除探针与组织细胞的非特异结合高严格度条件：指高的温度，低的钠离子浓度一般用浓度递减的SSC溶液在一定温度和振荡下漂洗切片：2X SSC→1X SSC→0.5X SSC杂交后信号检测❑同位素标记探针: 放射自显影❑D IG标记探针:AKP或HRP标记的抗DIG抗体显示系统DIG-AKP检测系统: 以NBT/BCIP为底物显色, 结果为紫蓝色沉淀DIG-HRP检测系统: 以DAB/H2O2为底物, 结果为棕阴性对照试验方法作用杂交前用核酸酶处理如果杂交信号明显降低或消失, 说明探针是与组织细胞中的核酸杂交杂交液中省去探针如果出现阳性反应, 说明这些信号是与杂交反应无关的用正义核酸探针如果无杂交信号, 表明探针的特异性加过量未标记探针杂交后阻断标记探针与待测核酸的结合, 如杂交再加标记探针杂交信号消失或下降, 表明探针杂交的特异性5. Northern或Southern分析如果在待测核酸的分子量大小处显示一条杂交信号带, 表明探针的特异性6. 将标记探针与未标记探针按如果杂交信号随标记探针量的增加而增一定比例混合, 然后杂交加, 说明探针是特异的实验中可能出现的问题原位杂交实验失败1. 探针探针的敏感性;保存的好坏, 保存时间探针浓度; 探针长度2.组织材料的保存3. 实验过程中防止RNase污染, 做到严格的无RNase操4. 杂交前处理:蛋白酶消化的浓度, 时间PK在冰冻切片浓度为0.5~2μg/ml石蜡切片浓度10~20μg/ml5. 杂交条件: 温度时间6. 杂交体检测脱片玻片的防脱处理杂交前预处理时蛋白酶的浓度，消化时间杂交后漂洗过度非特异性染色探针特异性不高组织细胞内内源性酶染色内源性过氧化物酶0.5%~5%H2O2内源性碱性磷酸酶1mmol/L左旋咪唑内源性生物素杂交后的漂洗2X SSC→1X SSC→0.5X SSC37℃振荡漂洗概念：⏹原位杂交，变性，复性（退火），探针，靶核酸分子⏹原位杂交基本原理，优点⏹探针的种类及优缺点⏹探针的标记方法及原理⏹组织样品制备时的注意事项⏹原位杂交中可能会出现哪些问题，应怎样避免这些问题⏹原位杂交特性以及与免疫组化比较。
细胞各种染色方法1
细胞各种染色方法1细胞各种染色方法1细胞是生物体的基本结构单位，研究细胞结构和功能对于理解生命活动的基本原理具有重要意义。
而在细胞研究中，染色方法是最常用的一种技术手段之一、通过染色，可以使细胞内的各种器官、蛋白质、核酸等结构或分子可视化，从而更好地研究细胞的结构与功能。
下面介绍一些常用的细胞染色方法。
1.原位杂交染色原位杂交是一种通过特异性核酸探针与目标细胞中的特定DNA或RNA 序列结合，从而实现靶分子检测和定位的方法。
通过这种方法，可以查看细胞中特定基因或RNA的表达情况，从而揭示该基因或RNA在细胞中的作用。
在原位杂交染色中，探针可以用荧光标记或放射性同位素标记，并使用显微镜观察或放射性成像等方法进行检测。
2.免疫染色免疫染色是一种利用抗体与特定抗原结合的原理，对细胞或组织进行染色分析的方法。
由于抗体可以识别并结合到蛋白质、多肽、糖、核酸等生物分子上，所以免疫染色可以用于检测特定蛋白质或分子的存在和表达水平。
免疫染色可以通过荧光染色或酶标染色来实现，进一步结合显微镜观察和图像分析等方法，可以定量或定位地研究细胞内的各种分子。
3.组织化学染色组织化学染色是一种通过化学反应将细胞或组织中特定分子染色的方法。
常用的组织化学染色方法有哈维氏酸碱性染色、格里姆萨染色、伊红-Wright染色等。
这些染色方法可以用来观察细胞内的DNA、蛋白质、核酸以及细胞器等结构，并通过显微镜观察，从而对细胞和组织的结构和组成进行研究。
4.核酸染色核酸染色是一种利用荧光染料或放射性染料对DNA或RNA进行直接染色的方法。
通过核酸染色，可以观察到细胞和细胞核的形态、数量和分布情况，进而研究细胞的分裂、DNA合成和RNA转录等过程。
核酸染色方法包括荧光染色和核酸复合物染色等，其中荧光染色可用于显微观察，核酸复合物染色则可通过放射性成像等方法进行检测。
细胞染色是细胞生物学研究中非常重要的一种手段，通过染色可以使细胞内的各种结构与分子可视化，从而更好地研究细胞的结构与功能。
细胞化学法的名词解释
细胞化学法的名词解释细胞化学法是一种常用于细胞分子生物学研究的实验技术，旨在通过利用某些特定类别的分子标记或化学反应对细胞内的不同分子进行可视化和定量研究。
它在揭示细胞结构、功能和互动方式方面发挥着重要作用。
本文将介绍几种常见的细胞化学法，包括免疫荧光染色、原位杂交、免疫组织化学和荧光染料等。
一、免疫荧光染色免疫荧光染色是一种利用特异性抗体标记目标分子的方法。
这种技术常用于检测细胞内蛋白质的位置、数量和相互作用。
在免疫荧光染色中，首先将待检测的组织或细胞样本固定，并使用适当的抗体特异性地结合到目标蛋白上。
然后，通过给予荧光染料标记的第二抗体与第一抗体结合，从而生成荧光信号。
这些信号可以被荧光显微镜观察，并通过相关的图像分析技术进行定量研究。
二、原位杂交原位杂交是一种用于检测或定位特定核酸序列的技术。
这种方法利用荧光或放射性标记的探针与细胞或组织样本中的目标DNA或RNA分子杂交结合。
通过探针与目标分子的互补配对，可以确定目标分子的位置、数量以及相互作用方式。
三、免疫组织化学免疫组织化学是一种广泛应用于研究细胞和组织的技术，旨在检测、定位和分析特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。
在免疫组织化学中，细胞或组织样本首先经过固定和切片处理，并使用特定抗体特异性地结合到目标蛋白质上。
然后，通过给予适当的检测方法（如酶反应或荧光染色）产生可视化信号。
免疫组织化学可以提供有关细胞类型、蛋白质定位和表达情况的信息，从而帮助我们理解细胞和组织的功能及其异常变化的机制。
四、荧光染料荧光染料是细胞化学研究中常用的标记工具。
它们可以与细胞或组织样本中的特定分子结合，并通过荧光显微镜观察。
不同的荧光染料可以标记不同的分子，例如DNA、蛋白质、细胞器或细胞骨架等。
荧光染料广泛应用于细胞成像、细胞追踪、分子定位和定量分析等方面。
近年来，随着荧光技术的不断发展，新型的高亮度和高稳定性荧光染料不断涌现，为细胞化学研究提供了更为可靠和有效的工具。
现代组织化学组织化学
通过显示酶的活性来检测酶的存在。
常用光镜酶组织化学 显示法反应原理
酶组织化学基本反应原理
酶特异性底物 + 相关捕获剂
（孵育液内）
酶
（组织细胞内）
反应产物沉淀（有色）
镜下观察
反应产物沉淀（无色）+置换剂 有色沉淀
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅰ：钙-钴法
R-PO4Na2 +
H2O
CaCl2 酶作用
R-OH + CaHPO4
（无色沉淀）
CaHPO4 Co(NO3)2 Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 (NH4)2S CoS ↓（显色）
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅱ：铅法
Pb2+
R-PO4Na2 + H2O 酶作用 R-OH + PbHPO4
PbHPO4 (NH4)2S PbS ↓（显色）
2%CaCl2 5%MgSO4 双蒸水
10 ml 10 ml 20 ml 1 ml 5 ml
酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理（铅法）：
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
ACP pH 5.0
R-OH + H3PO4
H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 + (NH4)2S
Pb3(PO4)2 PbS↓(棕黑色)
N—N—C6H5 酶作用 N＝N—C6H5 +2H C6H5—C
N—NH—C6H5 + HCl
N＝N—C6H5
四唑盐(无色)
甲月朁 （红色）
3、色素形成法
II、靛酚蓝法：
H3C CH3 N
+
免疫组化与原位杂交
显色特点： ---棕红色 ---不溶于水，但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存 3）4氯1萘酚（4-Chloro-1-naphthol，CN） 显色特点： ---蓝色 ---不溶于水，但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存 4）四甲基联苯胺（3,3‘,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）
二、常用于标记抗体的标记物
一）酶（enzyme） 1.辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP） 辣根过氧化物酶的作用物（底物，substrate） 1）二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB） 显色特点： --- 棕色 ---不溶于水及脂类溶剂（酒精 ethanol, 二甲苯xylene） ---不扩散 ---永久保存 2）3氨基9乙基卡巴唑（3-Amino-9-Ethylcarbazole，AEC）
3）包埋：用于冰冻切片组织的包埋剂是OCT ( Cryo Embedding Medium )
4）切片：将包在OCT中的组织安装在冰冻切片机上进行切割，切 片的厚度一般为5-20μm。 5）后固定：适用于四）预防脱片的措施： 1. 载玻片的处理： 重铬酸钾（bichromicum Kalium）浓硫酸（concentrated sulfuric acid）清洁液浸泡24小时 充分流水冲洗 离子水冲洗2遍 烘干
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2、玻片处理 包括载玻片和盖片 热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸 泡24小时，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸 馏水冲洗，烘干。烘箱温度最好在150℃或以上过夜以 去除任何RNA酶。盖玻片最好硅化处理，锡箔纸包裹 无尘保存。 粘片剂： 多聚赖氨酸液、APES。最后用DEPC处理的 蒸馏水清洗玻片1-2次。
杂交前准备：标本制备、探针制备1、固定 ●保持细胞形态结构； ●最大限度的保存细胞内的DNA或RNA的水平； ●使探针易于进入组织或细胞。 对于DNA来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。 RNA非常容易降解，固定剂 的种类、浓度、固定时间非 常重要。而且取材后应尽快冷冻或固定。在解释ISHH的 结果是应考虑到取材至冷冻或进入固定剂这段时间对RNA 保存多带来的影响。
4．杂交严格度（Hybridization stringency） ●杂交条件的严格度表示通过杂交及冲洗条件的选择对完 全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。 ●错配对杂交体稳定性较完全配对杂交体差。通过控制杂 交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高 杂交的特异性。 ●杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低。 ●低严格度杂交及冲洗条件在Tm -35℃至Tm –40℃之间， 高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有70%～90% 的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交 信号的产生。中严格度，Tm -20℃至Tm-30℃的范围。 高严格度为Tm-10℃至Tm-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。 在这种条件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成 稳定的结合。
预杂 交
目的:饱和组织中可能与核苷酸探针分子结合的非特异性位 点，以降低本底，提高信噪比。预杂交液新鲜配制。
杂交
就是将杂交液滴加于要检测的组织或细胞上，加盖硅化的盖 玻片，为了防止杂交液的蒸发，可在盖玻片的周围用橡皮泥 封固（清洁）或液体石蜡（易污染），时间为12-20小时，温 度为37-52℃. 如果探针为双链DNA探针，杂交前应有变性这一过程。 方法:分开变性（杂交前热变性） 共同变性（加到切片上封固后再变性。应用原位PCR仪或原 位杂交仪）
固定剂：最常用多聚甲醛（不会与蛋白质产生广泛的 交叉连接，不会影响探针穿透细胞或组织），被公认 为ISHH较为理想的固定剂。 对于mRNA的定位，常采用的方法是：
将组织固定于4%的多聚甲 醛磷酸缓冲液中1-2h，在 冷冻前浸入15%蔗糖溶液 中，置4℃冰箱过夜，次日 切片或保存在液氮中。
组织也可在取材后直接
杂交后处理
目的：去除过剩探针，减少非特异性信号。 方法：采用高盐浓度漂洗，减少探针与组织静电结合。 杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的 漂洗。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数 和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差 异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温 度由低到高。如何控制漂洗的严格度从而达到理想的 信/噪比必须从反复的实践中取得经验。 注意：漂洗过程中切勿使切片干燥；防止切片脱落。
5．硫酸葡聚糖和甲酰胺 硫酸葡聚糖是核酸杂交液中仅次于甲酰胺的一种组成 成份。在杂交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖 占10%左右。它是一种大分子的多聚胺化合物，具有极 强的水合作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度，其主 要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。 甲酰胺的主要作用在于调节杂交反应温度方面，从而 有助于保持组织的形态结构。
3．杂交的温度和时间 原位杂交中，多数DNA探针需要的Tm是90℃，而RNA则 需要95℃。这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片 粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交的程序中常规 的加入30%～50%甲酰胺于杂交液中。反应液中每增加 1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。由于盐和甲酰胺 浓度的调节等因素，实际采用的原位杂交的温度在Tm25℃左右，大约在30～60℃之间。 杂交的时间如过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非 特异性染色。从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在 3h左右。为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h， 或为简便起见杂交孵育过夜。
4、防止RNA酶的污染 ●在整个操作过程中应戴手套和口罩； ●玻璃器皿常规洗净后，应用RNA酶抑制剂（0.1%的 二乙基焦磷酸盐液， DEPC）浸泡处理（37℃,2h）,再 用双蒸灭菌水漂洗几次，高压消毒去除DEPC,然后于 180 ℃烘烤4h.;镊子高温烘烤。 ●塑料器皿最好用一次性用品，使用前进行高压消毒； ●所有溶液应加DEPC，终浓度为0.05-0.1%，室温处 理过夜。然后高压处理以去除所有残留的DEPC.
原位杂交组织化学
（in situ hybridization histochemistry）
一、原位核酸分子杂交（ISHH）技术的基本原理
●是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、 细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合以 形成杂交体，再应用与标记物相应的检测系统，通过免 疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成一定带颜色的 杂交信号。 ●突出优点：可以在原位精确测定含有靶核苷酸序列的 细胞类型及分布,有形态学上的意义。
了其应用）、 地高辛（Dig）、荧光素、酶等标记。
地高辛标记物 洋地黄毒苷(Dig)，不会产生内
源性相似物质的干扰，敏感性与 放射性核素标记的探针相仿。杂 交的切片背景好、细胞定位准确， 是当前杂交化学最为流行的方法。
三、原位杂交组织化学方法 1、原位杂交的类型：
根据探针标记物是否能被直接检测到，分为直接法和 间接法。 直接法:标记物为放射性同位素、酶或荧光。 间接法:标记物为半抗原，如生物素或地高辛。 2、原位杂交技术基本方法
显示
显示（杂交体的检测） 又可称为检测系统（Detection system）
同位素标记:采用放射自显影检测 生物素标记：采用ABC、SP等免疫组化方法检测 地高辛标记：采用anti-Dig-HRP-DAB检测系统 荧光标记:荧光显微镜观察 酶标记：底物直接显色。
四、影响原位杂交的因素
1、探针的浓度 ●最佳原则是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大 饱和结合度为目的。 一般在原位杂交细胞化学中，探 针浓度为0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。 ●加杂交液的量要适当，以10～20μl/每张切片为宜。过 多不仅造成浪费，而且液量常易致盖玻片滑动脱落；过 量的杂交液含核酸探针浓度过高，反易导致高背景染色。 2．探针的长度 应用于ISHH探针的最佳长度应在50～100个碱基之间。 探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。
3、增强组织通透性 稀释的酸洗涤，去垢剂，清洗剂TritonX-100，某些 消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶等） 注意：在增强组织通透性的同时，也会降低RNA的保 存量和影响组织结构的形态。因此用量和孵育时间上 应谨慎掌握。此步骤根据应用固定剂的种类、组织的 种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。
RNA探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。 寡核苷酸探针：DNA合成仪依杂交的靶核苷酸序列合成。
探针分子一般20-50bp。
3、探针标记的种类： 放射性标记----标记物为放射性同位素，如3H、35S、32P。
敏感性高，特异性强，但对人体有伤害。 非放射性标记----多采用生物素（内源性生物素的存在限
二、探针 1、概念 探针(Probe):是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或 RNA片段。是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或 RNA顺序定位的特殊试剂。探针的碱基序列是已知的， 只能与特定的核酸分子结合。 2、常用探针种类： DNA探针:ssDNA、dsDNA）、cDNA探针 RNA探针：同义RNA探针、反义RNA探针（cRNA）。
免疫组织化学课程作业
1、常用免疫组织化学方法有哪些？ 2、简述酶免疫组织化学的基本原理。 3、简述单克隆抗体制备的基本原理。 4、简述免疫血清的制备过程。 5、简述核酸分子原位杂交组织化学的过程。 6、增强免疫组织化学技术敏感性的方法有哪些？ 7、请列出几种能分别与DNA和蛋白质结合的荧光素。 任选四道题回答。