免疫组织化学技术(ABC法)
免疫组化的原理与操作
化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一； ——国内起步晚，从70s开始。
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二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
如将该法中的卵白素（avidin）变换成链霉卵白素(streptavidin)，LAB法即成LsAB法，或称SP法。
（B ★为生物素标记的过氧化物酶）
AB★C复合物是avidin与酶联biotin 在使用前30min 配置，混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子，剩下 1个结合点与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。
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（1）ABC复合物的制备：
（2）ABC法反应原理：
特点：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感20~40倍，背景 也更清晰。
特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高；
（2）可定性、定位、定量观察；
（3）将形态学改变与功能和代谢变化结
合起来；
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IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平） 能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别 是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免 疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能 定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进 行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。
荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗 体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→ 检测抗原。
优点：简单，时间短， 特异性强。
缺点：灵敏度低，所 需抗体量大 （不经济）。
应用：基本不用了！！
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常用免疫组织化学染色方法-步骤
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组化试题参考答案
免疫组化试题参考答案免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。
其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。
其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。
其不同点为三步法，且有放大作用，反应彻低依靠于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应敏捷度高，背景低。
注重一抗与复合物中的抗体必需来源于同一种动物，且二抗必需过剩。
4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。
无标记的探针称裸探针。
5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
杂交的双方分离为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。
6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术掌握，是组织化学的关键环节，是取得惬意效果的须要条件，是提高结果可信度的根本保证。
7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以改变成荧光分子。
此技术目前主要应用在生物胺的显示中。
其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。
8.定量分析：定量推断是结果推断中最重要也是具故意义的推断，其推断结果有助于统计学的分析处理。
组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（终于阳性产物）举行测量，以数值反应被检测物质的含量。
免疫组化abc法名词解释
免疫组化abc法名词解释
免疫组化ABC法是一种用于检测蛋白质在组织切片中表达的方法。
这种方法通常用于病理学研究和临床诊断中。
ABC法的全称是Avidin-Biotin Complex法，它利用了生物素和亲和素之间的特异性结合来实现对蛋白质的检测。
在ABC法中，首先需要利用一种特异性的抗体来与待检测的蛋白质结合。
这个抗体通常被称为一抗，它可以识别并结合到特定的蛋白质上。
接下来，将生物素标记的二抗加入样本中，这些二抗能够与一抗结合。
然后，将含有酶的生物素-链霉素复合物（ABC）加入样本中，这个复合物可以结合到二抗上。
最后，加入染色底物，这样就可以通过显色反应来观察蛋白质的表达情况。
ABC法的优点包括灵敏度高、特异性好、操作简便等，因此被广泛应用于免疫组化实验中。
然而，也需要注意到ABC法在操作过程中可能存在的非特异性结合和背景信号的问题，需要进行严格的实验控制和数据分析。
总的来说，免疫组化ABC法是一种重要的实验技术，它通过利
用生物素和亲和素的结合特性，能够有效地检测组织切片中蛋白质的表达情况，对于研究和诊断具有重要意义。
免疫组化 ABC法
免疫组化染色步骤(ABC法)第一天：【准备：试剂、37℃恒温水箱打开】1．切片脱蜡：第一排试剂瓶从左至右（二甲苯→Alcohol），二甲苯内浸泡10min，Alcohol 内浸泡5min。
【二甲苯→二甲苯→100% Alcohol→100% Alcohol→95% Alcohol→90% Alcohol→80% Alcohol→70% Alcohol】2．TBS洗10 min×3，置摇床上。
3．【注意避光】用0.3% H2O2和0.3%Triton 混合液处理切片30min，置于摇床上。
增加切片渗透性。
【注：H2O2原液是30%，先把Triton溶解在TBS中后，再加入H2O2】4．TBS洗10 min×3，置摇床上。
5．抗原修复：塑料染缸中加入250mL 0.05M Citrate buffer（或0.05M Tris-HCl缓冲液）液，然后放入片子，调至“解冻”档，先微波加热5min（温度升至95o C左右），继续加热10min,中间冷却5min，再加热10min，然后室温冷却20min6．TBS洗10 min×3，置摇床上。
【如果掉片严重，5、6和3、4调换一下】7．将切片取出，组织周围的水分用滤纸吸干，用特制的记号笔（冰箱中，可防止液体流出）在组织周围划上圈后放入湿盒中，并在圈内滴入5%羊血清，做到完全覆盖住组织，然后将湿盒放入恒温水箱（37℃）中20 -30 min。
8．将湿盒取出，把切片上的羊血清轻轻倒掉，用滤纸擦干留下的水道，否则再加入的液体将会沿着水道流出。
加入Ι抗，做到完全覆盖住组织，放入湿盒中，置恒温水箱（37℃）1h。
9．从水箱中取出湿盒，放入4℃冰箱中过夜。
第二天：【准备：37℃恒温水箱打开】10. 取出湿盒（室温30 min，恢复到室温），将抗体倒掉，TBS洗10 min×3，置摇床上。
11.滤纸将圆圈周围的水分吸去，加入相应Π抗，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中1h12. 取出湿盒，将Π抗倒掉，TBS 洗10 min×3，置摇床上。
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组织化学SABC法
结果判断标准
一些原则必须掌握： 阳性细胞定位要在5%以上，才能定为阳性。 参考评价： <5% - ， 5%-25% + ， 25%-50% ++， >50% +++ ～++++
P53
雌激素受体β在乳腺癌的表达
免疫组织化学SABC染色法
原理：
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度
亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过
氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后
与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。
用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC复 合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗— ABC。最后用底物显色剂显色。
(3) 3%过氧化氢溶液，10min；
(4) PBS浸洗，×3次； (5) 使用封闭剂：每张切片滴加非免疫动物（羊）血 清(与二抗同源)室温 10min；倾去血清，不洗！ (6) 每张切片滴加小鼠抗人CEA单抗（1:100）， 37℃ ，30min，或4℃过夜； (7) PBS浸洗，3次；
(8) 每张切片滴加第二抗体(1:100)，37℃，
⑴ lgG (anti-Mouse)
⑵ lgG (anti-Rabbit)
Straptived- HRP 复合物（SABC） A液（avidin） ：亲和素 B液（biotin） ：生物素-HRP
显色剂： 浓缩DAB H 2O 2 Buffer
实验步骤:
(1) 结肠癌石蜡切片脱蜡下行酒精入水； (2) PBS浸洗，×3次；
20min； (9) PBS冲洗，×3次； (10)每张切片加100lSABC溶液(1:100)，37℃， 20min； (11)PBS冲洗，×3次； (12)新鲜配制的底物 DAB溶液，3～5min； (13)自来水冲洗，脱水，透明，中性树胶封固。
免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中的应用
免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中的应用
免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中起着重要的作用。
通过免疫组织化学方法，可以检测肺癌组织中的特定分子标志物，从而帮助确定肺癌的诊断和分型。
常用的免疫组织化学标记物包括细胞角蛋白、肿瘤标志物、细胞增殖指标等。
例如，通过检测细胞角蛋白的表达，可以确定肺癌的细胞来源和类型。
肿瘤标志物如细胞表面抗原（如
CK7、CK20）和肿瘤相关抗原（如CEA、NSE）的表达可以
帮助区分肺癌的类型和分级。
此外，细胞增殖指标如Ki-67的
表达可以反映肿瘤的增殖活性，有助于判断肺癌的恶性程度。
免疫组织化学方法可以通过染色反应来显示标记物的表达情况。
在肺癌病理诊断中，常用的免疫组织化学染色方法包括免疫组化ABC法和免疫组化热敏法。
这些方法可以通过染色反应的
强度和位置来确定标记物的表达情况，进而判断肺癌的类型和分级。
总的来说，免疫组织化学方法在肺癌病理诊断中具有高灵敏度和高特异性的优势，可以提供更精确的肺癌诊断和分型结果，对于制定个体化治疗方案和预后评估具有重要意义。
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免疫组织化学技术（ABCxx）
大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100 和
0.03%H
2O
2的
0.01%磷酸盐缓冲液（PBS, pH
7.4 ），室温30min ;含3%牛血清白蛋白（BSA, Sigma的PBS室温30 min; 豚鼠抗HAP1抗体（1:300）, 4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次10min;生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min; ABC复合物（1:100）, 2小时；PBS漂洗3次，每次10min ;含
0.03%DAB 和
0.006%H
2O
2 的Tris 盐酸缓冲液（pH
7.6）室温13mi n;常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。
以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。
鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。
A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。
C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。
D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析, *示与对照组比较, P<
0.01。
比例尺为100 am。
E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析, ▲示与对照组比较, P<
0.01。
免疫荧光双标技术
脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS室温30min，含2%正常羊血清(NGS和3%BSA的PBS室温30min,入豚鼠抗HAP1 抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100) 4C 孵育48h; PBS漂洗 3 次，每次10 min，加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG (1:500),室温闭光2h, PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。
荧光显微镜观察，FITC用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。
HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。
A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1, B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R C示A和
B的重叠图像。
箭头示HAP1和NK1R双标细胞。
比例尺为20 am。
细胞进行处理后,弃培养基,用
0.01MPBS漂洗3遍。
加入4%多聚甲醛固定30min。
PBS漂洗3遍。
加入3%Triton-x 100的PBS室温30 min;含2%正常驴血清(NGS和3%BSA 的PBS室温30 min;分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200, Neuro-Marker 公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体(1:1000, sigma公司)或兔抗NSE多克隆抗体
(1: 100,北京中山生物技术公司)4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次
10min;入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories，室温闭光3h; PBS闭光漂洗3 次，每次10 min;含10%甘油的PBS封片。
激光共聚焦显微镜(Olympus FV500观察，EGFP用
488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。