免疫组化技术及应用
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是现代生物学研究领域中一项重要的实验技术，它通过利用抗体与特定抗原的高亲和力结合特异性标记，可以准确地检测和定位分子在细胞和组织中的分布，并在这一基础上进行生物学功能的研究。
本文将对免疫组化技术的原理、应用以及发展趋势进行详细介绍。
一、免疫组化技术的原理免疫组化技术基于生物体对抗原与抗体的免疫反应，利用抗体与抗原的特异性结合来标记和检测感兴趣的分子。
免疫组化技术的关键步骤包括：抗原的固定、抗原的暴露、与抗原的特异性结合和信号检测等。
在免疫组化技术中，抗原通常需要进行固定，以保持其在组织中的形态和位置不变。
一般来说，抗原可通过形成固定化复合物或被共价结合到载玻片或膜上。
随后，我们需要将抗原从组织中溶出，以使其暴露于抗体。
这一步骤通常涉及脱水、脱脂和脱钙等处理。
暴露后的抗原可以与特异抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
为了标记抗原-抗体复合物，我们需要选择适当的检测系统。
目前常用的检测方法包括荧光染色、酶学染色和放射性标记等。
其中，荧光染色技术具有高灵敏度和分辨率，能够利用荧光显微镜直接观察标记物的分布。
二、免疫组化技术的应用免疫组化技术在许多研究领域中广泛应用。
在医学领域，它常用于研究肿瘤形成机制、诊断和预后判断。
通过免疫组化技术，我们可以检测和定位许多肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）和肿瘤相关抗原（CA）等，从而帮助医生进行早期诊断和治疗。
在神经科学领域，免疫组化技术被广泛用于研究神经元发育、突触形成和神经退行性疾病。
通过标记神经元特异性蛋白质，如神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经纤维酸性蛋白（NF）等，可以清晰地观察和研究神经元的结构和功能。
此外，免疫组化技术在细胞和分子生物学研究中也具有广泛的应用。
通过对细胞内蛋白质、DNA和RNA等分子的定位和检测，我们可以研究细胞的生物学功能和基因调控机制。
例如，通过检测特定蛋白质的表达和定位，可以研究调节细胞周期和细胞分化的信号通路。
免疫组化技术在制作病理组织切片中的应用价值分析
免疫组化技术在制作病理组织切片中的应用价值分析随着医疗技术的不断进步，免疫组化技术在病理学领域中的应用越来越广泛。
免疫组化技术是一种在组织切片中应用抗体特异性与抗原相互作用的方法，通过对组织中一些特定分子的免疫活性成分进行定位和检测，从而得到更为精准的病理诊断结果。
本文将从技术原理、应用优势、应用领域和发展趋势等方面进行分析，探讨免疫组化技术在病理组织切片中的应用价值。
一、技术原理免疫组化技术是基于免疫学原理，通过特异性抗原与抗体之间的结合来检测组织切片中的蛋白质、细胞因子等生物大分子，从而对细胞及组织的结构、功能和病变进行定位和分析的方法。
其核心原理是利用抗体的高度特异性和亲和力，来实现对组织中特定蛋白或生物分子的识别。
免疫组化技术主要分为直接法和间接法两种。
直接法是将荧光标记或酶标记的抗体直接与待检测的抗原结合，然后通过显微镜观察标记物的位置和数量。
间接法则是将一种第一抗体与待检测抗原结合，然后用另一种标记有酶或者荧光素的第二抗体去识别第一抗体，最后通过显色反应或者荧光显微镜观察标记物的位置和数量。
这两种方法都能够实现对组织切片中特定蛋白质或生物分子的定位和检测。
二、应用优势1. 提高诊断的准确性：免疫组化技术通过对组织切片中特定抗原的检测，可以为病理医生提供更为精确的诊断信息，有助于区分病变类型和疾病分期，从而提高了病理诊断的准确性。
2. 发现新的生物标志物：通过免疫组化技术可以检测到组织中一些特定蛋白质的表达情况，进而发现新的生物标志物，帮助预测疾病进展和评估治疗效果，为临床治疗提供更为准确的依据。
3. 研究疾病发病机制：免疫组化技术可以帮助研究人员对疾病的发病机制进行深入研究，通过检测疾病相关蛋白的表达情况，揭示疾病的发生和发展过程，为疾病的治疗和预防提供理论依据。
4. 指导个性化治疗：通过检测组织中特定蛋白的表达情况，可以为临床治疗提供更为个性化的治疗方案，帮助临床医生制定更为合理的治疗方案，提高治疗效果。
免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用
在诊断性免疫组化中的质量控制是个重要问题。 美国生物染色委员会附属商品以及商品试剂信息标准化，美国食品及药品 管理局（FDA)通过美国病理学会批准出台一项政策， 列出了61种在一些严重疾病的诊断和/ 或监测中充分标 准的单克隆抗体，并要求制造商自政策发表之日起的 30个月内向FDA提交合适的产品使用申请，在此期间产 品虽被允许用于医学目的在市场销售，但制造商们必 须在产品上标明“未经法律批准，暂时供应以满足重 要的医学目的”。
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免疫酶学技术还包括碱性磷酸酶-抗碱性磷酸 酶(APA-AP)系统[2] 及葡萄糖氧化酶─抗葡萄糖氧化 酶（GAG)系统等，这些技术与PAP技术相似，只 不过是将碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶代替辣根过 氧化物酶而已，据称这两种技术可以减少背景染 色的干扰，因为相应的内源性酶在组织中分布有 限，尤其是APA -AP技术更适用于血液标本染色。
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抗体保存在不吸附蛋白质的材料中，如储存抗体中蛋白 浓度很低时（10-100mg/l），应另加隔离蛋白，以减少容器 对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋 白。绝大多数已稀释的抗体应保存在4℃-8℃的条件下，以 免冻融对抗体蛋白产生有害的效应。抗体原液和已分离的 免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件，避免反复冻融。冷冻 的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温 快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，为了 防止细菌污染，可在抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经 真空冷冻干燥后置-20℃以下可以保存2-3年，保存稀释后的 单抗应加入0.1%叠氮钠。大多数稀释抗体不可进行冷冻保 存，多数抗体可能会丢失抗原活性，多数抗体只要蛋白浓 度适当，可在4℃下保存数月。
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PAP法是过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)复合物， 包括辣根过氧化物酶抗体，及辣根过氧化物酶抗原 组成的可溶性复合物为五环状结构，3个分子辣根过 氧化物酶和二个抗体分子组成，极为稳定，比免疫 荧光法敏感100-1000倍，比酶桥法敏感20倍，其原理 是特异性初级抗体（一抗）的Fab段与组织抗原结合， 二抗（桥抗）在一抗与PAP复合物之间形成分子桥联， 此时一抗与PAP中的免疫球蛋必须是同一种属，以使 得衍生自其它种属的二抗，对一抗分子PAP中的FC段 及稳定成份都具有特异性。
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的重要技术手段。
它通过利用抗体与其特异性抗原相互作用的特性，实现对细胞、组织和分子的检测和定位。
本文将从免疫组化技术的原理、应用、优缺点等方面进行介绍。
首先，免疫组化技术的原理主要基于抗原与抗体的高度特异性反应。
抗原一般是指能够被免疫系统识别并引发抗体产生的物质，它可以是细胞膜上的蛋白质、细胞核中的核酸、胞浆中的酶等。
而抗体是机体免疫系统产生的一类蛋白质，具有高度特异性与抗原结合。
在免疫组化技术中，通常选择一种与目标物高度特异性结合的抗体，通过与目标物反应形成抗原-抗体复合物，再利用染色、荧光等方法对其进行检测和定位。
免疫组化技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
首先，在生物医学研究领域，免疫组化技术可以用于检测和定位特定蛋白质或细胞标志物。
例如，科研人员可以利用特异性抗体对肿瘤标志物进行检测，从而实现早期肿瘤的筛查和诊断。
此外，免疫组化技术还可以用于研究免疫反应、细胞分化和分子信号传递等生物学过程。
其次，在临床诊断中，免疫组化技术可用于肿瘤诊断、感染病的检测和诊断，以及免疫性疾病的诊断等。
临床医生可以利用免疫组化技术对病理切片进行染色，帮助判断疾病类型和严重程度。
免疫组化技术具有多种优点。
首先，它具有高度特异性和敏感性。
由于抗体与特定抗原的结合是高度特异性的，因此免疫组化技术可以实现对目标物的准确检测和定位。
其次，它可以同时对多个目标进行检测。
通过同时使用多个不同特异性的抗体，可以对多个目标分子进行检测，从而提高检测效率。
此外，免疫组化技术还可以实现对细胞或组织的形态学和功能的研究，有助于揭示生物学过程的机制。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和不足之处。
首先，技术操作复杂。
免疫组化技术需要对抗体的选择、染色剂的选择和实验条件等进行严格控制，技术操作要求较高。
其次，需要合适的阳性和阴性对照。
在使用免疫组化技术时，需要合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化在病理诊断中的应用
免疫组化在病理诊断中的应用
免疫组化是一种病理诊断技术，可以通过检测组织或细胞中的特定蛋白质来确定疾病的类型和程度。
它通过染色技术使用标记有荧光或酶的抗体来探测细胞或组织中的特定蛋白质，从而提供对疾病的更深入的了解。
以下是免疫组化在病理诊断中的主要应用步骤。
1. 准备组织样本
首先，需要采集组织样本，并根据需要适当切片。
切片后，样本需要通过固定和去水来准备，这可以防止蛋白质失去结构和形态。
然后，需要将样本嵌入到蜡块中，以便进行染色处理。
2. 进行抗原恢复
接下来，需要进行抗原恢复。
抗原恢复是将细胞或组织中的蛋白质处理，以便它们更容易被检测到。
通常，这涉及在加热和非加热的液体中浸泡样本，以稍微破坏组织，使抗体更容易进入组织中。
3. 应用抗体
准备好样本后，需要对其应用抗体。
此时，可以使用单克隆或多克隆抗体。
这些抗体含有特定的标记，可以检测到特定的蛋白质。
抗体应该与样本一起孵育，以确保它们与细胞或组织中的特定蛋白质发生反应。
4. 观察和分析结果
完成抗体应用后，需要观察和分析结果。
结果通常是显微镜下可见的染色。
根据染色的程度和位置，可以确定疾病的种类和程度。
比如，检测到某种癌症可能会显示出比正常细胞更强的染色。
总之，免疫组化是一种有效的病理诊断技术，可以帮助医生确定疾病的类型和程度。
然而，要正确应用免疫组化技术需要熟悉这种技术的操作步骤和原理。
同时，还需要了解每种抗体和标记的优缺点，以确保使用正确的抗体来提高准确性和可重复性。
免疫组化技术简介及相关临床应用
＋－－ ＋
淋巴结边缘区Ｂ细胞淋巴瘤 － － － －
结外边缘区Ｂ细胞淋巴瘤
－－－
－
（黏膜相关淋巴组织淋巴瘤）
垂体腺瘤的免疫组化鉴别诊断
泌乳素细胞腺瘤
LTH GH ACTH PSH/LH FSH CgA
＋－ －
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－－
NSE KER
＋
＋
生长激素细胞腺瘤
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促皮质激素细胞腺瘤 － － ＋
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－
＋
－－
20世纪80年代该项技术在国外开始应用 于诊断疾病，国内比国外约晚10年，即90 年代开始运用于疾病的病理诊断。
最近20多年来，该项技术得到飞速发展，特别 是绝大多数抗体能够应用在福尔马林固定的石蜡 切片上，因而大大促进了它在临床病理学上的应 用。
从开始发展至今，该项技术一直在基础医学和 临床研究中发挥重要作用,为疾病尤其是肿瘤性疾 病的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了强 有力的手段。
原暴露有一定的影响，但可进行抗原修 复，是免疫组化中首选的组织标本制作 方法。
常用染色方法
免疫组织化学技术按照标记物的种类不 同可分为： 1，免疫荧光法，标记物为荧光素，通 过荧光显微镜观察； 2，免疫酶法，以酶标记抗体，抗原抗 体反应后显色，通过光镜或电镜观察，目前 最常用； 3，其它如亲和组织化学法、免疫铁蛋 白法、免疫胶体金法及放射免疫自显影法等。
有如下基本特点：
1、特异性强 2、敏感性高 3、定位准确 4、形态与功能相结合
所用抗体及标本类型
所用抗体类型
常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗 体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分 泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免 疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的 抗原直接免疫动物后，从动物血中所获 得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所 产生的抗体混合物。
免疫组化技术在医学中的应用
免疫组化技术在医学中的应用免疫组化技术是一种生物学技术，是利用抗体和其他细胞和分
子标识特定分子和细胞组织的一种技术。
它的应用范围非常广泛，包括医学、生物学、遗传学、病理学、免疫学等领域。
在医学中，免疫组化技术主要用于疾病诊断、治疗和预后判断
等方面。
它可以对细胞和组织进行免疫染色，得到大量信息，如
细胞类型、分化程度、增殖状态、代谢状态、分泌状态等。
并且
还能够在分子水平上进行分析，如检查基因突变、蛋白质表达等。
在疾病诊断方面，免疫组化技术可以帮助医生诊断各种疾病和
病理状态。
例如，肿瘤组织标本可以用免疫组化技术检查癌细胞
的类型、分化程度、蛋白质表达等，有助于病理诊断和治疗选型。
另外，免疫组化技术还可以检测某些肿瘤抗原，如PSA、CEA等，在肿瘤早期筛查和诊断中有一定的应用。
在治疗方面，免疫组化技术可以帮助医生选择合适的治疗方案。
例如，HER2阳性乳腺癌患者可以接受靶向治疗药物，而HER2阴
性患者则不适用该药物。
免疫组化技术可以检测HER2表达情况，从而指导治疗。
在预后判断方面，免疫组化技术可以评估疾病预后。
例如，某些肿瘤组织标本中，如果出现Ki-67阳性细胞数量较多，那么预后可能不太乐观，治疗要足够积极。
此外，对于乳腺癌患者，ER、PR受体阳性与否也是评估预后的一个指标。
总的来说，免疫组化技术在医学诊断和治疗方面具有重要的应用价值，可以为患者的治疗和预后提供有力的支持。
未来，随着技术的不断发展，免疫组化技术的应用会越来越广泛，成为医学研究和临床诊疗中不可或缺的一部分。
免疫组化在医学中的应用
免疫组化在医学中的应用免疫组化技术是一种重要的生物医学检测手段，也是现代医学研究和诊断中不可缺少的工具之一。
贯穿着整个医学领域，免疫组化已经广泛应用于肿瘤学、病理学、免疫学、医学生物化学、分子生物学、分子遗传学等多个领域。
本文就免疫组化在医学中的应用进行一些讨论。
一、免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种基于免疫学原理的标记技术, 主要利用内生性和外源性抗体的亲和性和特异性相结合，通过染色方法来检测样本中感兴趣的蛋白分子或细胞标记。
利用常规的组织学或细胞学方法，采用特定的免疫抗体和检测试剂，通过可视化所特异结合的物质而进行定位，从而达到检测、定量和定位某些蛋白分子或其他生化分子的目的。
通过免疫组化技术，研究者可以检测出肿瘤标志物、病毒蛋白、暴露于抗原后细胞物质等等，有助于对一些疾病的了解和筛查，以及对疾病的诊断和治疗进行指导和支持。
二、免疫组化在肿瘤学中的应用免疫组化技术在肿瘤学中有着重要的应用。
在肿瘤病理组织实验室中，常用免疫组化检测肿瘤标志物，如 cytokeratin、CD68、E-cadherin、vimentin 等，以辅助肿瘤分类和分级、确定肿瘤原发部位和病程，在肿瘤治疗中也有很大的作用。
免疫组化技术还可以检测癌症中的分子标记物，为癌症诊断、分期、治疗和预后判断提供支持。
三、免疫组化在病理学中的应用病理组织学是诊断疾病的重要工具，在病理诊断中，免疫组化技术有助于鉴定病理组织中存在的各种蛋白质、生长因子等标记物，为疾病诊断和治疗提供帮助。
免疫组化检测也可用于证实是否存在所谓的免疫复合体沉淀，从而协助诊断自身免疫病和感染病。
四、免疫组化在免疫学中的应用在免疫学研究中，免疫组化技术扮演了至关重要的角色。
免疫组化技术可用于检测免疫相关蛋白和抗体，如抗原/抗体、CD3、CD8、CD20、FOXP3和CD68等，这些蛋白和抗体在了解免疫系统、生态演化、气味感知和抗体反应等方面扮演了重要的角色。
免疫组化技术在临床病理诊断中的应用
免疫组化技术在临床病理诊断中的应用第一章绪论免疫组化技术是现代生物医学研究中的一项重要技术。
它通过特异性抗体与组织样本中潜在的分子相互作用，从而在显微镜下定位、鉴定并定量分析特定的细胞和分子。
在病理学中，它已经成为一种最为有效的辅助诊断和筛查技术之一。
当前，病理学、肿瘤学和临床生化学等领域广泛应用免疫组化技术进行临床病理诊断和分子病理学研究。
第二章免疫组化技术的基本原理免疫组化技术的基本原理是通过特异性的抗体结合组织中的相应分子。
这些抗体分子与特定细胞类型或某些疾病状态的细胞产生的分子特异性结合，并产生一种细胞水平上的可视化标记。
通过将抗体标记与荧光物或染色剂一起使用，可以间接地分析和定量细胞分子的表达和定位。
使用免疫组化技术，可以在细胞水平上观察特定基因的表达，并通过增加对亚细胞结构和它们出现的联系的理解，解决特定细胞和组织的生物学性质中的疑点。
第三章免疫组化技术在肿瘤病理学中的应用在病理学中，免疫组化技术是一种常用的辅助诊断方法。
它可以评估细胞变异，对肿瘤的类型、分级、预后和预后预测有重要意义。
免疫组化技术已经用于对肿瘤组织的类型进行分类，如：鳞状细胞癌和腺癌。
它还可以检测代表一定细胞表面的抗原以确定肿瘤组织来源，例如使用CD20抗体进行B细胞Lymphoma的诊断，使用CD31抗体检测肿瘤血管的形成。
此外，免疫组化技术还用于肿瘤标志物的诊断和治疗。
某些肿瘤标志物可以作为肿瘤进展监测的指标。
例如，使用鳞状细胞癌抗原（SCC Ag）或癌胚抗原（CEA）等肿瘤标志物对肺癌的诊断和进展进行监测。
第四章免疫组化技术在免疫病理学中的应用免疫病理学是一种依靠遗传技术和分子生物学技术来改进临床诊断水平和治疗方法的病理学分支。
它研究自身免疫性疾病、感染疾病、变态反应及组织移植等领域，通过免疫组化技术实现对疾病的鉴定和随访。
在自身免疫性疾病中，免疫组化技术有利于检测存在于组织中针对自身组织分子的自身抗体。
在Februus Syndr来临现象中，免疫组化技术可以识别出成堆的IgG和C3沉积组织中的分子和细胞类型，从而诊断皮肌炎。
免疫组化技术在病理诊断中的应用
免疫组化技术在病理诊断中的应用1 免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种广泛应用于病理诊断的检测方法，它利用特异性抗体与组织标本中目标蛋白相互作用，从而能够检测出组织标本中特定蛋白的存在和分布情况。
该技术的基本原理是将已知特异性抗体标记在组织切片或细胞涂片上，形成复合物，再用酶学或光学等方法进行检测，从而确定蛋白质的存在性、定位、表达量及亚型等相关信息。
免疫组化技术广泛应用于病理诊断、细胞生物学、分子生物学等领域，对临床医生进行准确定位、病理分级和治疗方案的选择等方面起到了重要的作用。
2 免疫组化技术在病理诊断中的应用在病理诊断中，免疫组化技术可以根据肿瘤组织中的多个标志物进行识别和定位。
例如，在乳腺癌的诊断中，HER2、ER和PR等标志物的表达情况可以指导临床医生进行针对性的治疗。
在肺癌的诊断中，TTF-1和Napsin A等标志物的表达情况可以帮助鉴别原发性和转移性肺癌。
在淋巴瘤的诊断中，CD20和CD30等标志物的表达情况可以帮助鉴别不同类型的淋巴瘤。
因此，免疫组化技术在肿瘤组织识别和定位中具有重要作用。
除了肿瘤组织的诊断外，免疫组化技术在许多疾病的诊断中也起着重要作用。
例如，在肝病的诊断中，HBsAg和HCV抗体可以用于检测肝炎病毒感染情况。
在免疫性疾病中，抗核抗体和抗磷脂抗体可以用于诊断类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病，从而指导合理的治疗方案。
在肾病的诊断中，IgG、IgA和IgM等免疫球蛋白的表达情况可以用于鉴别不同类型的肾小球肾炎。
免疫组化技术可以成为一种可靠的工具，有助于诊断和治疗。
3 免疫组化技术的优缺点免疫组化技术的优点是可以提供高度特异性和灵敏度的蛋白检测。
它与常规病理检查相比，具有更高的准确性和敏感性，能够识别很小的组织病变和微小病理变化。
同时，免疫组化技术还可以提供蛋白表达的定位信息，有助于对组织基本结构和功能的理解。
免疫组化技术的缺点之一是存在假阳性和假阴性结果的可能性。
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宁德市医院病理科•Department of Pathology, Ningde City Hospital Affiliated to Fujian Medical University病理检验技术第十一章免疫组织化学技术和应用第一节免疫组织化学基本理论一、抗原（一）抗原的概念1.抗原（antigen，Ag）•指能刺激免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与相应的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合，发生免疫效应的物质。
•其基本性能：（1）免疫原性（2）抗原性（免疫反应性）表位或抗原决定基（簇）•抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。
（二）抗原的基本性质1.异物性（1）抗原与自身成分相异。
（2）自身物质：隐蔽或修饰的。
•异物：凡是胚胎时期未与免疫系统中免疫活性细胞充分接触过的物质。
Ag所属物种与宿主之间的亲缘关系越远异物性越强2.特异性•由抗原决定簇的性质、数量和构型决定。
3.理化性质•分子量大小•化学组成•物理状态•分子结构和易接近性表位或抗原决定基（簇）•抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。
（三）抗原的分类1.根据其基本性能分为（1）完全抗原：免疫原性+免疫反应性：细菌、病毒等（2）半抗原：只有反应性，+载体=完全抗原2.根据其化学组成分为•蛋白质、多糖、核酸抗原。
3.根据其刺激机体时是否需Th辅助分为（1）TD-Ag（2）TI-Ag4.根据其与机体的亲缘关系分为（1）异种抗原（xenoantigen）（2）同种异型抗原（alloantigen）（3）自身抗原（autoantigen）•隔离部位：脑组织、晶状体、精子等。
•改变或修饰的：感染、外伤、药物。
（4）异嗜性抗原（heterophile antigen）二、抗体（一）抗体的概念1.抗体（antibody，Ab）•是指机体受抗原刺激产生的并能与相应抗原特异性结合的球蛋白。
因它是免疫应答的产物，故又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。
2.分区（1）可变区（variable region，VR）（包含高变区）（2）恒定区（constant region，CR）（3）铰链区（hinge region）免疫球蛋白的分区（二）抗体的功能1.抗体的功能（1）特异性结合抗原（2）激活补体（3）结合某些细胞（4）通过胎盘和黏膜（三）人工制备的抗体1.多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）2.单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）•是由识别一种抗原决定簇的B淋巴细胞克隆所产生的均一性抗体。
McAb多采用B淋巴细胞杂交瘤技术生产。
•McAb具有性质纯、效价高、特异性强、少或无交叉反应等特点，广泛用于冰冻切片和石蜡切片。
3.基因工程抗体（genetic engineering antibody，GeAb）•人源化，降低了鼠源性McAb的免疫原性，均一性强。
三、抗原抗体反应（一）概念和反应原理1.抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）•是指抗原与抗体之间发生的特异性结合反应。
（1）体内表现为：吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素作用。
（2）体外可出现：凝集、沉淀、补体结合、中和等反应。
2.反应原理•抗原的决定簇与抗体的抗原结合部位之间具有结构互补性。
在适宜条件下，两者可特异性结合、出现肉眼可见的反应，或借助仪器能检测到反应结果。
•据此对待检品中的抗原或抗体进行定性、定量或定位的检测。
（二）反应特点1.高度特异性2.可逆性表面结合3.适当的浓度和比例4.反应的两个阶段性（1）第一阶段是抗原抗体的特异性结合阶段。
（2）第二阶段是可见反应阶段：凝集、沉淀等。
（三）抗原或抗体的检测方法1.凝集反应2.沉淀反应3.免疫标记技术（1）免疫荧光技术（2）免疫酶标技术（3）放射性核素技术（4）胶体金技术……•凝集反应：颗粒性抗原与抗体结合，在电解质存在下出现肉眼可见的凝集现象。
•直接凝集试验（三）切片•切片应薄而平整，一般厚度在3~5μm之间。
1.石蜡切片•与常规切片制备基本相同，应注意：（1）脱水、透明应在4℃以下进行，以减少抗原损失；（2）切片刀要锋利，切片应薄，可减少非特异性染色；（3）切片应放入37℃恒温箱过夜，以减少脱片；（4）如需长期保存，切片可放4℃冰箱内。
三、免疫组织化学常用液体及抗体的配制（一）常用液体的配制•0.01mol／L pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）•0.5mol／L pH7.6 Tris-HCl缓冲液•0.05mol/L pH7.6 Tris-HCl缓冲液（TBS）（二）抗体的稀释和保存1.影响抗体稀释度的因素2.抗体最佳稀释度的测定方法（1）直接测定法（2）棋盘（方阵）测定法（三）显色剂的种类及配制1. 3,3’-二氨基联苯胺（3,3’-Diaminobenzidine，DAB）2. 3-氨基-9-乙基卡巴唑（3-amino-9-ethlylcarbazde，AEC）3. 4-氯-1-萘酚（四）背景复染及复染剂1.背景复染2.复染剂（1）苏木素—石蜡切片（3）核固红—免疫金染色（2）甲基绿—冰冻切片五、抗原的修复（一）抗原修复的原因•抗原修复或暴露。
（二）常用的抗原修复方法1.酶消化法•胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素消化法。
2.物理化学法•单纯加热法、高压加热法、微波加热法。
第三节免疫组织化学的常用染色方法一、免疫组织化学常用染色方法•免疫组织化学的染色方法根据标记物的不同可分为三大类，即免疫荧光法、免疫酶标法、免疫胶体金银法。
每一类染色方法的基本原理相似，只是所用的标记物不同而已。
每一类染色均可分为直接法和间接法等。
•直接法操作步骤简单易行，但一种酶标抗体或金标抗体只能检测一种抗原，如需检测许多种抗原时，则每一种特异性抗体均需要进行酶标或金标，这是一项巨大而且繁琐的工作，且一旦特异性抗体进行酶标或金标后，其稳定性将有所降低，其效价也会随之降低，也不利于特异性抗体的保存，故直接法的应用受到限制。
•间接法只需标记一种抗体（即第二抗体），就可以检测许多种抗原成分，故间接法在临床上应用较广泛。
•免疫荧光法在诊断肾脏、皮肤的免疫性疾病上具有重要的价值。
但也存在着不足之处：①如需用新鲜冷冻组织进行检测，且敏感性和特异性较差；②所需特异性抗体用量较大；③背景着色不够清晰，常给确诊带来一定的困难；④因荧光强度随时间的延长逐渐减弱，故切片无法长期保存；⑤观察结果所用的荧光显微镜价格也比较昂贵等。
因此，使免疫荧光技术的推广和应用受到了很大的限制。
目前，逐渐被迅速发展起来的免疫酶标技术和免疫胶体金技术所代替。
二步法间接酶标法（1）染色原理•先用未标记的特异性抗体（一抗）与组织中的相应抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用酶标记的抗特异性抗体的抗体（二抗）与特异性抗体结合，形成抗原-特异性抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色，以显示抗原所在部位。
（2）染色方法1）常规石蜡切片经脱蜡、逐级乙醇到水。
2）PBS液冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。
3）用3%的过氧化氢甲醇液处理组织切片，室温下，湿盒内孵育10~30分钟。
4）PBS液冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。
5）需要进行抗原修复的，可根据需要采用酶消化法或物理化学法对抗原进行修复，修复完毕后，PBS液冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。
不需要进行抗原修复的组织切片，可直接进入下一步。
6）滴加适当稀释的动物非免疫血清，室温下，湿盒内作用10~20分钟，倾去多余的血清液体，擦干组织块周围多余的液体，不必冲洗。
7）滴加适当稀释的特异性抗体于组织切片上，放于湿盒内，4℃冰箱过夜或37℃温箱或室温下孵育30~60分钟。
8）PBS液冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。
9）滴加适当稀释的酶标记的抗体于组织切片上，放于湿盒内，37℃温箱孵育30分钟。
10）PBS冲洗三次，每次冲洗3~5分钟，冲洗完毕，用吸水纸擦干组织块周围多余的液体。
11）滴加新配制的DAB显色剂，室温下3~5分钟，显微镜下观察，当出现阳性结果，而背景清晰时，即可终止显色。
12）自来水冲洗，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
（3）染色结果•阳性部位呈现棕黄色-棕褐色颗粒。
ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶连接法）（1）染色原理•ABC法是利用卵白素与生物素之间具有高度亲和力这一生物学特性。
先将生物素与辣根过氧化物酶（HRP）结合，形成生物素化的HRP，再与卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素化的辣根过氧化物酶复合物，即ABC复合物。
先用生物素化的第二抗体与特异性一抗结合，再与ABC复合物连接，形成抗原-特异性一抗-生物素化二抗-ABC复合物。
最后用底物显色剂显色，以显示抗原所在部位。
SP三步法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）（1）染色原理•SP法的染色原理与ABC法相同。
只是用链霉菌抗生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素，即先将生物素化的辣根过氧化物酶与链霉菌抗生物素蛋白混合，形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物，即SP复合物。
再用生物素化的二抗，将特异性的一抗和SP复合物连接起来，形成抗原-特异性一抗-生物素化二抗-SP复合物。
最后用底物显色剂显色，以显示抗原的分布及含量。
二、免疫组织化学染色过程中的注意事项（一）正确设置阳性、阴性对照•在免疫组织化学染色过程中，有很多因素可影响到染色结果。
因此，对免疫组织化学染色结果的正确评价必须要有必要的对照，否则就不能作出正确的判断。
免疫组织化学染色常用的对照有阳性对照、阴性对照（空白对照、替代对照）、吸收试验、抑制试验和自身对照等。
其中在临床病理诊断工作中，应用最多、最普遍的是阳性对照和阴性对照。
1.阳性对照•是指用已经被证实了含有靶抗原的组织切片与待检组织切片一起做免疫组织化学染色，结果为阳性，称为阳性对照。
每一次染色都应设置阳性对照。
设置阳性对照的方法：可以使用自己平日工作中收集的阳性切片，也可以使用购买的同一厂家、同一批号抗体染色的阳性切片。
正确设置阳性对照的意义•是通过阳性对照证实：①靶抗原的存在并具有一定的活性；②染色步骤正确；③染色方法可靠；④各种试剂及抗体的浓度符合标准。
尤其是当阳性对照切片呈现阳性反应，而待检切片呈现阴性染色时，则可排除待检切片假阴性的可能。
•如阳性对照切片呈现阴性反应时，可能与阳性对照设置不正确（不含靶抗原），或抗原已被破坏，或抗体效价降低、失活，或染色方法及染色步骤有误等因素有关，说明本次染色无效。
2.阴性对照•是指用已知不含靶抗原的组织切片与待检组织切片一起做免疫组织化学染色，结果为阴性，称为阴性对照。