免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学
免疫组化ICH
② 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）
③ 抗体效价检测和抗体纯化
④ 标记抗体
⑤ 细胞和组织切片标本的制备 ⑥ 免疫组织/细胞化学反应和显色 ⑦ 观察和记录结果
抗体(antibody)
多克隆抗体(polyclonal antibody)
纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔） 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性不如单克隆抗体好，有时会造成一定的交叉反应，但灵敏度高于后 者。 能广泛用于石蜡包埋组织切片。
收波长为490nm，最大发射波长为520nm。
免疫荧光法分为直接法和间接法（二步法）。
二、免疫酶法
用酶标记抗体，在组织切片上进行特异的抗原
抗体反应后，用组织化学方法使标记的酶催化相应
的底物，生成有色产物，在显微镜下观察，可间接
地对抗原物质进行定位。标记抗体常用的酶有辣根
过氧化物酶、碱性磷酸酶等，以辣根过氧化物酶作 为标记物更常用。
石蜡组织切片中抗原性的修复：
A、化学方法： 胰蛋白酶（0.05～0.1% ，含0.1%CaCl2） 蛋白酶K B、物理方法 单纯加热法： 高压加热法： 微波方法： 柠檬酸盐缓冲液
2.4 常用免疫组织化学方法：
A、一步法 B、二步法 C、三步法 D、多步法
一、免疫荧光法
用荧光染料作为标记物，最常用的荧光素是异硫氰酸 荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)。将 FITC标记的特异性抗体和组织切片上的相应抗原结合， 在荧光显微镜下观察，FITC呈现黄绿色荧光，代表所 鉴定抗原的定位。FITC为黄褐色粉末或结晶，最大吸
ABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫组织化学(一)
免疫组织化学相关英文词汇及缩写
ABC， avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex，ABC复合物 FITC， fluorescein isothiocyanate，异硫 氰酸荧光素（在荧光显微镜下呈黄绿色荧光） TRITC，tetrametrylrhodarnine isothiocyante四甲基异硫氰酸罗丹明（在荧 光显微镜下呈橙红色荧光）
三抗孵育
PBS洗,33min DAB染色，苏木素复染
脱水封片
70%乙醇，5min 80%乙醇，5min 90%乙醇，5min 无水乙醇，5min 二甲苯，10min 2 取出切片，滴加30 μL中性树胶，用盖玻片 封片晾干后观察结果，进行分析统计。
组织化学结果图片
Journal Cell and Tissue Research(德国)
Histochemistry and Cell Biology (德国) Journal of Histochemistry & Cytochemistry (美国) Histology and Histopathology (西 班牙) Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology (美国) Cells Tissues Organs (瑞士) Acta Histochemica (荷兰) European Journal of Histochemistry (意大利) Folia Histochemica et Cytobiologica (波兰) Acta Histochemica et Cytochemica(日本)
DAKO Novocastra Serotec Zymed Santa Cruz Chemicon R&D Neomarker
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
免疫组织化学
免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法：简便、快速，用特异性标记荧光 的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗； 石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上， 湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去NaCl结晶。 (4)pH9.0甘油缓冲液〔磷酸盐〕封片。 〔必需无自发荧光，无色透亮 〕
▪ 2、扛酶抗体：抗体与酶的结合为抗原抗体 反响，避开了共价结合，爱护了酶和抗体 的活性。
标记酶选择标准：
★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被 光镜或电镜观看。
★ 酶反响产物须稳定，不集中，具有 良好定位。
★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
标本的固定与保存
好的固定剂除能满足一般组织学固定目 的外，还需要： 〔1〕能快速固定抗原 〔2〕防止抗原物质集中 〔3〕固定后的抗原能被抗体识别，不影响 抗原抗体反响
▪ 常用：10%福尔马林〔酸性〕、乙醇、丙酮、 甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛
▪ 混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘 酸-赖氨酸-多聚甲醛〔PLP〕固定液
免疫组织化学
把握内容
▪ 免疫组化的根本原理 ▪ 免疫组化的根本过程 ▪ 免疫组化的染色技术分类 ▪ 常用的免疫组化的染色原理和方法 ▪ 留意事项
免疫组织化学的根本概念 Immunohistochemistry 又称免疫细胞化学。它是组织化 学的分支，它是用免疫学原理〔特 异的抗原抗体反响〕来对组织内抗 原〔或抗体〕的分布进展原位检测
免疫组织化学技术在病理学研究中的应用
免疫组织化学技术在病理学研究中的应用病理学是研究疾病发生、发展和变化特点的一门学科，是现代医学研究的重要领域。
随着科技的发展和人们对疾病认识的深入，病理学研究的内容和技术手段也在不断变化和更新。
其中，免疫组织化学技术的应用越来越广泛，成为病理学研究中不可或缺的一个重要工具。
一、免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是一种利用抗体与相应抗原特异性结合的原理，通过一系列化学反应实现检测细胞、组织或器官中特定抗原分布及量的方法。
其基本原理是将具有特异性的抗体与需要检测的组织或细胞样本结合，再经过一系列的化学反应，使得需要检测的分子表达出最终的信号。
二、免疫组织化学技术已经广泛应用于病理学的研究中，有助于对疾病的诊断、预后和疗效评估做出更精确的判断和处理。
以下是几个典型的应用场景。
1.疾病诊断和鉴别诊断在疾病的诊断和鉴别诊断中，免疫组织化学技术可以帮助医生区分疾病类型和分子亚型。
例如，病理学家可以利用免疫组织化学技术来鉴别癌细胞和正常细胞之间的区别，判断该细胞属于哪种癌症类型及其分子表型，以便制定相应的治疗方案。
2.预后评估免疫组织化学技术还有助于帮助医生预测病人的预后。
一些免疫组织化学的蛋白质标志物，能够帮助预测疾病的复发和生存时间。
例如，HER2，是乳腺癌中一个非常重要的标志物，可用于预测病人的预后和治疗方案的制定。
3.研究疾病的发病机理免疫组织化学技术也广泛应用于研究疾病的发病机理。
例如，探究一些免疫相关的疾病，医生可以利用免疫组织化学技术来检测细胞中免疫相关分子的表达，如细胞因子、趋化因子、炎症介质等，以此来研究疾病的发生、发展及其治疗策略。
4.治疗效果评估免疫组织化学技术还可以用于治疗效果的评估。
例如，他汀类药物在病毒感染和白血病中的研究表明，该类药物可以抑制细胞中蛋白质酶活性，抑制病毒复制和细胞增殖。
利用免疫组织化学技术可以检测出药物治疗后免疫相关分子的差异，从而评估治疗的有效性。
三、免疫组织化学技术的局限性免疫组织化学技术并不是一种完美的技术，也存在着一些局限性。
免疫组织化学
报告人：傅琦博 指导老师：胡翊群ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
傅琦博 F0318102
何谓免疫组化
免疫组织化学是指在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织呈色 反应，借助可见的标记物，对相应 的抗原或抗体进行定位、定性和定 量检测的一种免疫检测方法。
傅琦博 F0318102
免疫组化的全过程
抗原的提取与 纯化
免疫动物或 细胞融合， 制备特异性 抗体及纯化
傅琦博 F0318102
荧光素
作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物
直接法
傅琦博 F0318102
间接法
标本的处理
组织材料处理是获得良好免疫细胞组织 化学分析的保障，必须保证要检测的细胞 或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保 存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。 ❖ 标本的主要来源：活体组织、各种体液、 穿刺液、培养细胞 ❖ 标本的固定与保存 ❖ 酶消化处理
傅琦博 F0318102
标本的固定与保存
固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内 酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态 与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应 的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在 染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。
好的固定剂： （1）能快速固定抗原 （2）防止抗原物质扩散 （3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应
傅琦博 F0318102
标本的固定与保存
抗原
各种抗原的固定
固定剂
固定温度与时间
蛋白质 免疫球蛋白 酶 激素 细菌 病毒
类脂质 细胞悬液
95％乙醇 丙酮 四氯化磺 1％聚甲醛 丙酮、甲醇 丙酮，无水乙醇 四氯化磺 10％甲醛 1％聚甲醛
室温，3～15min 4℃，30min 4 ℃ ，30min 4 ℃ ，4～5h 室温，3～10min 室温，5～10min 4 ℃ ，30～60min 室温，3～10min 室温，2min
免疫组织化学的一般步骤
免疫组织化学是一种用于研究组织中特定抗原或蛋白质表达的方法。
下面是免疫组织化学的一般步骤：
取材和固定：从感兴趣的组织或细胞中取材，常用方法包括活体组织切片或细胞培养。
然后将取得的样本进行固定，常用的固定剂有福尔马林和乙醛等。
抗原解露：将固定的样本进行抗原解露处理，以增强目标抗原的可见性。
常用的解露方法包括热解露、酶解露和抗原修复等。
阻断非特异性结合：在进行免疫染色前，需要使用适当的阻断剂或血清来阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果的产生。
抗体染色：将适当的一抗（特异性抗体）加入样本中，与目标抗原结合形成免疫复合物。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
通常会在该步骤中进行洗涤，以去除未结合的抗体。
二抗染色：添加与一抗宿主动物种类不同的二抗（标记有特定染色剂的抗体），使其与一抗结合。
二抗的标记剂可以是酶、荧光染料或金颗粒等，用于可视化免疫反应结果。
可视化：根据标记剂的性质，采用相应的方法对免疫反应结果进行可视化。
例如，使用底物来检测酶标记的二抗，或者直接观察荧光染料的发光信号。
染色和显微观察：在免疫反应完成后，可以对样本进行染色以增强对组织结构的观察。
最后，在显微镜下观察和记录结果。
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免疫组织化学傅琦博引言酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。
酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。
它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。
研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。
后者也被称之为免疫组织化学。
免疫组织化学概述免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。
这种技术称为免疫组织化学技术。
免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。
抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。
它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。
要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。
直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。
间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。
此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。
免疫组织化学技术的发展免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。
自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。
酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。
80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。
80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。
由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。
进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。
如原位杂交后信号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。
而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。
现就该技术的发展及其应用作一概述。
1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。
如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。
辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。
1991年梁国栋等通过免疫荧光技术首次从新疆分离到SiN 病毒。
1999 年陈振光等利用间接免疫荧光试验检测到福建宁化林区人群、野兔、狐狸、狗存在SiN 感染, 抗体阳性率分别为12. 86%、5. 88%、14. 29%、6. 45%。
因而判定福建宁化林区可能存在辛德毕斯热自然疫源地。
2抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术(A vidin B io t in 2Peroxidase Comp lex technique, 简称ABC 技术) 是H su 等于1981 年创立, 其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。
该方法简便、节约时间, 敏感性、特异性高, 背景染色淡。
由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力, 可用于双重或多重免疫染色。
如李月白等采用ABC 法研究发现绒毛层滋养细胞、绒毛中轴的基质细胞、毛细血管的内皮细胞、毛细血管腔内的淋巴细胞以及血岛细胞均表现为P 物质(SP) 受体免疫反应阳性, 阳性物质分布于胞质和胞膜上, 胞核呈阴性反应。
该研究为其对胎盘及胚胎发育的作用提供形态学依据。
张雅萍在ABC 法基础之上改进, 建立了生物素- 抗生物素- 过氧化物酶复合物( sABC) 法, 探讨了IL 28 在甲状腺肿瘤组织中的表达及意义。
3葡萄球菌蛋白A (Staphylococal P ro tein A , SPA 或SP) 具有免疫特性, 发展成为免疫学上一种极为有用的工具。
其优点是不受种属特异性的限制, 染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等。
故在目前各种免疫细胞化学技术中得到广泛的应用。
如肖华亮等[9 ]用此法检测、探讨骨肉瘤MDM 2 和p 53 蛋白定位、表达水平及相互关系和其对骨肉瘤转移及预后的影响。
应用SPA 与胶体金或铁蛋白相结合, 可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。
自Pomano 和Romano (1977) 首次报告用蛋白A -胶体金技术(P ro tein A 2Go ld technique, PGA 技术) 标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以来, SP 法已得到愈来愈广泛的应用, 并发展成为一种较为理想的免疫电镜技术。
4碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶方法(简称A PAA P 法) 克服了辣根过氧化酶(HRP) 的不足。
沈岩等用A PAA P 法结合单克隆抗体(mA b) KL 21 (广谱抗人细胞角蛋白, 德国) 比较分析不同肿瘤细胞间同种细胞凝集力、靶器官定植力、细胞增殖和细胞凋亡现象、癌基因及肿瘤相关抗原表达等生物学特征。
进一步明确肿瘤细胞相关生物学特性与肿瘤细胞转移能力间的关系。
而链霉素亲和素(St rep tavidin, SA ) 具有高度的亲和力, 利用生物素结合的二抗与酶标记的SA 亲和(L SAB 法) 是免疫组化中非常有用的方法。
沈靖南等采用该法, 检测84 例骨肉瘤中p2糖蛋白(p 2gp ) 表达, 半定量化计量p2gp 的着色强度及阳性率, 通过多因素相关分析和生存分析, 探讨骨肉瘤预后的相关因素和高危因素, 研究骨肉瘤多药耐药性的表达与预后, 并证实p2gp 介导骨肉瘤的MDR 现象, 明确p2gp 表达与肺转移的关系。
5凝集素( (Phytoagglut in, PHA ) 作为一种探针研究细胞膜上特定的糖基, 具有多价结合能力。
直接将标记物标记在凝集素上, 再与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合, 该法简便, 但灵敏性不够高。
经研究发现将凝集素直接与切片中的相应糖基结合, 可提高敏感性高5～ 10 倍或更多一些, 有人认为若将凝集素与特定的糖基作成三明治样的糖2凝集素2糖的结合物, 特异性、灵敏度将会更高。
而且能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合, 从而在光镜与ö或电镜水平显示其结合部位。
N ewman 等(1979)以荧光素标记凝集素PHA 实验, 发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。
Kivela 和Farkkanen (1987)用凝集素作为细胞特殊类型的标记实验发现, 在人视网膜上PHA 标记视锥细胞而不标记视杆细胞。
在乳腺、乳腺上皮细胞呈PHA 阳性反应, 而肌上皮细胞和间质细胞呈PHA 阴性反应。
他以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明, 刀豆素A 和蓖麻素存在于肾脏的各部, PHA 和双花扁豆凝集素(DBA ) 主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞, 荆豆凝集素(U EA ) 主要分布在血管内皮细胞, 而麦芽素分布在肾小球。
St reit 和Kreutzberg (1987)发现Griffonia Simp licifo lia 凝集素能特异性标记面神经节内的小胶质细胞, 而其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞(A st ro2cyte) 等都显示阴性反应。
如果在切断面神经后, 增殖的小胶质细胞对Griffonia Simp licifo lia 凝集素的反应加强。
大量研究发现, 凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。
如张华忠等(1987)报道115 例胃癌标记PHA 阳性率高达90. 43% , 而正常胃粘膜基本是阴性, 故认为PHA 是胃癌的诊断性标志。
BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79% , 而对良性病变均呈阴性反应,提示BSA 可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。
HRP 本身虽含有甘露糖, 能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。
但对其它的凝集素, 需要将糖基化(Glyco sylat ion) 过氧化物酶结合到该凝集素上, 且糖基化过氧化物酶品种尚有限, 故目前本法在应用还有一定困难。
免疫细胞化学技术尚在继续改进和完善中, 除目前国内外已广泛应用的免疫金技术和免疫金银技术外, 新的免疫细胞化学技术不断出现。
1984 年国外学者首次将CRNA 探针应用于原位杂交, 核酸探针为单链的RNA 分子, 产生自具有质粒逆转录系统的cDNA 克隆。
在1987 年Wo lf 等建议插入确定长度的寡核苷酸至载体内产生cRNA 分子, 这种cRNA 分子称为“寡核苷酸核酸探针”(o ligo ribo－p robes) , 现在已被广泛的用于原位杂交实验。