免疫组织化学及其应用
免疫组织化学技术在乳腺癌诊断中的应用
免疫组织化学技术在乳腺癌诊断中的应用乳腺癌作为女性常见的恶性肿瘤之一，早期诊断对于治疗和预后至关重要。
传统的组织学检查方法虽然能够提供一定程度上的诊断信息，但其对于乳腺癌亚型、分子标志物等方面的识别和鉴定还存在一些局限。
在这种情况下，免疫组织化学技术应运而生，并且在乳腺癌的诊断中发挥着重要作用。
免疫组织化学技术以特异性抗体与需要检测的抗原相结合，并通过染色或荧光信号来实现对抗原的可视化检测。
借助于该技术，可以快速、精准地分析乳腺癌相关标志物在肿瘤组织中的表达情况。
以下将从多个角度阐述免疫组织化学技术在乳腺癌诊断中的应用及意义。
1. 亚型鉴定免疫组织化学技术可以根据不同标志物在肿瘤组织中的表达情况，帮助确定乳腺癌的亚型。
目前已知的乳腺癌亚型包括雌激素受体（ER）阳性、孕激素受体（PR）阳性和人类表皮生长因子受体2（HER2）阳性。
这些亚型对于治疗方案的选择和预后预测具有重要意义。
利用免疫组织化学技术，可以通过检测ER、PR和HER2在肿瘤组织中的表达水平，准确地识别乳腺癌亚型，从而指导临床治疗。
2. 分子标志物筛选除了上述传统的亚型识别标志物外，免疫组织化学技术还可以用于筛选新的分子标志物，进一步完善乳腺癌的分类、诊断和预后评估系统。
例如，通过对乳腺癌相关信号通路的成员进行筛选并应用免疫组织化学技术进行检测，可以发现与肿瘤发生、发展密切相关的新特异标志物。
这些新标志物可能成为今后乳腺癌早期诊断和靶向治疗领域的重要突破口。
3. 预测预后与治疗反应免疫组织化学技术还可以帮助预测乳腺癌患者的预后以及对治疗的反应。
通过检测肿瘤组织中一系列与恶性程度、复发率和转移率相关的标志物，可以为医生提供更详细、准确的预后评估指导，并制定个体化的治疗方案。
例如，素材上固有地选择阳性或阴性的从染色酶和这些针对不同抗原在肿瘤组织中表达强度及比例观察和评估其阳性或阴性表达情况和程度。
4. 指导手术边界确定乳腺癌手术切除术是常见的治疗方式之一。
乳腺癌的免疫组织化学诊断技术
乳腺癌的免疫组织化学诊断技术乳腺癌是发生在乳腺组织中的一种常见的恶性肿瘤。
据统计，乳腺癌是女性最常见的癌症之一，但男性也有可能罹患乳腺癌。
随着医学技术的进步，人们现在能够利用免疫组织化学诊断技术来提高乳腺癌的早期诊断和治疗效果。
本文将介绍乳腺癌免疫组织化学诊断技术的原理、应用和前景。
一、免疫组织化学诊断技术原理免疫组织化学诊断技术是基于免疫学原理开发的一种病理学检测方法。
它利用特异性抗体与特定抗原间的免疫反应来检测乳腺癌组织中的特定蛋白质表达。
具体来说，乳腺癌标记物如雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体2（HER2）等，可以通过免疫组织化学染色技术在病理切片上显示出颜色。
二、免疫组织化学诊断技术的应用1. 乳腺癌的分类和分级：免疫组织化学诊断技术可以根据肿瘤细胞表达的不同标志物来确定乳腺癌的分子分型，如激素受体阳性乳腺癌和HER2阳性乳腺癌等。
这有助于医生制定个体化治疗方案。
2. 乳腺癌的预后评估：乳腺癌的预后与肿瘤细胞的分级密切相关。
通过免疫组织化学染色技术，可以评估肿瘤细胞的增殖指标、侵袭能力和转移倾向，从而预测乳腺癌患者的预后。
3. 治疗效果的评估：乳腺癌的免疫组织化学诊断技术还可以用于评估患者接受治疗后肿瘤细胞的反应，如细胞凋亡和细胞增殖调节因子的表达情况。
这有助于医生判断治疗效果和调整治疗方案。
三、免疫组织化学诊断技术的前景随着科技的不断发展，免疫组织化学诊断技术在乳腺癌的诊断和治疗中的应用还有很大的发展空间。
未来，我们可以期待以下几个方面的进展：1. 多个标志物的联合检测：目前，乳腺癌的诊断和治疗往往只依赖单一标志物的检测。
然而，乳腺癌的发展往往是由多个因素共同作用导致的。
因此，将多个标志物的检测结果进行综合分析，可以提高乳腺癌的诊断准确性和治疗效果。
2. 新的标志物的发现：虽然目前已经发现了一些与乳腺癌相关的标志物，但仍然有许多未知的标志物等待发现。
未来的研究可以侧重于寻找新的标志物，来更加全面地评估乳腺癌的分型和预后。
免疫组化
• 注意事项： • （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 • （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏， 可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液， 然后于皿中加入高一级脱水剂。 • （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软， 助长材料的解体。 • （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则 会使组织变脆，影响切片。 • （5）如需过夜，应停留在70%酒精中。 • （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色 混浊现象。
• 1.4．透明 • 透明的目的是将脱水剂从材料中除去，使材料 透明，增记折光系数；同时便于下步的浸蜡和 包埋等程序。 • 常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也是 逐级进行，可减少材料收缩。 • 步骤为：纯酒精、二甲苯等量混合液15min， 二甲苯Ⅰ15mi意事项 • （1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空 气中的水分进入。 • （2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为 了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 • （3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾 状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精 中重新脱水，然后再透明。
2)100% 无水酒精： 2 次/5 min；
3)95% 酒精 2 min；
4)80% 酒精 2 min；
5)70% 酒精 2 min；
6)蒸馏水:5 min；
具 体 操 作
7)PBS 洗 3 ×3 min。
免疫组化实验
2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶
(1)细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内 进行结合反应。一般用Triton X-100、 蛋白酶k等通透液。
免疫组化实验
(2)封闭内源性过氧化酶
免疫组织化学染色技术
病毒载量评估
染色技术可以定量检测组织中病毒的数量，有助于评估病毒复制 活跃程度和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他感染性病变进行鉴别诊断，有助于确定病因 和治疗方案。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
通过染色技术可以检测组织中自身抗体的存在， 有助于诊断自身免疫性疾病。
炎症反应评估
染色技术可以反映组织炎症反应的程度和范围， 有助于判断病情进展和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他非自身免疫性疾病进行鉴别 诊断，有助于确定病因和治疗方案。
药物靶点筛选
药物作用机制研究
染色技术可以用于研究药物的作用机制和靶点，有助于发现新的治 疗方法和药物。
药物筛选
染色技术可以用于筛选具有潜在治疗作用的候选药物，有助于降低 药物研发成本和时间。
床常用指标。
病毒检测案例
总结词
免疫组织化学染色技术可用于病毒的快速检测和鉴定， 具有高灵敏度和特异性。
详细描述
在病毒检测中，该技术常用于检测病毒抗原或抗体，以 确定病毒的存在和感染程度。例如，在COVID-19诊断 中，通过免疫组织化学染色技术检测病毒抗原，有助于 快速确诊和防控疫情。
自身免疫性疾病诊断案例
未来展望
随着蛋白质组学、基因组学等领域的快速发展，免疫组织 化学染色技术将继续发挥重要作用，并有望在临床诊断、 药物研发等领域取得更多突破。
02
免疫组织化学染色技术的基本步 骤
样本准备
样本类型
组织样本、细胞样本等，要求新鲜、无菌、无杂质。
样本处理
清洗、切割、固定等，确保样本的稳定性和染色效果。
免疫组织化学在癌症诊断和治疗中的应用研究
免疫组织化学在癌症诊断和治疗中的应用研究免疫组织化学在癌症诊断和治疗中的应用研究摘要:癌症是全球范围内导致死亡的主要疾病之一。
免疫组织化学技术的发展为癌症的诊断和治疗提供了重要的工具。
本文旨在探讨免疫组织化学在癌症诊断和治疗中的应用。
首先，介绍了免疫组织化学的基本原理和技术方法。
然后，分析了免疫组织化学在癌症诊断中的应用，包括免疫组织化学在癌症分型、分级和预后评估中的作用。
接着，探讨了免疫组织化学在癌症治疗中的应用，包括免疫组织化学在靶向治疗和免疫治疗中的作用。
最后，总结了免疫组织化学在癌症诊断和治疗中的应用前景和挑战。
关键词: 癌症，免疫组织化学，诊断，治疗一、引言癌症是一类普遍存在于人类社会的疾病，具有高发病率和死亡率的特点。
近年来，虽然医学科技的发展和治疗方法的进步取得了一定的成果，但癌症治愈率仍然极低。
因此，对于癌症的早期诊断和有效治疗具有重要意义。
免疫组织化学是一种通过检测特定抗原在组织或细胞内的表达情况，从而进行疾病诊断和预后评估的方法。
该技术基于特定抗体与其靶标结合的原理，利用染色剂或显色剂将靶标标记出来，并通过显微镜观察和分析靶标在组织或细胞内的表达情况。
免疫组织化学技术具有高灵敏度和特异性的优点，广泛应用于癌症的诊断和治疗。
二、免疫组织化学的基本原理和技术方法免疫组织化学技术的基本原理是利用抗体与其靶标结合的特异性，对组织或细胞内的靶标进行检测和定位。
通常，该技术包括以下步骤:1. 组织取材: 在进行免疫组织化学检测之前，需要从患者身体中获取组织样本。
常用的组织样本包括手术切除的肿瘤组织、穿刺活检样本等。
2. 切片制备: 将组织样本固定、包埋和切片，以便后续的染色和染色观察。
3. 抗原修复: 组织样本经过切片后，需要进行抗原修复处理。
这一步骤的目的是恢复组织样本中的抗原的空间结构，以便抗体能够更好地与其靶标结合。
4. 抗体孵育: 将特异性抗体与样本中的靶标进行孵育反应。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择取决于实验的目的和需求。
免疫组化ICH
② 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）
③ 抗体效价检测和抗体纯化
④ 标记抗体
⑤ 细胞和组织切片标本的制备 ⑥ 免疫组织/细胞化学反应和显色 ⑦ 观察和记录结果
抗体(antibody)
多克隆抗体(polyclonal antibody)
纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔） 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性不如单克隆抗体好，有时会造成一定的交叉反应，但灵敏度高于后 者。 能广泛用于石蜡包埋组织切片。
2．免疫组织化学的相关理论和技术
2.1
免疫组织化学的工作原理
抗体与其抗原特异性结合
通过化学反应使特异性抗体标记上显示剂，如酶，金属 离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 借助光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色 或电子密度等变化，从而确定抗原在组织、细胞内的定 位和含量。
2.2 免疫组织化学的全过程包括：
亲和免疫组化
葡萄球菌蛋白A（SPA法）：用SPA代替桥抗体 卵白素－生物素过氧化物酶复合物法 (Avidin
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一
Biotin-peroxidase Complex, ABC) 生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合， 形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成
常用的免疫酶（染色）方法
免疫酶标法
非酶标法：PAP法
PAP法主要染色原理 ： 用第二抗体作“桥梁”， 既与第一抗体结合，再与PAP 复合物联接，最后用底物显色 剂显色。
抗原与抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制， 但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持 一定比例。 在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因 此不能出现肉眼可见的反应。 （BIG BEE现象）
化学免疫与免疫化学
化学免疫与免疫化学免疫是生物体对抗外界致病因素的一种重要机制，而免疫化学则是将化学技术应用于免疫学领域的一门学科。
化学免疫研究免疫反应的化学基础，探索免疫机制与免疫系统的关联。
本文将介绍化学免疫和免疫化学的基本概念、方法及其在生物医学领域的应用。
一、化学免疫的基本概念1. 免疫学基础免疫学是研究生物体对抗外界致病因素的科学，包括免疫反应的机制与调控，以及免疫系统的结构与功能等。
通过免疫反应，生物体能够识别并清除入侵的病原体，维持身体内环境的稳定性。
2. 化学免疫的定义化学免疫是将化学技术应用于免疫学研究的一种手段。
它利用化学试剂与免疫学标志物相互作用，通过定量或定性的方法来研究免疫反应的分子基础、过程和调控机制。
3. 免疫化学的基础免疫化学是免疫学领域的一个重要分支，它主要研究抗原与抗体之间的相互作用，以及免疫标记物的检测与鉴定等。
免疫化学的方法包括免疫印迹、免疫荧光、酶联免疫吸附法等。
二、化学免疫的方法与技术1. 免疫检测方法（1）免疫印迹技术：利用免疫印迹方法，可以检测与特定抗原结合的抗体。
将样品中的蛋白质分离并转移至固定膜上，然后使用特异性抗体与目标抗原结合，通过显色或发光手段来检测抗原-抗体复合物。
（2）免疫荧光技术：免疫荧光技术是将标记有荧光物质的抗体与样品中的抗原进行特异性结合，从而通过荧光显微镜观察到抗原的分布和表达情况。
该技术广泛应用于免疫组织化学、细胞定位等方面。
（3）酶联免疫吸附法（ELISA）：ELISA是一种高灵敏度、高特异性的免疫测定技术，常用于检测抗原或抗体的含量，以及抗原-抗体相互作用的强度。
通过酶标记的抗体与目标物结合，并通过底物的酶催化反应来测定目标物的存在量。
2. 免疫化学技术（1）蛋白质分离与纯化：通过离心、电泳、超滤等手段，将复杂的蛋白质混合物分离成单一组分，以便进行后续的免疫检测或分析。
（2）抗体的制备与标记：通过免疫动物或基因工程等方法获得特异性抗体，并通过标记的方式使其具有可视化或检测性质。
免疫组织化学检测在乳腺病理诊断中的价值
免疫组织化学检测在乳腺病理诊断中的价值1. 免疫组织化学检测在乳腺癌诊断中的应用乳腺癌是乳腺组织恶性病变的一种，具有高度异质性和侵袭性。
免疫组织化学检测可以通过检测肿瘤标志物在肿瘤细胞中的表达情况，帮助确定肿瘤类型、分级和分子亚型，对乳腺癌的诊断和治疗具有重要的指导意义。
通过检测雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体2（HER2）的表达情况，可以帮助确定患者的内分泌治疗和靶向治疗的方案，从而提高治疗的有效性和预后。
乳腺病理诊断中，往往需要鉴别良恶性肿瘤，尤其对于一些较难鉴别的病例，免疫组织化学检测可以通过检测不同标记物的表达情况，帮助鉴别良恶性肿瘤。
在乳腺纤维瘤和纤维腺瘤的鉴别诊断中，通过检测细胞角蛋白、平滑肌肌动蛋白、骨架蛋白等标记物的表达情况，可以帮助鉴别病变的来源和性质，对指导患者的治疗具有重要的意义。
乳腺癌是一种具有高度异质性的疾病，对患者的预后影响因素也非常复杂。
免疫组织化学检测可以通过检测肿瘤相关标记物在肿瘤细胞中的表达情况，帮助评估患者的预后。
通过检测Ki-67（肿瘤细胞增殖指数）、P53（抑癌基因突变）等标记物的表达情况，可以帮助评估患者的预后情况，指导患者的治疗和随访。
乳腺癌分子靶向治疗是目前乳腺癌治疗的重要手段，但是对于患者的分子亚型和靶向分子的表达情况要求较高。
免疫组织化学检测可以通过检测HER2、PD-L1等靶向分子的表达情况，帮助确定患者的分子亚型和靶向治疗方案，提高治疗的有效性和减少不必要的治疗。
免疫组织化学检测在乳腺病理诊断中发挥了重要的作用，但也面临一些挑战。
免疫组织化学检测的标记物选择、试剂的品质、操作的标准化等，都对检测结果产生影响。
未来，随着生物技术的不断发展和进步，我们有望开发出更加有效的标记物和检测方法，提高免疫组织化学检测的准确性和可靠性。
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免疫组织化学及其应用浙江大学病理学与法医学研究所周韧1．免疫组织化学的历史、现状和发展1．1．历史●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当时科学与技术发展的相应水平上的.●医学的目的: 解除人体的病痛●核心: 诊断和治疗。
任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。
●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。
更准确、更可信、更有权威性。
●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。
病理诊断发展过程的主要事件年代作者事件1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书1829年 Horner 首篇病理论文1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文1858年Virchow 发表《细胞病理学》1863年 Paget 发表《外科病理学》1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》1919年 Ewing 发表《肿瘤病》1924年 McFarland 发表《外科病理学》1926年 Karsner 发表《人体病理学》1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书1951年电镜应用于病理诊断1974年免疫组化用于病理诊断●诊断病理学开始于19世纪●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。
随之而起的电子显微镜●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。
1．2．免疫组织化学的发展1．2．1．免疫学的发展1．2．2．单克隆技术的出现●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。
常规苏木素伊红（HE）染色几百种的“特殊染色”●免疫组织化学产生：抗原抗体结合原理●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。
主要的发展过程年代研究者事件1941年 Coons 实用免疫荧光技术1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术1970年 Sternberger 抗体酶标记技术1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术1981年 Hsu ABC法90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免疫组化法诊断免疫组化●开始于70年代，●发展高峰是80年代，●90年代已在国外病理科列入病理技术室的常规工作。
●国内病理科约晚10年的进程，90年代开始在诊断病理工作中普及。
2．免疫组织化学的相关理论和技术2．1．免疫组织化学的工作原理●已知的特异性抗体或抗原能特异性结合●通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色）●借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构抗原和抗体抗原(antigen)1、全抗原(complete antigen)2、半抗原(hapten)抗体(antibody)多克隆抗体(polyclonal antibody)●纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔）●多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
●特异性不如单克隆抗体好，有时会造成抗体的交叉反应●但能广泛用于石蜡包埋组织切片。
原因是单克隆抗体(monoclonal antibody)●单克隆抗体是针对一种抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。
●大多数为小鼠。
其优点为特异性强、抗体产量高。
●单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇，这一抗原决定簇可以是抗原分子上的无关抗原决定簇，●在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。
●单克隆号的来源总之，任何一种免疫组织化学方法，欲获得令人满意的染色结果，除该方法本身所具有的特点（高度敏感）外，还必须选择具有高度特异和稳定的优质抗体。
（三）抗原与抗体的关系抗原引起机体产生免疫反应决定免疫反应的特异性产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质利用抗体可以检测抗原物质（四）抗原与抗体的反应免疫反应血清学反应。
1、抗原与抗体的结合是高度特异性的结合在一定的条件下可以解离。
2、一个抗体分子有两个抗原结合点（称两价）一个抗原的分子上则可有许多个结合点（称为多价）。
3、抗原的抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制，但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持一定比例。
在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。
（BIGBEE现象）2．2．免疫组织化学的应用范围及优点：2．2．1．应用范围：(1)提高病理诊断准确性(2)对疾病的预后和治疗的意义激素(3)癌基因蛋白的应用(4)对肿瘤增生程度的评价(5)微小病灶的发现微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）(6)在肿瘤分期上的意义(7)指导肿瘤的治疗(8)免疫性疾病的辅助诊断(9)病原微生物的检测2．2．2．免疫组化优点：(1)特异性强(2)敏感性高(3)定位准确、形态与功能的结合3．免疫组织化学的常用方法3．1．标本的预处理取材：（原则上）三对照，常用两对照（内对照）保存：-40℃～-80℃固定玻片处理：3．2．抗原修复：抗原破坏的原因抗原修复方法A、化学方法：胰蛋白酶proteinaseB、物理方法单纯加热法：高压加热法：微波方法：（幻灯）柠檬酸盐缓冲液C、修复方法的评价CSA法 1:50 IgDCSA法 1:200 IgDCSA法 1:500 IgDCSA法 1:1000 IgDCSA法 1:5000 IgD3．3．常用免疫组织化学方法：A、一步法B、二步法C、三步法D、多步法间接法金银法PAP和BigBeeAPAAPABC法EnVision法BT法（CSA：Catalyzed signal amplification）1:50、1:200、1:500、1:500、1:1000、1:5000、1:5000, 1:106B、二步法C、三步法PAPAPPAPD、多步法E. ABC法F. EnVisionG. CSA法（Catalyzed signal amplification）BT法CSA原理图CSA法 1:50 IgDCSA法 1:200 IgDCSA法 1:500 IgDCSA法 1:1000 IgDCSA法 1:5000 IgDH. 免疫组化在细胞凋亡检测中的应用TUNEL法检测凋亡（ Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP nick-end-labling ）TdT介导的dUTP缺口末端标记TUNEL染色：直接法参照德国宝灵曼公司原位末端标记试剂盒操作手册，其主要步骤如下：（1）切片脱蜡至水，双蒸水、PBS液洗；（2）微波处理：切片置于盛有枸椽酸缓冲液（0.01M，PH6.0）的容器中微波加热. （3）PBS液洗 5min×3次；（4）每张切片滴加20ug／ml蛋白酶K液，放于湿盒中37℃孵育15min；（5）切片置于0.3%H2O2-甲醇液中室温放置20-25min；（6）滴加TUNEL反应混合液，37℃湿盒中孵育60-90min；TUNEL反应混合液主要成分：Bio-11-dUTPTdT酶（7）PBS液洗5min×3次；（8）滴加链霉菌素—辣根过氧化物酶液（用PBS液稀释成1:200）37℃湿盒中孵育30min，（9）滴加新鲜配制的DAB-H2O2液，镜下观察2-10min显色；（10）自来水充分洗涤；photoesI. 免疫组化在原位杂交中的应用3.4 重要的染色步骤的要点重要的染色步骤的要点：ABC法（卵白素—生物素—过氧化物酶连结法）ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。
用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC复合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗—ABC。
最后用底物显色剂显色。
步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后；(2)PBS冲洗，5min×3次；(3)3%过氧化氢甲醇溶液，20min；(4)PBS冲洗，5min×3次；(5)每张切片滴加非免疫动物血清20min；(6)每张切片滴加第一抗体，60min；(7)PBS冲洗，5min×3次；(8)每张切片加滴加生物素化二抗，60min；(9)PBS冲洗，5min×3次；(10)每张切片滴加ABC复合物，60min；(11)PBS冲洗，5min×3次；(12)新鲜配制的DAB溶液，3～10min；(13)自来水冲洗，复染，中性树胶封固。
PAP法用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，再与PAP复合物联结，最后用底物显色剂显色。
步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后；(2)PBS冲洗，5min×3次；(3)3%过氧化氢甲醇溶液，20min；(4)PBS冲洗，5min×3次；(5)每张切片滴加非免疫性动物血清，20min；(6)每张切片滴加第一抗体，60min；(7)PBS冲洗，5min×3次；(8)每张切片滴加第二抗体，60min；(9)PBS冲洗，5min×3次；(10)每张切片滴加PAP复合物，60min；(11)PBS冲洗，5min×3次；(12)新鲜配制的DAB溶液，3～10min；(13)自来水中洗，复染，中性树胶封固。
SP法（链霉菌抗生物素蛋白─过氧化物酶连结法）用链霉菌抗生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素蛋白即形成SP法。
染色原理同ABC法。
国外其他公司亦将此法注册为LSAB法，LAB-SA法和SABC法等。
因SP最早建立和报道，其标记技术不断提高，以其稳定染色时间比同类方法短和价格较低而在我国逐渐普及。
步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后；(2)PBS冲洗，5min×3次；(3)3%过氧化氢甲醇溶液，10min；(4)PBS冲洗，5min×3次；(5)每张切片加1滴或50μl非免疫性动物血清，10min；(6)每张切片加1滴或50μl的第一抗体，60min；(7)PBS冲洗，5min×3次；(8)每张切片加1滴或50μ生物素标记的第二抗体，10min；(9)PBS冲洗5min×3次；(10)每张切片加1滴或50μl链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，10min；(11)PBS冲洗5min×3次；(12)每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10min；(13)自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。