10免疫组织化学检测技术
免疫组化
什么是免疫组化免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
（一）免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。
免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。
HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。
下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。
修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。
根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。
8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。
常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
免疫组化技术常见问题及处理方法
石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
免疫组化技术常见问题及处理方法
SP法
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
免疫组化技术常见问题及处理方法
Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一
化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 • 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或
免疫组化PPT课件
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未封闭内源性过氧化物酶
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胃固有膜腺体
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3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
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五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
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Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
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抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
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（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector
免疫组化技术
组织学切片制作
石蜡切片：观察组织细胞结构的理想方法
较好的保持组织细胞的形态结构 切片有连续性 长期存档，供回顾性研究 由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交
探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到 的颜色/形态都较冰冻切片好。 抗原的保存量不如冰冻切片。
抗原修复
化学方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶
优点：此方法由于微波场内极性分子、离子高速 运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复 正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对 抗原再现效果好。
抗原修复
高压加热法暴露抗原 ：将玻片浸入抗原修复液 内，置高压锅中高压 2～3min，可取得极好的效 果。
优点：由于高压下受热均匀，特别适用于大批量 标本的染色。 应用于一些较难修复的抗原。
量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中
生物素——抗生物素染色法最常用（ABC法）。
常用的染色方法
免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。
• 基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞 或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗 原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发 出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的 定位，进而还可进行定量分析。
加热方法 水浴加热法 微波照射法 高压加热法
抗原修复
化学方法 :主要是通过一些酶的作用，使抗原决 定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
•胰蛋白酶：主要用于细胞内抗原的显示；-：一 般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37 度 10～40min， •胃蛋白酶：主要用于细胞间质抗原的显示。一般 使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37 度30～ 180min， 例如：Laminin、CollagenIV
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第十三章免疫组织化学技术
第十三章免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。
减少对组织标本的损伤与挤压。
2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。
（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。
标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。
2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。
组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。
3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。
首选冷冻切片。
其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
免疫组织化学技术
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脱水： 常用脱水剂： （1）非石蜡溶剂的脱水剂：酒精
70%酒精开始逐渐过度到无水已醇
（ 70%-80% 酒精可以作为组织的长久保存液）
入 二甲苯
（2）脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：正丁醇、叔丁醇
每次更换新的脱水剂， 把组织放到吸水纸上吸
甲醛：10ml
苦味酸饱和水溶液(0.9) 75ml
蒸馏水：90m(2)中性缓冲甲醛固定液：
多聚甲醛： ４g
蒸馏水： 100ml
NaH2PO4.H2O: 4g
Na2HPO4:
6.5g
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标本固定
目的： ➢防止细胞、组织溶解及腐败，以保持细 胞与生活时的形态相似。 ➢ 物质定位在原有部位。 ➢经固定产生不同折光率，及对染料的不 同亲和力，利于着色。 ➢固定剂还有硬化作用。 对象：蛋白质
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取材
*准确，快速，完整，有代表性 动物标本： -大型动物：快 -小型动物：灌注固定
-手术标本：尽量包括病灶部位/病灶与正常组织 交界处/病灶周围正常组织
体外培养的细胞标本： -贴壁生长细胞：爬片 -悬浮生长细胞：离心沉淀涂片
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标本固定
目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产 生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。 (1)常用的固定液： (3)Bouin液
6.5g
(3)Bouin液
苦味酸饱和水溶液(0.9%-
1.2%)
75ml
甲醛 冰醋酸
25ml 5ml
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固定注意事项 1 固定时间要快 2 固定液的用量为组织块体积的15-20倍 3 固定时间 4 固定液避光，以免发生化学变化
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四、几种常用的免疫组化检测技术
荧光： 在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能 发出较激发光波长更长的可见光并随照射停 止而消失。 荧光显微镜： 荧光显微镜的光源提供各种激发光，如紫外 光、蓝紫光（有不同的波长范围），使受检 标本内的荧光物质发出发射光。
四、几种常用的免疫组化检测技术
海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触)
三、免疫组化的全过程
3、免疫染色
⑵非特异吸附法 免疫组化技术中非抗原抗体反应出现 的阳性染色成为非特异性染色。防止非 特异性染色的有效方法是采用与第二抗 体相同的动物源血清（非免疫血清）吸 附封闭底物树脂上的带电荷物质，然后 再进行抗原抗体结合反应，必要时也可 采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少 非特异性染色。
三、免疫组化的全过程
③酶消化处理 石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固 定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定 簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性， 因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消 化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、 蛋白酶K等。
三、免疫组化的全过程
2、抗体处理与保存 • 抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用 的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗 体。 • 抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应 鲜明，背景应浅或不着色。 • 抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感 抗体稀释度应越高。（效价指某一物质引起 生物反应的功效单位 ）
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免疫组化在临床病理诊断中的应用 标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度; 协助肿瘤良恶性的诊断; 鉴别低分化癌和肉瘤; 鉴别转移癌的性质; 协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶; 鉴别小细胞恶性肿瘤; 癌组织耐药基因的检测; 为癌症患者治疗方案的拟定提供依据; 确定肿瘤组织的增殖活性; 评估癌症患者的预后; 检测病原体。
三、免疫组化的全过程
3、免疫染色（关键步骤）
• 必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是
不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视
性标记物。
• 标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体
复合物；
• 用缓冲液冲洗去未结合的成分；
三、免疫组化的全过程
3、免疫染色
对一些特殊的标本需进一步进行处理来增 加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干 扰。 • ⑴蛋白酶消化法 采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细 胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大 限度的结合。 常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋 白酶等。
四、几种常用的免疫组化检测技术
• 免疫荧光技术将荧光素作为标记物，使组 织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显 微镜下可见，从而显示抗原物质的定位。
• 荧光素：作为染料在激发光照射下能产生 荧光的一类化合物。 • • • • １.异硫氰酸荧光素 FITC ２.四乙基罗达明 ３.四甲基异硫氰酸罗达明 ４.藻红蛋白
二、免疫组化 2 3 4 荧光 酶 亲和技术 金标
标记抗体
二、免疫组化的检测原理
组织抗原
＋
标记抗体 标记的抗原抗体复合物
二、免疫组化的检测原理
两种免疫细胞化学反应方法
直接法
间接法
三、免疫组化的全过程
免疫动物或 细胞融合， 制备特异性 抗体及纯化 标记物与抗 体集合形成 标记抗体
六、免疫组织化学技术的应用
• 荧光免疫组织化学技术主要用于病原体 感染的早期诊断，自身抗体检测，分析淋 巴细胞表面标记物质及抗原、抗体的免疫 组化定位等；在病原生物学方面，主要用 于菌种的鉴定和抗原结构的分析；在细胞 免疫学检测中，用以检测淋巴细胞表面的 各种CD抗原、免疫球蛋白受体、HLA抗原 和各种膜受体等。
三、免疫组化的全过程
• ①组织材料的固定目的: （1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织 细胞的固有形态。 （2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成 不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。 （3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率， 造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 （4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于 制片。 （5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰， 便于辨认。
•
六、免疫组织化学技术的应用
• 酶免疫组织化学技术主要用于组织切片 或其它抗原的定位检测。组织切片中的各 类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、 细胞、病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫 球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可 检测。 • 免疫标记电镜技术由于需要电子显微镜， 目前仍较多用于科研分析。
六、免疫组织化学技术的应用
六、免疫组织化学技术的应用
• • • • •
鉴别低分化癌和恶性淋巴瘤 鉴别微小转移癌灶 鉴别某些转移癌的类型 鉴别低分化癌的类型 鉴别低分化肉瘤的类型
七、课堂小结 八、作业: 1、免疫组化的原理 2、免疫组化的操作流程
O(∩_∩)O 谢谢
三、免疫组化的全过程
免疫组化染色中标识物的选择原则： • 用量微小，容易在光镜或电镜下识别 • 机体内无同一物质或类似物质 • 物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结 合，其结合物也稳定
三、免疫组化的全过程
常用标记物 ①荧光素： 最常用的是异硫一氰酸荧光素（荧光显微镜下呈绿色 荧光） 四乙基罗达明（荧光显微镜下发橙红色荧光） ②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 ⑤其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
培养的成纤维细胞 微管呈绿色 核呈蓝色
五、注意事项
1、抗体的保存 • • • 浓缩抗体：有效期内，只需放在4 ℃冰 箱内，保存时间可达1-3年。 即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内可保 存半年左右。 PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可 放置1-2个月。
五、注意事项
2、出现假阳性的原因 ①组织切片质量不佳，造成假象，如刀 痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为 判断阳性的依据。 ②出血和坏死：红细胞的内源性过氧化 物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物 酶均可出现假阳性反应。 ③抗体的交叉反应。
二、免疫组化的检测原理
• 在一定的条件下，应用标记抗体（抗原）与组织切 片或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应。如果组 织或细胞中含有相应抗原（抗体），二者结合形成 抗原抗体复合物，其中所带的标记物如酶或荧光素 遇到底物或激发光时产生显色反应，在显微镜（包 括普通光镜、荧光显微镜和电子显微镜）下，就可 以原位确定组织中或细胞内抗原的分布位置和性质； 经图像分析也可达到定量的目的。 • 组织或细胞中凡是能做抗原或抗体的物质，如蛋白 质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、 核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
第10讲
免疫组织化学检测技术
基本内容
一、什么是免疫组织化学 二、免疫组化的检测原理 三、免疫组化的全过程 四、几种常见的免疫组化检测技术 五、注意事项 六、免疫组化技术的应用 七、课堂小结 八、作业
一、定义
• 免疫组织化学是指在组织细胞原位通 过抗原抗体反应和组织呈色反应，借 助可见的标记物，对相应的抗原或抗 体进行定位、定性和定量检测的一种 免疫检测方法。
三、免疫组化的全过程
各种抗原的固定 抗原
蛋白质 免疫球蛋白 酶 激素 细菌 病毒 丙酮 四氯化磺 1％聚甲醛 丙酮、甲醇 丙酮，无水乙醇 四氯化磺 类脂质 细胞悬液 10％甲醛 1％聚甲醛
固定剂
95％乙醇
固定温度与时间
室温，3～15min 4℃，30min 4 ℃ ，30min 4 ℃ ，4～5h 室温，3～10min 室温，5～10min 4 ℃ ，30～60min 室温，3～10min 室温，2min
三、免疫组化的全过程
4、设立对照实验
为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对 第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、 空白对照、自身对照和吸收试验等。
• （1）阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染 色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。 • （2）阴性对照 用不含已知抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性 对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制 对照等，用以排除假阳性结果。
抗原的提取 与纯化
显微镜下观察 结果
抗原抗体 反应和呈 色反应
标本的处理
三、免疫组化的全过程
1、标本的处理 组织材料处理是获得良好免疫细胞组织 化学分析的保障，必须保证要检测的细 胞或组织取材新鲜、固定及时、形态保 存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。
三、免疫组化的全过程
1、标本的处理 标本的主要来源：活体组织、各种体液、 穿刺液、培养细胞。 主要包括三部分： ①标本的固定与保存 ②制作切片 ③酶消化处理
五、注意事项
3、出现假阴性的原因 ①固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高， 导致抗原丢失，无法补救。 ②固定液不合适或浓度不对，导致固定不 佳。最好使用10%中性福尔马林。 ③抗体浓度过低。 ④孵育时间太短，或孵育温度太低。 ⑤缓冲液pH值不正确。
五、注意事项
4、必须严格设置阳性对照和阴性对照。
5、DAB(二甲氨偶氮苯)有致癌性，用后不 应随处倒弃。
三、免疫组化的全过程
②制作切片： 冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方 法。 冰冻 石蜡
切片
切片 观察组织细胞结构的理 想方法，可用于陈旧石 蜡包埋材料的回顾性免 疫组化研究，切片薄， 有连续性，蜡块可长期 保存，但是抗原的保存 量不如冰冻切片。
制片方法简单，可 避免石蜡切片因固 定、脱水、浸蜡等 步骤造成的抗原损 失。迅速冷冻可防 止冰晶的形成，避 免组织细胞结构的 破坏。
三、免疫组化的全过程