免疫组织化学技术
组织化学技术5免疫组化
Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］ 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能 干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．PBS洗涤技术 （1）洗涤的目的 ①保证离子浓度和PH值。 ②减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
Ab滴片图示：
方法：洗三次，每次5分钟。 Ab孵育技术 必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
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应用：特别适用于含抗原量较少的组织。
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包埋后染色：
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组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制
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成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由
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于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，
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故又称载网染色（on grid staining ）。
优点： ① Ultrastructure 保存良好。 超薄切片易穿透，可标记细胞任何 部位。 方法简便，（+）结果高度可重复性。 同一张切片上可进行多重免疫染色。 缺点： ① 抗原活性可能减弱或消失。 树脂中的组织不易进行免疫反应。
2
液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时
3
新配）
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自来水洗净。
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用Mayer 苏木精或0.5％甲基绿，复染胞
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核（可不染）。
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常规脱水、透明、封固、镜检。
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结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
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（四）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 ① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。 如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则 不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫组织化学技术(immunohistochemistry)
免疫组织化学技术（immunohistochemistry）由于免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高及能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起的显著特点，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景。
此方法经不断改进和发展已日趋成熟，应用范围逐渐扩大。
目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，取得了令人瞩目的成就。
一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围（一） 免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
免疫学检验技术—免疫组织化学检验技术
（四）标本片的保存 固定好的标本片应尽快荧光染色检查，如需保存，
置-20℃下低温干燥保存。
二、荧光抗体标记及染色
• 荧光抗体是荧光免疫技术的关键试剂，是将荧光素与 特异性抗体通过共价键的方式结合而成。其制备过程通常 包括抗体的标记、纯化和鉴定三步。
• 在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，置于 带盖的湿盒内，37℃温育30min。检测不耐热抗原以4℃ 过夜为宜。温育后充分洗涤、干燥、镜检。
（三）方法评价 该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于酶不是
标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗体性。 尤其是双桥PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高 的方法。
四、临床应用
• 酶免疫组织化学检验技术主要用于组织切片或其它 抗原的定性、定位、定量检测。组织切片中各类抗原性 物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗 原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志 等均可检测。
二、SPA法
• SPA具有和人及许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴 等的IgG Fc结合的能力，这种结合不会影响抗体的 活性。每个SPA分子可同时结合两个IgG分子，也可 一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过 氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。
• 阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质(浆) 型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、片块 型等）主要是定位指标
• 哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）也 应视为阳性表达
（三）阴性结果
阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方 法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而导致 阴性反应。
• 即过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶 桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将 抗酶抗体（抗过氧化物酶（AP））与酶（过氧化物酶 （P））制成了可溶性复合物（PAP）,该复合物由2个抗 酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形，非常稳定。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
免疫组化技术
Mart-1 抗原修复前
抗原修复后
抗原修复
加热法的注意事项 ：
✓达到规定的温度(92～95 C以上) ✓维持一定的时间； ✓避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)； ✓加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使 未折叠的蛋白分子链恢复天然构型； ✓修复液：最常用的是pH6.0的0.01mol抗原修复液的容器 中，加热至沸腾，持续10～15分钟。
优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室， 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
抗原修复
微波照射法 ：将玻片放入装有抗原修复液的容器 中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟， 冷却后，按免疫组化染色步骤进行。
量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中
生物素——抗生物素染色法最常用（ABC法）。
常用的染色方法
➢ 免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。
• 基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞 或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗 原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发 出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的 定位，进而还可进行定量分析。
抗体
✓ 抗体的结构：
每个抗体都含有两个较小的 蛋白质 （轻链）和两个较大的 蛋白质（重链）。组成 抗体 的这四个蛋白质通过二硫键 （ S-S ）结合在一起。
➢ Fab（fragment antigen binding）： 该端是抗体与抗原特异性结合的部位
➢ Fc（fragment crystalline）：
常用固定剂
丙酮： 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组 织标本。
组织学切片制作
冰冻切片和石蜡切片是免疫组化中最常用的制片 方法。
《免疫组织化学技术》PPT课件
PTP课件
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双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
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双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
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PAP法的原理
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PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
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PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
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What’s the Neuroscience?
•
不同学科（解剖、生理、病理、 药理、生物、生化、信息、临 床）；
•
不同水平(分子、细胞、组织、 器官、整体、行为、认知）；
不同侧面（结构、功能、发育、 病理、工程）； 不同技术平台
Tyrosine HydroxlyaseRat
Immunocytochemis try for TH
Immunohistochemistry Staining
Aß -1-40 (pan) Mouse Cortex PS-1/APP Transgenic
Aß -1-42 Mouse Cortex PS-1/APP Transgenic
免疫酶组织化学方法模式图
直接法
间接法
PAP法
ABC法
三、设立对照 (Tissue Control)
目的是证明阳性反应的确是由于抗原抗体反 应所致，任何一个未知标本染色时都必须同时进 行阳性对照和阴性对照。
1. 阳性对照 (Negative tissue controls)
2. 阴性对照 (Positive tissue controls) 3. 空白对照 (Internal tissue controls) （不加一抗）
提取和纯化：
神经生物学中的抗原：酶，神经肽，膜性结构成分，神
经递质，类固醇
2. Antibody
• 免疫球蛋白（Ig） • 免疫组化中多用IgG • 免疫球蛋白的结构：与抗原有结合能力的为Fab段
3. 多克隆抗体和单克隆抗体
Polyclonal antibody: Polyclonal antibodies are produced by different cells, and in consequence, are immunochemically dissimilar; they react with various epitopes on the antigen against which they are raised.
• 历史与发展：1950年, Coons
免疫组化实验程序
• 抗原提取 • 抗体制备 • 抗体标记 • 染色反应
• • 免疫组织化学与免疫细胞化学 亲和组织化学
• 呈色观察
• 结果评价
第一节 免疫组织化学原理
一、抗原和抗体
1. Antigen：
种类：完全抗原和半抗原 性质：具有免疫原性和免疫反应性；其特异性由表面的 抗原决定簇（antigenic determinant）决定
五、染色结果评价
• 从抗原在局部的表达方式判断染色结果 是否特异 • 积极评价阳性染色结果的意义
• 人为假象的识别
第三节 免疫组化技术在神经科学 研究中的应用
• 区分神经细胞和神经胶质细胞及其结构成分
1.神经细胞的特殊化学性质：
NSE (Neuron specific enolase) 神经元特异性烯醇化酶
第二节 免疫组织化学染色方法
一、免疫荧光技术（Immunofluorescence method）
1. 原理：荧光标记抗体 2. 方法： • 直接法：荧光素标记特异性抗体
• 间接法：荧光素标记Ⅱ抗
• 补体法：荧光素标记抗补体抗体
免疫荧光组织化学模式图
荧光显微镜及其使用：
1）荧光显微镜主要结构；
Monoclonal antibody: Monoclonal antibodies are the product of an individual clone of plasma cells. Antibodies from a given clone are immunochemically identical and react with a specific epitope on the antigen against which they are raised.
• 抗原在细胞的合成、转运及代谢途径
基本原理与方法
• •
避免两种染色系统的交叉反应
方法： 1. 洗脱法：在第一种免疫反应后，用酸性溶液洗脱切片
上所形成的抗原抗体复合物。
1）保留第一种显色反应生成物，可在同一组织片上 标记两种抗原。 2）洗脱第一种反应的全部抗原抗体复合物，在空白 片上重新进行第二种染色，分别摄片纪录。
• 免疫动物
• 细胞融合
• 选择培养 • 克隆化
• 效价检测
• 扩大培养
抗体标记（Antibody labeled)
若要显示组织中的抗原抗体免疫反应，由于抗原抗体反 应形成的免疫复合物不能被肉眼和显微镜所观察到，因 此，若欲检测组织中的抗原，就需将抗体或免疫复合物 用可以分辨的物质加以标记。
• 荧光素标记 • 酶标记抗体 • 胶体金标记 • 铁蛋白标记
Histochemistry for Neural tissue
Nissl staining
Golgi staining
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1906
"in recognition of their work on the structure of the nervous system"
NF (Neurofilament)神经原纤维
2. 神经胶质细胞性质： GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein)
胶质原纤维酸性蛋白
S100, O1-O4
神经系统细胞类型的免疫学标志
Marker GFAP C1抗原 M1抗原 胼胝体抗原 S-100 髓磷脂碱性蛋白 NS-1抗原 半乳糖脑苷脂 O1-O4抗原 NS-4抗原 NSE NF 破伤风毒素受体抗原 星形胶质细胞 Astrocyte + + + + + 少突胶质细胞 Oligodendrocyte 神经细胞 Neuron
Camillo Golgi 1/2 of the prize Italy
Santiago Cajal 1/2 of the prize Spain
The dilemma of histochemistry
Immunohistochemistry
Introduction
• 目的：利用免疫学及化学反应所呈现的颜色变化， 在原位确定组织细胞结构的化学成分或化学性质， 是组织化学的一种。 • 本质：用标记的抗体追踪抗原，以确定组织和细胞 中的某种化学物质。
抗体制备
Polyclonal antibody制备
• 动物：家兔、山羊 • 佐剂：Freund • 免疫方法：皮下、静脉或肌肉注射
第一抗体：具有特异性
第二抗体：不具有特异性
• 效价检测：放射免疫分析、琼脂双向扩散法 • 免疫球蛋白的提纯：柱层析，亲和层析
Monoclonal antibody制备
•
•பைடு நூலகம்
20世纪神经科学的飞速发展
——诺贝尔奖获得者的主要战场
当代神经科学已经达到全方位认识脑水平
Molecular Neuroscience Cellular Neuroscience Systems Neuroscience Behavioral Neuroscience Cognitive Neuroscience
四、非特异性染色及处理
• 凡是不属于上述免疫特异性反应的染色通 常称为非特异性染色或背景染色。 1. 原因：
• 富含电荷的胶原和结缔组织吸附抗体
• 内源性过氧化物酶 • 抗体浓度过高 • 不适当的孵育温度和时间
2. 消除方法：
• • • • • • • 蛋白封闭抗原：加Ⅰ抗之前，正常动物血清 内源性过氧化物酶阻断： 0.3%H2O2-甲醇30min 盐酸修复抗原 增加Ⅰ抗稀释度 调整孵育时间及反应温度 消除醛类固定液所致的非特异性染色： 0.01%硼氢化钠 避免标本干枯
GFAP- Rat Hippocampus Trimethyl Tin Intoxication
Reactive Microglia Stain
Resident microglia of the brain become reactive following various forms of insult, including physical (d) and chemical trauma and viral infection(a-c). Our silverbased protocol stains reactive microglia but not resting microglia. Microglial features visible with our silver are the same as with lectin staining (IsoB4) and antibody staining (ED-1 in rat).
COX-2 Rat Hippocampus
c-fos Rat Piriform Cortex
第四节
其他免疫组化技术
双重或多重免疫标记技术
•
应用免疫组织化学方法，在同一张组织切片上同时进行
或先后显示两种或两种以上的抗原成分
•
作用： • 可以了解不同细胞、组织之间与相关抗原的相互关系
• 同一种细胞内抗原之间的相互关系
The gain in brain is mainly in the stain!
Histochemistry
•
法国植物学家Raspail（1826）将化学技术与显微镜结合 起来：植物花朵受精过程中的碘淀粉反应。 Takamatsu和Gomori （1939）同时发表证明了碱性磷酸 酶的组织化学方法，使组织化学技术进入现代水平。 Scheldon, Brandes等（1955）将电镜与酶组织化学技术相 结合。