免疫组织化学技术
免疫组织化学在肿瘤诊断中的应用与进展
免疫组织化学在肿瘤诊断中的应用与进展背景介绍：肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，其早期诊断对治疗和预后都有着重要意义。
免疫组织化学作为一种重要的实验技术，已经被广泛应用于肿瘤诊断领域。
本文将着重探讨免疫组织化学在肿瘤诊断中的应用与进展。
一、免疫组织化学原理及技术1. 免疫组织化学原理免疫组织化学是通过检测组织或细胞中特定抗原的存在与分布情况来判断其性质和功能的一种方法。
它基于免疫抗原-抗体反应原理，利用具有特异性的抗体与相应标记物结合，经过染色或荧光检测，从而观察目标抗原在不同类型组织中的表达程度。
2. 免疫组织化学技术免疫组织化学技术主要包括制片、脱脂水处理、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
在制片过程中，组织标本被固定、包埋和切片，以保持组织结构的完整性。
随后，通过脱脂水处理去除蜡，使得抗体能够与目标抗原发生特异性结合。
接下来，使用特异性的一抗和二抗进行免疫反应，并经过适当染色方法（如DAB染色等）增强信号，并通过显微镜进行观察和分析。
二、免疫组织化学在肿瘤诊断中的应用1. 碳酸酐酶Ⅸ（CAIX）的检测CAIX是一种重要的肿瘤特异性标志物，在多种恶性肿瘤中高表达。
免疫组织化学可以通过检测CAIX在肿瘤组织中的表达情况，辅助肿瘤类型的诊断和预后评估。
2. 检测雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）ER和PR是乳腺癌等雌激素依赖性肿瘤的重要预测因子。
免疫组织化学可以检测肿瘤组织中ER和PR的表达情况，帮助医生制定合理的治疗方案。
3. EGFR与PD-L1的检测EGFR和PD-L1是一些常见肿瘤（如非小细胞肺癌）患者治疗靶点。
免疫组织化学可以准确地检测这些潜在预测因子在肿瘤组织中的表达水平，为治疗选择提供依据。
三、免疫组织化学在肿瘤诊断中的进展1. 多标志物联合应用近年来，随着技术发展，多个免疫抗原标记物联合应用已经成为趋势。
通过使用不同抗体对不同分子进行定位，可以更好地了解肿瘤发生和发展的机制，并指导相应治疗策略。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
临床分析中的免疫组织化学技术进展
临床分析中的免疫组织化学技术进展免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）作为一种重要的临床分析方法，在肿瘤诊断、治疗和预后评估等方面发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和应用的广泛推广，免疫组织化学技术逐渐成为临床医学中的一项必备技能。
本文将从技术原理、应用领域和进展方面对免疫组织化学技术进行综述。
一、技术原理免疫组织化学技术是利用抗体与相应抗原结合的特异性反应来检测组织或细胞中特定分子的存在与定位。
其基本原理是将组织切片经过特定的预处理步骤后，使用专门的免疫反应试剂盒，将抗体与待检测的抗原发生特异性结合，并通过染色反应来显示抗原的分布情况。
免疫组织化学技术的核心在于选择合适的抗体，其中包括一抗和二抗。
一抗与待检测的抗原结合后，通过与二抗反应生成复合物，再使用染色试剂可使复合物形成染色沉积物。
通过显微镜观察染色沉积物的颜色和分布情况，可以得出待检测抗原在组织中的表达情况。
二、应用领域免疫组织化学技术已广泛应用于肿瘤学、病理学、免疫学等临床领域。
在肿瘤诊断中，可以通过检测特定标志物的表达来帮助鉴别不同类型的肿瘤，指导临床治疗。
例如，通过检测ER、PR、HER2等标志物的表达情况，可以为乳腺癌患者提供更精确的治疗策略。
在病理学中，免疫组织化学技术可以帮助鉴别病变的类型和性质。
通过检测特定抗原的表达情况，可以确定病变是否来源于肿瘤细胞、病毒感染等。
此外，免疫组织化学技术还可以在肾脏病变、风湿疾病等方面提供重要的诊断依据。
免疫组织化学技术在免疫学研究中也起着重要作用。
通过检测特定免疫细胞或分子的存在与定位，可以揭示机体对疾病或外界刺激的免疫应答过程，对于研究免疫学机制具有重要意义。
三、进展方向随着科学技术的不断进步，免疫组织化学技术也在不断发展和完善。
主要体现在以下几个方面。
1. 抗体的选择和特异性改进。
随着对不同抗原的研究深入，筛选和改进抗体的方法不断提升。
目前，已有多种技术可用于获得高特异性的抗体，如单克隆抗体和人工合成抗体等。
免疫组织化学技术的特点
免疫组织化学技术的特点免疫组织化学技术是一种在生物学和医学领域中广泛应用的重要方法，它能够在细胞和组织水平上对特定蛋白质、抗原等生物分子进行定位、定性和定量分析。
这项技术具有许多独特的特点，为疾病的诊断、治疗和科学研究提供了有力的支持。
一、高特异性免疫组织化学技术的核心在于抗体与抗原的特异性结合。
所使用的抗体是针对特定抗原表位设计和制备的，因此能够高度特异性地识别和结合目标抗原。
这意味着在复杂的细胞和组织环境中，该技术可以准确地检测到我们感兴趣的特定分子，而不会与其他相似或无关的分子发生交叉反应。
这种特异性使得免疫组织化学能够在细胞和组织中精准地定位特定的蛋白质、激素、受体等生物标志物，为疾病的诊断和研究提供准确的信息。
例如，在肿瘤诊断中，通过使用针对肿瘤特异性抗原的抗体，可以明确肿瘤细胞的来源和类型，区分良性和恶性肿瘤，以及确定肿瘤的分化程度和侵袭性。
对于神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，特定的抗体可以检测到大脑组织中异常积累的蛋白质，如β淀粉样蛋白和tau 蛋白，为疾病的诊断和研究提供重要依据。
二、高灵敏度免疫组织化学技术具有很高的检测灵敏度。
即使目标抗原在样本中的含量很低，通过适当的抗体标记和检测方法，也能够被检测到。
这对于检测微量的生物分子，尤其是在疾病早期或病理变化轻微的情况下，具有重要意义。
现代免疫组织化学技术不断发展和改进，采用了更加灵敏的检测系统，如增强化学发光法、荧光染料标记等，能够进一步提高检测的灵敏度。
同时，优化的样本处理和抗原修复方法也有助于充分暴露抗原，提高检测的准确性和灵敏度。
在临床实践中，高灵敏度的免疫组织化学技术可以帮助早期发现肿瘤的微小转移灶，监测疾病的进展和治疗效果。
在科研领域，它能够检测到细胞内低丰度的蛋白质表达变化，揭示生命活动中的细微调节机制。
三、定位准确免疫组织化学技术能够在细胞和组织的微观结构中准确地定位目标抗原。
通过将抗体与显色剂或荧光标记物结合，可以直观地观察到抗原在细胞内的分布位置，如细胞核、细胞质、细胞膜等。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
免疫组织化学检验技术
免疫组织化学检验技术一、免疫组织化学检验技术简介免疫组织化学检验技术（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用的实验技术，它利用抗原-抗体的特异性结合反应，检测组织或细胞中的蛋白质、多肽、激素等生物活性物质。
该技术可用于疾病的诊断、病理学研究、药物靶点筛选等多个领域。
二、免疫组织化学检验技术的基本原理免疫组织化学检验技术的核心是抗原-抗体的特异性结合反应。
这种反应基于抗体和抗原的互补性，即抗体分子中的抗原结合部位能够与抗原分子中的互补部位结合。
在免疫组织化学检验中，将组织或细胞固定在载玻片上，然后加入特异性抗体，通过孵育反应，抗体与组织或细胞中的抗原结合。
随后加入显色剂进行显色反应，根据显色情况判断是否存在相应的抗原。
三、免疫组织化学检验技术的应用例子1.肿瘤诊断：免疫组织化学检验技术可用于肿瘤诊断，通过检测肿瘤组织中的特异性抗原，如癌胚抗原、糖类抗原等，有助于确定肿瘤的性质和分化程度。
例如，乳腺癌患者的肿瘤细胞可能表达ER、PR、HER2等基因蛋白，通过检测这些蛋白的表达情况，有助于指导治疗和判断预后。
2.感染性疾病诊断：免疫组织化学检验技术也可用于感染性疾病的诊断，例如检测病毒抗原、细菌抗原等，有助于确定感染的病原体种类。
例如，在流感病毒感染中，通过检测病毒核蛋白抗原，有助于确诊病毒感染。
3.药物靶点筛选：免疫组织化学检验技术还可用于药物靶点筛选，通过检测目标蛋白在组织或细胞中的表达情况，筛选出可能的药物作用靶点。
例如，在寻找治疗肿瘤的新药时，可利用免疫组织化学技术检测肿瘤细胞中的各种蛋白表达情况，筛选出可能的药物作用靶点。
四、免疫组织化学检验技术的优缺点1.优点：具有高特异性、高灵敏度、操作简便、易于定量等优点。
同时，免疫组织化学检验技术可以用于检测组织或细胞中的蛋白质、多肽、激素等生物活性物质，有助于深入探讨疾病的发病机制和病理过程。
2.缺点：可能会出现非特异性染色和交叉反应，影响结果的准确性。
免疫组织化学技术在肿瘤诊断中的应用
免疫组织化学技术在肿瘤诊断中的应用引言：免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种基于抗体与抗原特异性反应的特殊染色技术，具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围。
在肿瘤诊断中，免疫组织化学技术被广泛应用于肿瘤类型鉴定、预后判断和治疗选择等方面，并逐渐成为肿瘤诊断领域的重要工具。
一、肿瘤类型鉴定免疫组织化学技术可通过检测肿瘤标志物的表达情况来确定肿瘤的类型。
不同类型的肿瘤会表达特定蛋白，通过观察这些蛋白的表达情况，可以为准确诊断提供线索。
例如，在乳腺癌中，雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的阳性表达对于判断患者是否适合内分泌治疗非常重要；HER2蛋白过度表达或基因扩增则与Herceptin治疗的有效性相关。
另外，通过检测细胞角蛋白、细胞间连接蛋白等标志物的表达情况，可以帮助判断肿瘤是否来源于上皮组织或间质组织。
二、预后判断免疫组织化学技术在预后判断方面也具有重要意义。
通过评估肿瘤标志物的表达强度和分布范围，可以对患者的生存期和复发风险进行初步判断。
例如，在乳腺癌中，Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的标志物，其高表达往往与较差的预后相关；p53蛋白过度表达与恶性程度增加以及放化疗抵抗有关。
通过检测这些标志物，可以为患者提供更加个体化和精确的治疗方案。
三、治疗选择免疫组织化学技术在治疗选择方面也能够发挥作用。
目前很多靶向药物的应用都会依赖于特定分子标志物在患者肿瘤组织中的表达情况。
通过检测这些标志物，可以确定患者是否适合接受特定的靶向治疗。
例如，EGFR是结肠癌中艾司唑仑的治疗标志物；ROS1在非小细胞肺癌患者中能够预测克唑替尼的应用效果。
四、技术进展与挑战随着免疫组织化学技术的不断发展，一些新的标志物已经被引入到临床实践中。
如PD-L1在肺癌和其他恶性肿瘤中的表达与免疫检查点抑制剂治疗反应相关；BRCA1/2基因突变是用于判断乳腺和卵巢癌家族遗传风险和药物敏感性的重要指标。
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➢正确设置合适的对照
➢正确选配固定方法和修复方法
➢正确选配显色系统
免疫组化实验对照设置
• 阳性对照：判断染色全过程和所有试剂的正确性：
A、内部对照：对照组织本身明确存在的抗原（二抗系统的 正确性）
B、外部对照：明确表达待测抗原的组织或细胞（一抗的工 作性）
• 阴性对照：明确不表达待测抗原的组织或细胞 • 二抗对照：不加一抗，余操作相同
中文名称 免疫细胞化学 免疫荧光（细胞标本） 免疫组织化学 (石蜡切片) 免疫组织化学 (冰冻切片)
免疫荧光 免疫组织化学
免疫组织化学 (甲醇固定) 免疫组织化学 (PFA 固定标本) 免疫组织化学 (灌注固定冰冻切片) 免疫组织化学 - Free Floating 免疫组织化学 (Glycolmethacrylate sections) 免疫组织化学 (PFA-glutharaldehyde fixed) 免疫组织化学 (Methylmethacrylate sections)
基本原理
• ABC法：先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成ABC复
合物，抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合， 形成巨大复合物（网络大量酶分子），最后显色。
二抗直接偶联酶的Polymer
俗称两步法
基本原理
• Envision两步法：抗原与抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚
免疫组织/细胞化学
IHC/ICC
主要内容
• 免疫组织化学概况 • 免疫组化实验步骤和试剂 • 常见问题及处理方法 • 多色标记
免疫组织/细胞学简介
免疫组织学
是一种把分子水平的物质在组织原位通过 抗原抗体反应和组织化学的呈色反应进行定性、 定位测定，准确具体表达出来的一种方法。这 些分子水平的物质可能与癌细胞、蛋白质、多 肽、酶、激素、病原体以及受体等等有关
• 抗体浓度过高：降低抗体浓度、建议4℃过夜 • 选择纯化的抗体 • 设置阳性对照
➢ 试剂污染：重新配置新的缓冲液和试剂
染色弱常见原因
• 组织固定、包埋时抗原被破坏 • 抗原位于细胞内，未使用破膜剂(尤其是定位于细
胞核)
• 抗体浓度过低，孵育时间过短 • 操作中滴加试剂时缓冲液未漓干，致使试剂稀释 • 室内温度<15 ℃ • 过度封闭 • 试剂超过有效期 • 抗体保存不当导致活性降低 • 染色过程中未避光（荧光染色）
酶免疫组织化学（IHC）常用方法
❖ PAP/APAAP：二抗-HRP/AP + HRP-抗HRP/AP； ❖ LAB/LSAB：二抗 – 生物素(Biotin) + HRP-亲和素； ❖ S-P/SAP： 二抗 – 生物素 + 链酶亲和素-HRP/AP； ❖ ABC/SABC：亲和素/链酶亲和素-生物素化HRP/AP复合物； ❖非Biotin/Avidin方法/Envision两步法：二抗直接偶联酶
免疫组化基本操作步骤 及需要的试剂
免疫组化基本操作步骤
Envision二步法操作步骤
• 1、组织切片60℃预热 • 2、常规脱蜡入水（二甲苯、各级酒精、水） • 3、抗原修复 • 4、PBS/T洗3次，5min/次 • 5、3%H2O2 RT 10min（封闭内源HRP） • 6、PBS/T洗3次，5min/次 • 7、10%正常山羊血清RT 30min（阻断组织内源IgG、Fc-R） • 8、一抗4 ℃孵育过夜 • 9、PBS/T洗3次，5min/次 • 10、二抗RT 30min • 11、PBS/T洗3次，5min/次 • 12、DAB显色，显微镜下观察，控制显色程度 • 13、充分水洗 • 14、苏木素复染核 • 15、1%盐酸酒精分化 • 16、充分水洗返蓝 • 17、脱水、透明，中性树胶封片
• 载玻片处理不充分 • 组织固定、脱水、透明不充分 • 组织切片太厚（>5um) • 组织切片有折叠 • 过度的热抗原修复（高压、微波、水煮） • 抗原修复液的pH值偏高 • 操作过程中冲洗方法不正确
非特异性背景染色
➢ 封闭不充分：增加封闭试剂浓度、延长封闭时间 ➢ 冲洗不充分：短时间多次数的洗涤更有效 ➢ 实验过程中切片干燥：试剂量充足，注意观察，避免干片 ➢ 组织切片折叠 ➢ 组织抗原弥散：组织标本及时固定，选择合适的固定液 ➢ 抗原修复不充分：更改修复方法，优化时间 ➢ 内源性生物素/亲和素：使用封闭试剂或者不用SP/ABC系统 ➢ 二抗原因：选择Fab段的抗体或者吸附过的抗体，设置二抗对照 ➢ 一抗原因：
脱水、透明
水溶性封片剂如 AEC封片剂
有机封片剂如中性树 胶
水溶性封片剂，最 好是含荧光抗淬灭 成分的(PE不能用含
甘油的封片剂)
10、结果观察
• 普通光学显微镜 • 荧光显微镜
IHC/ICC常见问题分析
常见问题及处理方法
• 组织脱片 • 非特异性背景染色 • 染色弱 • 无阳性染色
组织脱片常见原因
无阳性染色常见原因
• 操作错误（漏加试剂） • 组织中无抗原 • 固定、包埋、修复时抗原被破坏 • 修复方法不当 • 一抗与二抗不匹配 • 底物和酶不匹配 • 封闭过度 • 封片剂选择不当 • 一种或多种试剂活性降低或失活 • 抗原位于细胞内，未使用破膜剂
多标记检测
多标记染色法
• 适用于同一组织片2~3个不同抗原的检测 • 技术平台： 同样的酶，不同底物
1、载玻片处理
• 重酪酸钾浓硫酸浸泡24h－ddH2O漂洗—95%乙醇
浸泡12h
• 防脱粘片剂处理：
Poly-L-Lysine; AEPS; Special Reagent
• 可直接购买处理好的载玻片
2、组织固定
标本类型及常用固定液
石蜡切片
冰冻切片
组织固定液 特点
10%中性福尔马林 冷丙酮，4%多聚甲
Red/Fast Red, 免疫金-银染色
DAB, BCIP/NBT
BCIP/NBT
DAPI(染 核,兰色)
荧光
9、脱水/透明/封片
AEC,AP Red/ DAB,New Fuchsin,
Fast Red, 和其它 Vega Red,BCIT/NBT
有机染料
和其它水溶性染料
荧光染料
不需脱水、透明
脱水、透明
本类型来摸索最佳稀释比例
• 一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如
PBS(T) /TBS(T)中4℃过夜
6、二抗及酶标记物孵育
➢根据一抗的来源和Ig亚型选择合适的二抗 ➢根据说明书推荐的稀释比例和标本类型摸索
最佳稀释比例
➢一般是在含1%封闭试剂的缓冲液（比如
PBS(T) /TBS(T)中室温(RT) 30-60mins
S-P/LAB方法
复合物:链酶亲和素-HRP/AP
基本原理
• S-P/LAB方法:一个亲和素和多个标记酶（HRP）结合，多个生
物素与抗体（一抗或二抗）结合，细胞的抗原（或一抗）先与 生物素化的抗体结合，既而将酶标记的亲和素结合在生物素上， 最后进行显色反应定位。
ABC方法
ABC复合物:亲和素-生物素化HRP/AP A－亲和素，B－生物素，C－复合物
不同的酶，不同底物 荧光检测
• 适用于中性福尔马林固定的石蜡切片、冰冻
切片、细胞爬片
多色检测操作程序
第一个抗原检测 第二个抗原检测
多色标记抗体选择
• 一抗最好是不同动物来源的 • 选择验证过实验种属和方法的抗体 • 根据染色顺序选配合适的酶和底物
dopamine D1 receptor 免疫组化
4%多聚甲醛
醛
需要修复
不需修复，冷丙酮 固定不需破膜
细胞涂片
甲醇、乙醇 不需修复
如果待测蛋白位于细胞浆或者细胞核内，同时还需要进行破膜处理
3、抗原修复
➢加热修复技术
修复方法：微波加热修复、高压热修复、煮沸热修复：
常用buffer：柠檬酸Buffer:0.01M, pH6.0
EDTA buffer: pH9.0
590nm
• Texas Red：红色，激发波长589nm；发射波长570-
615nm
• Cy3：橙色，激发波长512/550nm；发射波长570nm • Cy5：红色，激发波长625/650nm；发射波长670nm
免疫组化实验注意事项
➢正确选配抗体
• 一抗必须是说明书上经过验证(tested application)可以用 于IHC(IHC-P;IHC-Fr)检测的
➢非加热修复技术
• 胃蛋白酶(细胞内抗原): 0.4%,37℃,30mins • 胰酶(细胞间抗原): 0.05-0.25%,37℃,10-15mins • Proteinase K : 20ug/ml
4、封闭
• 正常血清(5-10%)：阻断组织内源IgG、Fc-R • BSA (5%) ：阻断组织内源IgG、Fc-R • 特殊封闭试剂：当使用小鼠源性抗体检测小鼠组织
• 人肾脏，石蜡切片
Human卵巢 GATA-4 核染色
细胞质、细胞膜染色
• 骨组织 β-catenin 免疫组化
➢也可以选择商业化的试剂盒：SP,ABC或者
两步法
7、显色
AP
AEC（red)
Fast Red(pink)
DAB(brown/gray)
BCIP/NBT(blue/violet)
8、复染
苏木素(染核,蓝色)
甲基绿(染核, 绿色)
核固红(染核, 红色)
AEC,DAB,AP
技术平台
➢组织切片或细胞爬片 ➢纯化的一抗（单克隆或多克隆） ➢标记的二抗(酶、金颗粒或者荧光） ➢显色系统（DAB、AEC、BCIP/NBT、FAST RED等） ➢ 检测系统（普通或荧光显微镜）