高效液相色谱简介及操作
高效液相色谱法(精细化学品分离提纯技术)

• 在RPC中,有机水溶液作流动相,溶质在非 极性的配基(烷基、苯基等)上的保留, 就是由于溶质中的疏水基团倾向于与配基 结合而造成的。
• 溶质中的疏水性越强,与配基的结合地越 牢。所以有机同系物中随着烷基链长的增 加,其保留值也增大。
(2)计量置换模型
• 样品分子和固定相上的配基在流动相中都是溶剂化的。当 样品分子保留在柱子上时,样品分子与配基接触,两者之 间结合面上的溶剂化分子被“挤”走,进入流动相。被 “挤”走的溶剂分子有Z个。当样品分子被洗脱下来时,样 品分子进入了流动相,样品分子与配基的接触面重新被溶 剂化,重新溶剂化所需的溶剂分子是Z个,与保留时被“挤” 走的溶剂分子相等。
2.与GC相比 (1)样品受限制少,对易分解、不容易气化、 分子量大、高极性的有机物(70~80%的有机 物)可用HPLC分析。 (2)不用制备衍生物,减少了误差。 (3)进样量大(500~800μL),易制备。 (4)分离效率降低。
二、一般分离流程
高效液相色谱仪及一般分离流程见图7-1。 三、色谱原理 1、概念 HPLC:以溶剂或某种溶液为流动相,
§7-1 一般流程及分离原理
一、简介 1.与经典的液相柱色谱法相比 (1)柱内径↓,填充剂粒度↓、均匀性↑, 新型固定相的问世 → 分离效率↑。 (2)柱长↓,填充剂机械强度↑,供液压力 和进样压力↑,流动相流速↑(1~5ml/min) →分离速度↑(7~8个峰/10min)。 (3)采用光学原理的检测器→灵敏度↑。
• 另外,对照(a)和(d)可以 发现刚上样后,溶质分子形成的 色带(又叫谱带)较窄,而到了 (d)中,各组分的谱带明显变 宽,这说明同一组分沿柱子移动 时,存在着扩散问题,即谱带的 扩散。
图7-2 三组分样品 分离过程示意图
高效液相色谱仪的操作步骤

高效液相色谱仪的操作步骤高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是一种常用的分离和分析技术。
它利用液体流动相和固定相之间的相互作用,将样品中的混合物分离出来,并通过检测器进行定量分析。
本文将介绍高效液相色谱仪的具体操作步骤。
1. 准备工作在进行高效液相色谱仪的操作之前,首先需要进行一些准备工作。
检查色谱柱是否安装正确,确保色谱柱是干净的,并检查流动相的配制是否准确。
2. 样品制备根据需要分析的物质,准备好待测样品。
样品制备可以包括溶解样品、过滤样品等步骤,以确保样品的纯净度和稳定性。
3. 仪器开机将高效液相色谱仪接通电源,打开仪器的电源开关。
等待仪器初始化,并确保仪器各个部分正常工作。
4. 设置参数在仪器上设置分析所需的参数。
包括选择适当的检测器类型和检测波长、设置流量、温度等。
5. 启动系统启动高效液相色谱仪系统,等待系统稳定。
通常需要一段时间使得流动相在管路中充分平衡,并确保流量稳定。
6. 校正进行色谱柱的校正。
校正过程包括流量校正、波长校正等。
通过校正可以保证仪器输出结果的准确性和可靠性。
7. 注射样品将样品通过注射器引入色谱柱中,控制样品的注射量,通常在微升至毫升的量级。
确保样品的注射量稳定和准确。
8. 分离分析开始运行高效液相色谱仪系统,进行样品的分离与分析。
在此期间,流动相通过色谱柱,将样品中的化合物根据它们与固定相之间的相互作用进行分离。
9. 监测结果通过检测器对分离后的化合物进行监测。
根据检测器的信号,可以得到每个化合物的峰面积、保留时间等数据。
10. 数据处理将监测到的信号输入到数据处理软件中,进行结果的计算和分析。
通常可以得到各个化合物的峰高、峰面积等数据,从而实现对样品的定量分析。
11. 关机分析结束后,关闭高效液相色谱仪的电源开关,并进行必要的清洗和维护工作。
确保仪器的正常运行,并延长其使用寿命。
总结:高效液相色谱仪的操作步骤涵盖了仪器准备、样品制备、仪器设置、校正、样品注射、分离分析、结果监测和数据处理等多个方面。
高效液相色谱法简介

高效液相色谱的特点
高压——压力可达150~300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节
塑料块 Teflon
1 cm
工作电极 (Pt, Au, 碳糊)
e.电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理: 根据待测物在一些介质中电离后所产 生的电导(电阻的倒数)变化来测量电离物质 的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应 受温度影响较大,因此需要将电导池置于恒温 箱中。另外,当 pH>7时,该检测器不够灵敏。 电导检测器不能用于梯度洗脱。
◆恒流泵
注射型泵------输出精确,无脉动,需更换溶剂而中断工作。
往复型泵------造价低廉,溶剂更换方便,但存在脉动。 (使用较多) 对流量变化敏感的检测器会有噪声 干扰,此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定,但流量不恒定(现在已经较少使用)。
输液泵操作注意事项:
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
F=2.3QKI0εCl
Q为量子产率,K为荧光效率,ε为摩尔吸光系 数,l为光径长度。
F=KC
特点:选择性好,
专属型检测器,灵敏 度比紫外检测器高 (检测限10-10 g/ml) 对多环芳烃,维 生素 B 、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药 、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应;
c. 示差折光检测器
高效液相色谱的工作原理及操作注意事项

高效液相色谱的工作原理及操作注意事项高效液相色谱的工作原理及操作注意事项一、高效液相色谱的工作原理高效液相色谱(HPLC)是一种常用的分离和分析技术,主要应用于化学、生物、医药等领域。
其工作原理是利用不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡,实现对待测组分的高效分离。
以下是高效液相色谱的工作原理:1.流动相:高效液相色谱中的流动相也称为溶剂或载体,是携带待测组分通过色谱柱的介质。
流动相的选择应根据样品的性质、检测器的类型以及分离效果等因素进行选择。
2.固定相:高效液相色谱中的固定相是色谱柱中的填料,通常是涂布在硅胶或氧化铝等载体上的高分子聚合物。
不同物质根据其在固定相和流动相之间的分配系数进行分离。
3.洗脱过程:在高效液相色谱中,待测组分随流动相通过色谱柱,经过固定相和流动相之间的分配平衡实现分离。
分离后的组分会按照其在固定相和流动相之间的分配系数依次流出色谱柱,进入检测器进行检测。
4.检测器:高效液相色谱中使用的检测器根据待测组分的性质和检测要求进行选择,常见的有紫外-可见光检测器、荧光检测器、电导检测器等。
检测器的作用是将组分的浓度转化为可测量的电信号,以便进行记录和分析。
二、高效液相色谱的操作注意事项在使用高效液相色谱进行实验操作时,需要注意以下事项:1.样品准备:在进行高效液相色谱分析前,需要对样品进行必要的处理和制备。
应尽可能避免样品中的杂质和干扰物质对分离和分析的影响。
同时,样品的浓度应适中,以避免色谱柱过载或检测器过载。
2.流动相选择:流动相的选择对高效液相色谱的分离效果和分析结果至关重要。
应根据样品的性质、实验要求以及分离效果等因素选择合适的流动相。
同时,应注意流动相的纯度和稳定性,以保证实验结果的可靠性。
3.色谱柱选择:高效液相色谱中使用的色谱柱是分离和分析的关键元件。
应根据样品的性质、待测组分的类型以及分离要求等因素选择合适的色谱柱。
同时,应注意色谱柱的粒径、孔径和填料性质等参数,以确保达到最佳的分离效果。
高效液相色谱法操作步骤

高效液相色谱法操作步骤
高效液相色谱法的操作步骤如下:
1. 过滤流动相并根据需要选择不同的滤膜。
溶剂必须为色谱纯,且溶剂及样品必须过膜(0.45μm)。
超声脱气30分钟以上。
2. 用流动相冲洗金属过滤器,然后将过滤器浸入储液罐的流动相中。
有一段时间没用或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。
3. 将储液罐放置在一定的高度,以避免由于搬运和其他操作人员的移动而造成不必要的跌落。
4. 然后按以下顺序依次启动高效液相色谱仪:泵→检测器→高效液相色谱软件→设置软件参数,如分析时间、检测波长、流速等。
5. 启动泵,运行5分钟,主要是为了排除系统中的气泡,结束后关闭所有排气阀。
6. 然后按照预先计划的速度,以固定的速率,如1mL/min左右,运行流动相,走基线,直到基线平稳。
7. 基线平稳后,在软件中设置样品的运行参数,如流速和分析时间等。
分析时间会因样品、流速、柱长等因素变化。
8. 设计走样方法。
9. 在进样和进样后操作的过程中,需要及时调整和监控各项参数。
高效液相色谱的基本参数讲义

降低检测器噪声
通过优化检测器条件,如调整光 源强度、选择合适的滤光片等, 可以降低检测器噪声,从而提高 信噪比和灵敏度。
增加进样量
在保证色谱柱不过载的前提下, 适当增加进样量可以提高检测器 的响应值。
灵敏度与检测器选择关系
不同检测器灵敏度差异
不同类型的检测器对同一物质的灵敏度可能存在较大差 异,如紫外检测器对含有共轭体系的化合物具有较高的 灵敏度,而荧光检测器则对某些具有荧光特性的化合物 具有较高的灵敏度。
改变柱温
选择合适的色谱柱
柱温升高,分子运动加快,保留时间缩短 ;柱温降低,保留时间延长。但需注意柱 温过低可能导致色谱柱效能下降。
根据分析需求选择合适的色谱柱类型、粒径 和长度,以获得理想的保留时间。
保留时间预测模型
线性溶剂强度模型
假设溶质在固定相和流动相之间的分配系数与流动相组成 呈线性关系,通过实验数据拟合得到线性方程,可用于预 测不同流动相组成下的保留时间。
仪器组成与工作流程
01
仪器组成
高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检 测器、数据记录与处理系统等部分组成。其中输液系统包 括储液器、泵、流动相梯度程序等;进样系统包括进样器 、定量环等;色谱柱是实现分离的核心部件;检测器用于 对分离后的组分进行检测;数据记录与处理系统则用于数 据的采集、处理和分析。
使用后,应及时清洗色谱 柱,避免残留物对色谱柱 造成损害。
ABCD
在使用前,应对色谱柱进行 充分的平衡和条件化,以确 保其分离效果和稳定性。
长期不使用的色谱柱应妥 善保存,并定期进行检查 和维护。
仪器操作规范与安全防护
01
操作人员应熟悉仪器的结构、原理和操作方法,并按照规范进行操作。
高效液相色谱仪的操作步骤 液相色谱解决方案

高效液相色谱仪的操作步骤液相色谱解决方案高效液相色谱仪操作步骤:1).过滤流动相,依据需要选择不同的滤膜.2).对抽滤后的流动相进行超声脱气10—20分钟。
3).打开hplc工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。
4).进入hplc掌控界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。
5).有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。
冲洗泵,直接在泵的出水口,用针头抽取。
冲洗进样阀,需要在manual菜单下,先点击purge,再点击start,冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6).调整流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000、点击injure,选用合适的流速,点击on,走基线,察看基线的情况。
7).设计走样方法。
点击file,选取se—lect users and methods,可以选取现有的各种走样方法。
若需建立一个新的方法,点击new method。
选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测器等,依据需要而不同。
选完后,点击protocol。
一个完整的走样方法需要包括:a.进样前的稳流,一般2—5分钟;b.基线归零;c.进样阀的loading—inject转换;d.走样时间,随不同的样品而不同。
8).进样和进样后操作。
选定走样方法,点击start。
进样,全部的样品均需过滤。
方法走完后,点击postrun,可记录数据和做标记等。
全部样品走完后,再用上面的方法走一段基线,洗掉剩余物。
9).关机时,先关计算机,再关液相色谱。
10).填写登记本,由负责人签字。
注意事项:11).流动相均需色谱纯度,水用20m的去离子水。
脱气后的流动相要当心振动尽量不引起气泡。
12).柱子是特别脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。
13).全部过柱子的液体均需严格的过滤。
14).压力不能太大,可以不要超过2000 psi。
液相色谱流动相说明流动相相当于液相的血液,可以想象对液相的紧要程度。
高效液相色谱仪操作规程

高效液相色谱仪操作规程一、目的:建立高效液相色谱仪的标准操作规程二、适用范围:本规程适用于本公司高效液相色谱仪操作规程的操作三、职责:质量检验员对本标准的实施负责四、正文:1.工作原理高效液相色谱是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品,由流动相带入柱内,在柱内各成分被分离后,依次进入检测器,色谱信号由积分仪记录,得到的信号-时间曲线。
2.系统适用性按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,包括以下要求:色谱柱的理论板数(N):理论板数应高于各品种项下规定的最小理论板数,若理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数,应改变色谱柱的某些条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等)使理论板数达到要求。
分离度和拖尾因子:除另有规定外,分离度应大于1.5T应在0.95~1.05之间。
3.仪器组成本系统由LC-15ATvp溶剂输送泵、手动进样阀7725i、SPD-15Avp紫外检测器、Lcsolution工作站、电脑和柱温箱等组成。
4.准备4.1根据待检样品的需要更换合适的色谱柱(箭头依次朝上)。
4.2检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
4.3准备所需的流动相,用合适的0.45μm滤膜过滤,用吸气减压装置脱气。
4.4按标准操作规程配制样品和对照溶液,用合适的0.45 m滤膜过滤。
5.开机接通电源,依次开启泵,检测器(在进样前30min打开)、Lcsolution工作站。
5.1 LC-15C泵操作5.1.1逆时针转动泵的排液阀180°,打开排液阀;5.1.2按泵的[purge]键,pump指示灯亮,泵大约以9.9ml/min(可设定)的流速冲洗,5min(可设定)后自动停止;5.1.3将排液阀顺时针旋转到底,关闭排液阀。
如管路中仍有气泡,则重复以上操作直至气泡排尽。
5.2 SPD-15A检测器参数设定5.2.1检测器显示屏显示λ(NM) abs (AV) range (AUFS) 1amp254 0.000 0.001 D“λ(NM)”项为波长,“abs (AV) ”项为吸光度,“range (AUFS) ”项表示量程,“1amp”项表示氘灯。
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HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
• 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图??
tR:保留时间;tM:死时间; :调整保留时间; W:峰宽
• 定性分析:在同一色谱系统中相同物质具 有相同的保留值 • 定量分析:组分含量与其响应值(峰高或 面积)成正比
2 色谱柱使用的注意事项
• 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 • 当分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存(一般 为甲醇)。 • 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
3 其他注意事项
• 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁 止直接进样分析。 • 要注意流动相的脱气。 • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 • 使用新鲜配制的流动相,特别是水溶剂或缓冲液建 议不超过两天,最好每天更换。
(5)色谱柱平衡后,打开检测器(开灯) (6)测定样品 (7)清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
•
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防止任何固体微粒进入泵体(用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤) 流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完,否则空泵运 转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、 密封圈,最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 流动相应先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量 的稳定性和分析结果。
c. 荧光检测器 (FLD) 只适用于具有荧光的有机化合物(如多环芳烃、氨基 酸、胺类、维生素和某些蛋白质等)的测定。
原理: 某些溶质在紫外光激发后能发射可见光(荧光)的性 质检测。 特点: 选择性检测器,灵敏度比紫外检测器高2-3个数 量级,可达到 10-12g;选择性好,对流量和温度敏感性低。
b. 示差折光检测器 (RID) 凡具有与流动相折光率不同的样品组分,均可使用示 差折光检测器检测。目前,糖类化合物的检测大多使 用此检测系统。 原理:监测参比池和测量池中溶液的折射率之差 来测量试样浓度。 特点: 通用性检测器; 对温度变化比较敏感,要保持在±0.001℃; 灵敏度低(10-6g); 对溶剂变化敏感,不适用于梯度洗脱。
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流动相贮液器,一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯塑料制成,常用 体积为0.5~2L。
流动相溶剂放入贮液器之前必须经过过滤和脱气处理。
常用脱气方法:超声脱气、加热脱气、真空脱气、吹氮脱气等。
(2) 高压输液泵
主要部件之一,泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果 的可靠性,常用的压力范围:(150~350)×105 Pa。
• 用分离度R可以描述选择性和柱效的总效能
R值越大,表明两组分的分离程度越高,R=1.0时, 分离程度可达98%,R<1.0时两峰有部分重叠, R=1.5时,分离程度达到99.7%.所以,通常用 R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标.
分析未知物质------联用技术
• 色谱-质谱联用
• 色谱-核磁共振联用 • 色谱-傅氏转换红外线光谱分析仪联用
六通阀的结构:
3 分离系统
包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
色谱柱
是高效液相色谱的心脏。
柱管多用不锈钢制成。 两端的柱接头内装有筛板,防止填料漏出。 填料的粒度多为0.2-20 μm(5-10μm) 。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
常规分析柱:内径2~5mm(常用4.6mm,3.9mm), 柱长10~30cm (15cm,25cm居多)。
二、高效液相色谱仪的结构
液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统以 及检测和记录系统四大部分组成。此外,可根据需要配 置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统 、柱后反应系统和全自动控制系统等。
高效液相色谱仪结构流程图
1 高压输液系统
高压输液系统有贮液器、高压泵及压力表等组成,核心 部件是高压泵。 (1) 贮液器
4 检测系统
主要作用:监测经色谱柱分离后的组分浓度变化,并由 工作站记录数据,定性、定量分析。
高效液相色谱常用的检 测器有紫外检测器、示 差折光检测器和荧光检 测器等。
a. 紫外检测器(UVD):应用最广泛的检测器。 原理:朗伯-比尔定律 特点:使用面广; 灵敏度高(检测下限为10-10g/ml); 线性范围宽; 对温度和流速变化不敏感; 可检测梯度溶液洗脱的样品。 缺点:只能检测有紫外吸收的物质,流动相的截止波长 应小于检测波长。
5.如何评价色谱峰??
• 柱效:描述被分离组分的集中程度。柱效越高, 组分越集中,对应色谱峰的峰宽越窄。可用理论 塔板高度H描述。H越小,柱效越高。 L H n • 选择性:描述不同组分的分离程度。选择性越高 两个色谱峰顶相距越远。用R表示
(a)柱效和分离度都不好;(b)分离度高,柱效低;(c)理想色谱峰
三、高效液相色谱基本操作步骤
(1)检查电源线连接是否正确后打开电源开关 (2)泵体及流路内的气泡排除
(3)正确连接色谱柱 注意流向标志,切勿反接
(4)系统平衡
•
•
第一步:先用甲醇或乙腈冲洗流路约 20分钟,平衡活化色 谱柱,并赶走管路中的杂质和水分。 第二步:平衡色谱柱 方法一:若流动相为有机相与水相的混合物,则第一 步完成后,按照分析样品的需要调节有机相与水相的比例 后冲洗流路约30分钟后,待基线走平后即可进样。 方法二:若流动相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸, 则第一步完成后,先用95%的去离子水冲洗流路约20分钟 后,再按照分析样品的需要调节流动相的比例,冲洗流路 约30分钟,待基线走平后即可进样。
高效液相色谱
High-Performance Liquid Chromatography, HPLC
1
高效液相色谱概述及原理
2
主要内容
3
4
高效液相色谱仪的结构 基本操作步骤
主要注意事项
一、高效液相色谱概述及原理
• 高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪70年代在 经典液相色谱和气相色谱的基础上迅速发展起来 的一种高效、快速的分离分析技术。
输液泵应具备如下性能:
①流量稳定; ②流量范围宽; ③输出压力高; ④液缸容积小; ⑤密封性能好,耐腐蚀。
高压泵的分类
恒压泵
分类
恒流泵
螺旋注射泵 柱塞往复泵 隔膜往复泵
往复式柱塞泵
2 进样系统
进样方式:注射器进样、阀进样、自动进样。 早期使用注射器进样,现在大都使用耐高压的六通阀进 样或自动进样。
高效液相色谱仪就这样诞生了
LC
GC
HPLC
2.为什么叫高效液相色谱???
使用细、规则、孔浅的颗粒做为固定相,分离效率大大提 高。
填料颗粒小(2~10μm),受到的阻力较大,为了能迅速地通过 色谱柱,必须对载液施加15~30MPa的高压。
由于采用高压,载液在色谱柱内的流速可达l~10mL/min,因而 所需分析时间少。 采用紫外、荧光、蒸发激光散射、电化学、质谱等检测器, 检测灵敏度高。紫外检测器检测限可达0.01n g;荧光和电化 学检测器可达0.1pg。
1.色谱的演化
• 色谱:由于不同的组分与固定相作用强弱不同, 在一定的推动力下,它们在固定相中滞留的时间 长短不一,从而使它们按一定顺序从色谱柱中先 后流出。
经典的柱色谱
• 渐渐地,人们以传统色谱为蓝本开发了气相色谱
经典的柱色谱
气相色谱示意图
• 高效液相色谱:效仿气相色谱,用高压输液泵将 流动相输入高柱效色谱柱,使其在柱内快速流动 ,并在柱末端附加检测器检测分离情况。高效液 相色谱就这样诞生了。
缺点:只适合于能产生荧光的物质的检测。
d. 蒸发光散射检测器(ELSD)
工作原理: 通过检测光散射程度而测定溶质 浓度的检测器。
适用范围: 适用检测挥发性低于流动相的组分,主要用于检测糖类, 高级脂肪酸,磷脂, 维生素,氨基酸,甘油三酯及甾体等。
5 数据处理系统
该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和 处理等操作,使样品的分离、制备或鉴定工作能正确 开展。