蛋白质组学及其在寄生虫学研究中的应用

Co-IP鉴定细胞内相互作用 鉴定细胞内相互作用
利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合 到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
（四）蛋白质组学研究的生物信息学
生物信息学是蛋白质组学研究的一个不 可缺少的部分 构建和分析双向凝胶电泳图谱 数据库的搜索与构建
II.
蛋白质组学研究的主要支撑 技术与原理
大规模蛋白质分离技术：双向凝胶电泳 蛋白质鉴定技术：生物质谱分析 蛋白质相互作用鉴定技术 生物信息学分析技术
样品制备
• 原则：
提高全蛋白的溶解度，防止蛋白降解，去除核酸、脂类等干扰杂质；
• 溶解液、水化液：
Chaotropes: Urea, Thiourea Detergents: CHAPS, CHAPSO, Triton X-100, SB3-10, ASB-14 Reducing agents: DTT, Tributylphosphine (TBP) Protease inhibitor: Cocktail、Tris-base、EDTA
“两谱两图三库”(表达 谱、修饰谱、连锁图、 定位图、样本库、抗 体库、数据库)” 2007年，我国科学家 已经成功测定出6788 个高可信度的中国成 人肝脏蛋白质，发现 了包含1000余个“蛋 白质-蛋白质”相互作 用的网络图；建立了 2000余株蛋白质抗体， 系统构建了国际上第 一张人类器官蛋白质 组“蓝基因的功能。
GST-Pull down 靶定体外相互作用的蛋白
实验原理： 实验原理： 利用重组技术将 探针蛋白与GST （Glutathione S transferase）融 合，融合蛋白通 过GST与固相化 在载体上的GTH （Glutathione） 亲和结合。因此， 当与融合蛋白有 相互作用的蛋白 通过层析柱时或 与此固相复合物 混合时就可被吸 附而分离 。
BPRC
北京蛋白质组研究中心(BPRC) 于2007年11月经科技部正式批准建设， 是我国蛋白质科学研究的重要基地，是国际 HLPP的执行总部和数据中心。 我国蛋白质科学研究的重要基地， 的执行总部和数据中心。 我国蛋白质科学研究的重要基地 的执行总部和数据中心
科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973” 疾病蛋白质组研究列入我国 计划项目和“863 计划项目 计划项目； 计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金 委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 我国在肝癌、鼻咽癌、白血病和肺癌蛋白质组 我国在肝癌、鼻咽癌、白血病和肺癌蛋白质组 肝癌 研究方面取得了较大的进展。 研究方面取得了较大的进展。
发展历程
1994年，澳大利亚的学家首次提出蛋白质组概念； 1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心 （Australia Proteome Analysis Facility，APAF）； 2000年，第一个完整蛋白质组生殖器支原体蛋白质组公布。 同年，美国启动“蛋白质结构计划”； 2001年，国际人类蛋白质组组织(HUPO)宣告成立,与此同时 《Science》杂志把蛋白质组学列为六大科学研究热点之一， 其“热度”仅次于干细胞研究，名列第二； 2002年，首届国际人类蛋白质组大会召开。同年，美国开始 实施“临床蛋白质组学计划”；
HPLC-ESI/MS Agilent 1100series
蛋白质相互作用研究技术
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形 成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成 者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制 几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制 DNA 与转录、蛋白质的合成与分泌、 与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢 等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。
蛋白质组学及其在寄生虫学研究中的应用
报告人： 报告人：孔庆明
2010.09.09
主要内容
I. 蛋白质组学概述 II. 蛋白质组学研究的主要技术与原理
大规模蛋白质分离技术及质谱分析技术 蛋白质相互作用鉴定技术
III. 蛋白质组学在寄生虫学研究中的应用
蛋白质组学在寄生虫学研究中的应用概述 弓形虫蛋白质组学的研究近况 寄生虫蛋白质组学研究展望
基本原理： 基本原理：
将样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比(m/z)的差异来 分析蛋白质和多肽的分子量，对蛋白质进行鉴定,定量及其修饰 点分析。一台质谱仪一般有进样装置，离子化源，质量分析器， 离子检测器和数据分析系统组成。
பைடு நூலகம்
基质辅助激光解析-飞行时间质谱（ 基质辅助激光解析 飞行时间质谱（MALDI-TOF) 飞行时间质谱
• 基本原理： 基本原理： 将样品均匀包埋在固体基质中， 基质吸收激光提供的能量而蒸发， 携带部分样品分子进入气相，并 将一部分能量传递给样品分子使 其离子化，然后通过不同离子的 飞行时间不同进行分离检测。 • 特点： 特点： 可分析分子量较大的分子，对 杂质的忍耐性较好,适用于混合物 的分子量测试;
液相色谱-电喷雾质谱（ 液相色谱 电喷雾质谱（ESI-MS） 电喷雾质谱 ）
基本原理： 基本原理：
通过样品溶液在 毛细管喷雾口形成液滴， 在强电场和热的干燥气的 共同作用下，液滴逐渐被 气化，同时也被质子化； 喷雾口与离子聚焦传输区 之间的压力差推动质子化 样品进入质量分析器进行 检测 。
4800 MALDI TOF/TOF Analyzer (Applied Biosystems, ABI)
Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
activation domain
DNA binding domain
UAS (upstream activation sequence)
transcription machinery
蛋白质组学概述
• 一个概念：
Proteome：“protein + genome ”, 1994年澳 大利亚学者Williams & wilkins提出了蛋白质组的概 念，意即“一种基因组所表达的全套蛋白质”。 Proteomics：以细胞内全部蛋白质的存在及其活动 方式为研究对象，主要研究参与特定生理或病理状 态下所有蛋白质种类及其与周围环境分子相互关系 的一门学科。
• 灵敏度：1 ng/蛋白点 • 注意：
戊二醛可以提高银染的灵敏度； 水的纯度对染色结果影响非常大，一般要用millipore 纯水。
IBV-H52粒子全蛋白分离图谱 粒子全蛋白分离图谱
基于双向凝胶电泳的定量蛋白质组研究
CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes
Cy 5
Cel l
60 Numerical value 50
Number
40 30 20 10 0
线性 (Percent) Percent
• 样品清洗：
Nucleic acid：超声波、核酸酶 Lipoid：过滤、
样品预分级
蛋白质溶解性：可溶性蛋白、 蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等
蛋白质定位：膜蛋白、 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等
蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等
样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样 量和检测灵敏度。 量和检测灵敏度
蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标 志和基础
瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的 瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、 SWISS 拥有目前世界上最大 蛋白质组数据库。 蛋白质组数据库。 目前应用最普遍的数据库有： 目前应用最普遍的数据库有：
MIPS - Protein sequences and complete genomic sequences PDB - Protein Data Bank PIRcoPIR-international - Protein sequence database co-developed by NBRF, MIPS and JIPID SWISSSWISSSWISS-PROT - SWISS-PROT annotated protein sequence database
IBV的纯化及纯化效果的验证 的纯化及纯化效果的验证
A：20%-30%蔗糖界面的IBV;
B:30%-40%蔗糖界面的IBV
(1)蔗糖密度梯度离心病毒条带
(2)纯化IBV病毒粒子电镜观察
(3)IBV粒子蛋白的Western blotting检测
银染
• 原理：
银离子在碱性条件下被还原成金属银颗粒，沉淀在 蛋白表面而显色。
发展历程
2002年11月， “人类肝脏蛋白质组计划”(HLPP)和“人类血 浆蛋白质组计划”(HPPP) 等重大国际合作计划正式启动； 2003年人类蛋白质组计划(HPP)提出并开始实施； 2003-2004年，又启动了人类脑蛋白组计划，大规模抗体计划， 蛋白质组标准计划及模式动物蛋白质组计划； 2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。 2006年启动CVI计划，即心血管蛋白质GO注释研究计划 (Cardiovascular GO Annotation Initiative)； 2008-2010年，人类蛋白质组学计划（HPP）逐渐进入全面实 施阶段。（1% 20%）
gene
酵母双杂交系统的应用
• • 分析已知蛋白之间的相互作用， 分析已知蛋白之间的相互作用，绘制蛋白质相互作用 系统图谱 对蛋白质功能域的分析
通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理，其结果若与结 构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。
• •
用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA， 研究 ， 用已知功能的蛋白基因筛功能