03-分子荧光和磷光光谱
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分子荧光和磷光光谱分析法讲解
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
第十一章 分子发光―荧光、 磷光和化学发光光谱法Molecular .
已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍，研究内
容2已020从/6/15经典的荧光分析方扩展到新近发展起来的新技术。
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§11－1 分子荧光和磷光光谱法
1．产生机理
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动 能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化 学能或光能等到)后天激发为激发态。激发态是很 不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回 基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光) 的形式释放能量，就称为“发光”；如果物质的 分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的 电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论 来讨论荧光和磷光的产生机理。
进入二十世纪以后，荧光现象被研究得更多了，在理论 或实验技术上都得到极大的发展。特别是随着激光、计 算机和电子学的新成就及技术的引入，大大推动了荧光 分析法在理论上及实验技术的发展，出现了许多新的理 论和新的方法。
在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作
者从事荧光分析方面的研究工作。到了 下一张幻灯片
磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光。1944年 Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光 是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光， 它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分 析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也 不断得到发展。
2020/6/15
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处于分子基态单重态的分子轨道上的电子，激发 时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上（不符 合光谱选择定则），但处于单重激发态的轨道上 的电子，可以通过体系跨越（系间窜跃），转移 到三重态轨道上；在这个过程中，处于激发态的 电子自旋发生变化，这个过程需要时间较长，故 处于三重激发态的寿命为10－4~1s；当其由三重激 发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光。
分子荧光和磷光光谱分析法61页PPT
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
61
分子荧光和磷光光谱分析法
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
第七章分子发光荧光与磷光详解演示文稿
i1
kF、 kp主要取决与荧光物质的分子结构； st系间窜跃效率。
ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。
大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；
例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素 F=1
化合物
F 0.11
第三十一页，共69页。
第十二页，共69页。
S1
外转移
荧光
反系间 窜跃 系间 窜跃
１. 辐射跃迁的类型
共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec
２. 无辐射跃迁的类型
振动弛豫: Vr 10-12sec T1 外 转 移:无辐射跃迁回
迟
到基态
滞
荧 光
lex =290nm (MAX)
l
lem= 620nm(MAX)
镜像规则的解释
大多数吸收光谱的形状表明了 分子的第一激发态的振动能级 结构，而荧光发射光谱则表明 了分子基态的振动能级结构
一般情况下，分子 的基态和第一激发 单重态的振动能级 结构相似，因此吸 收光谱的形状与荧 光发生光谱的形状 呈镜像对称关系。
对于处于S1(T1)电子态的荧光体来说，其平均 寿命()可以左式表示：
F(P)
1
n
kF(P) ki
i1
第三十页，共69页。
3. 荧光(磷光)的量子产率
荧光量子产率的定义：
发射荧光的分子数
F 激发分子总数
发射磷光的分子数
P 激发分子总数
F
kF
n
kF ki
i1
P st
kP
n
kP ki
1. 分子能级与跃迁
分子荧光与分子磷光
光与物质作用产生激发态分子，其返回基态时的发光现象称为光致发光，荧光和磷光都是光致发光。
多环芳烃和某些金属配合物分子结构中含有大平面丌电子共轭体系，是常见的荧光分子，可以直接进行荧光分析。
对于那些无荧光或荧光较弱的分子，通过与荧光试剂反应后可进行间接荧光分析。
分子荧光光谱法某些物质被紫外光照射激发后，在回到基态的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，通过测量荧光强度进行定量分析的方法。
测定原理：由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。
为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。
为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器。
荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。
（1）激发光源在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。
（2）样品池荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。
（3）单色器光栅（4）检测器由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发光成直角。
荧光分析方法的特点：（1）灵敏度高（2）选择性强（3）试样量少和方法简单（4）提供比较多的物理参数荧光分析法的弱点是它的应用范围小。
因为本身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质进行分析，其数量也不多；另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测定对环境因素敏感，干扰因素较多。
分子磷光光谱法处于第一最低单重激发态分子以无辐射弛豫方式进入第三重激发态，再跃迁返回基态发出磷光。
测定磷光强度进行定量分析的方法。
分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光是第一激发单重态的最低能层，经系间跨越跃迁到第一激发三重态，并经振动弛豫至最低振动能层，然后跃迁回到基态发生的。
与荧光相比，磷光具有如下三个特点：（1）磷光辐射的波长比荧光长，分子的T1态能量比S1态低。
第五章 荧光及磷光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象。
光致发光
常见的光致发光现象是荧光和磷光。
荧光:
激发光停止照射后，发光过程持续
10-9-10-6s。
磷光:
激发光停止照射后，发光过程持续 10-3-10s。
分析方法特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个 数量级； ★线性范围宽，试样用量少，方法简便； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外 可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；
活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素和酚 酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有，
芴的荧光强，而联苯的荧光弱。
5.3 影响因素
5.3.1 温度与溶剂效应
溶剂效应
溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。 一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。 特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作 用，如氢键的生成和化合作用。 一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于
12:36:43
去活化 (5) 磷光发射
T1最低振动能级→ S0时产生磷光辐射 10-2-10s，寿命长多了！能量更低！
室 温 无 磷 光
(6) 外部转换 external conversion
激发态分子和溶剂等能量转换 荧光/磷光 消失，称熄灭或猝灭
12:36:43
去活化演示 驰豫 吸收
e
e
e
基态单重态
激发单重态
激发三重态
5.2.2
去活化过程
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能 量；激发态停留时间短、返回速度快的途径，发 生的几率大，发光强度相对大。
传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
医学：分子荧光与分子磷光分析法
在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤诊断
荧光与磷光分析法可用于肿瘤的早期 诊断和监测，通过检测肿瘤标志物或 特定基因的表达水平，为肿瘤治疗提 供依据。
感染性疾病诊断
药物疗效评估
荧光与磷光分析法可用于评估药物治 疗的效果，通过监测疾病标志物的变 化，了解药物治疗对疾病的影响。
荧光与磷光分析法可用于检测病原体 和抗体，快速准确地诊断感染性疾病， 如细菌、病毒和寄生虫感染。
06
未来展望
分析技术的发展趋势
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的快速发展，分析方法将更加智
能化，提高检测的准确性和效率。
高灵敏度
02
通过改进荧光和磷光的发光机制，提高检测的灵敏度，实现对
低浓度生物分子的快速检测。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，实现对复杂生物样本中多种生物分
子的快速、准确检测。
在医学领域的应用前景
01
02
03
疾病诊断
利用荧光和磷光分析法对 生物分子进行高灵敏度检 测，为疾病诊断提供准确 依据。
药物研发
通过荧光和磷光分析法对 药物与生物分子相互作用 进行研究，为新药研发提 供有力支持。
个体化医疗
根据个体基因组、蛋白质 组等信息的检测结果，制 定针对性的治疗方案，实 现个体化医疗。
在生物分子检测中的应用
蛋白质检测
荧光与磷光分析法可用于检测蛋白质的含量和性质，有助于研究蛋 白质的功能和相互作用。
核酸检测
通过荧光与磷光分析法，可以检测DNA和RNA的含量和序列，用 于基因诊断、基因表达研究和疾病诊断。
生物标记物检测
荧光与磷光分析法可用于检测生物体内的生物标记物，如肿瘤标志物、 炎症标志物等，有助于疾病的早期发现和治疗监测。
分子荧光与分子磷光光谱法
11
（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根 据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波 长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测 得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱 曲线。
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund规则）
3
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性， 其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重 态和三重态）。
当两个电子能级非常靠近以至其振
动能级有重叠时，常发生电子由高
S2
能级以无辐射跃迁方式转移至低能
级。右图中指出，处于高激发单重
态的电子，通过内转移及振动弛豫，
均跃回到第一激发单重态的最低振
动能级。
S0
内转移
S1 T1
吸光1 吸光2
荧光、磷光 能级图
6
荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
基态各振动能级时，将得到最大波长
指不同多重态间的无辐射跃迁，例如
S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时，电子由S1的较低振动
能级转移至T1的较高振动能级处。有
S2
时，通过热激发，有可能发生T1→S1，
然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间窜跃
S1 T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
（二）激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根 据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，固定测量波 长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测 得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制 激发光谱 曲线。
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
三重态能级低于单重态 （Hund规则）
3
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性， 其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重 态和三重态）。
当两个电子能级非常靠近以至其振
动能级有重叠时，常发生电子由高
S2
能级以无辐射跃迁方式转移至低能
级。右图中指出，处于高激发单重
态的电子，通过内转移及振动弛豫，
均跃回到第一激发单重态的最低振
动能级。
S0
内转移
S1 T1
吸光1 吸光2
荧光、磷光 能级图
6
荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
基态各振动能级时，将得到最大波长
指不同多重态间的无辐射跃迁，例如
S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时，电子由S1的较低振动
能级转移至T1的较高振动能级处。有
S2
时，通过热激发，有可能发生T1→S1，
然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧
光的机理。
系间窜跃
S1 T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
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定量依据与方法
(1)定量依据 定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光量 a和荧光量子效率ϕ ： 正比于吸收的光量I 和荧光量子效率ϕ 吸收的光量 If = ϕ Ia
ε 由朗伯-比耳定律： 由朗伯 比耳定律： Ia = I0(1-10-ε l c ) 比耳定律 ε ε If = ϕ I0(1-10-ε l c ) = ϕ I0(1-e-2.3ε l c )
绿色荧光蛋白
GFP 绿色荧光蛋白
GFP
Generation of Molecular Fluorescence and Phosphorescenc级、振动能级和转动能级 基态（S0）→激发态(S1、S2、激发态振动能 级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)； 速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
分子发光分析
Molecular luminescence analysis
中南民族大学 2011.秋
内容(contents) 内容
原理
分子荧光与磷光产生过程 激发光谱与荧光光谱 荧光的产生与分子结构关系 影响荧光强度的因素
仪器 应用
发光现象
起因
是吸收了外在提供的能量引起的
外在的能量
热 电 光 化学能
荧光
1852年 Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时， 1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光 在考察奎宁和叶绿素的荧光时 荧光的波长比 稍为长些 计观察到其荧光的波长 入射光的波长稍为长些， 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他 还由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语. 还由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语
浓度很低时，将括号项近似处理后： 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 ϕ I0 ε l c = Kc
定量依据与方法
（2）定量方法
标准曲线法： 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘 制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光 强度，在标准曲线上求出浓度； 比较法： 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度， 比较；
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越
内转移
外转移
振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态 单重态的最低振动能级→基态； 荧光 单重态 磷光：10-4～10s；第一激发三重态 三重态的最低振动能级→基态； 磷光 三重态
能级图
内转换 S2 内转换 振动弛豫 系间跨越
利用汞蒸气放电发光的 应用最广泛的一种光 光源；常用其发射365 nm、 光源；常用其发射365 nm、 可发射250~800nm 源，可发射 405 nm、 436 nm 三条谱线 nm、 很强的连续光源 以365 nm 的谱线最强
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫 描可分为固定波长差(∆λ)和固定能量差及可变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄， 同步扫描技术可简化光谱 减少光谱重叠，提高分辨率； 如图。 合适的∆λ 减少光谱重叠； ∆λ可 合适的∆λ可减少光谱重叠 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发 射光谱严重重叠，但∆λ<15nm的同步光谱 只显示酪氨酸特征光谱； ∆λ>60nm时，只 显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。
激发光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何 选择？ 荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的 荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图 中曲线I） 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最 多，荧光强度最大；
荧光（磷光） 荧光（磷光）光谱
固定激发光波长(选最 大激发波长), 化合物发 射的荧光(或磷光强度) 与发射光波长关系曲线( 图中曲线II或III)。
荧光和取代基
长共轭结构
共轭系统↑→ ϕf ↑→λex、 λem↑ 共轭系统 λ
取代基
供电子基： 供电子基： –NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN 、 、 →ϕf ↑，F↑ ， 吸电子基： -NO2、-COOH、-NHCOCH3、 吸电子基： 、 -C=O、-NO、-SH、-X 、 、 、 → ϕf ↓，F↓，甚至荧光熄灭 ， ， -R、-SO3H、-NH3+→对ϕf 无影响 、 、 对
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似； 基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
镜像规则
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
分子产生荧光的条件
分子产生荧光必须具备的条件
影响荧光的外部效应
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都 将使化合物的荧光发生变化；
极性↑→ϕf↑→F↑→λ↑ λ 极性 粘度↓→分子间碰撞几率 分子间碰撞几率↑→F↓ 粘度 分子间碰撞几率 含重原子(CBr4、CH3CH2I)→F↓ 含重原子 形成氢键→S1*(V=0) 分子 分子↓→F↓ 形成氢键
发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如 能级图λ 2 ,λ 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发 单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一 定的荧光(如λ ‘2 )。
镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状 一样）成镜像对称关系。
镜像规则
具有合适的结构（强的紫外可见吸收） 具有一定的荧光量子产率
荧光量子产率（ϕ）
发射的光量子数 ϕ= 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数 有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射
化合物的结构和荧光
（1）跃迁类型：π* → π的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
吸收池
荧光分析方法与应用
1. 特点
（1）灵敏度高
比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1µg/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。 缺点
S1 能 量 吸 收 发 射 荧 光 外转换 发 射 磷 光 T1 T2
振动弛豫
S0
λ1
λ2
λ ′2
λ3
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一 激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
光谱例子
荧光发射光谱 荧光激发光谱 磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（ 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
620
激发光谱和发射光谱关系
Stokes位移 Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波 长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 内滤光作用 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 自吸现象 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
影响荧光的外部效应
5.溶液荧光的猝灭 5.溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭:荧光物质浓度超过 碰撞猝灭:荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分子 时 间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。(浓度限量 浓度限量1µg ~ 间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。 浓度限量 1mg/ml) 荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄灭的物 荧光熄灭剂 ： 如卤素离子、 重金属离子、 质 。 如卤素离子 、 重金属离子 、 氧分子以及硝基化 合物、 重氮化合物、 羰基、 合物 、 重氮化合物 、 羰基 、 羧基化合物均为常见的 荧光熄灭剂。 荧光熄灭剂。
辐射能量传递过程
荧光发射： 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→ 基态（ 多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 λ ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波 长长； λ ‘2 > λ 2 > λ 1 ； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→ 磷光发射 基态（ T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫 → T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
多组分混合物的荧光分析
如果两组分的荧光峰相互不干扰, (1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接 测定 • 可分别在各自的λ荧波长处测定,求出它们的 可分别在各自的λ 波长处测定, 含量 如果两组分的荧光峰相互干扰, (2) 如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光 谱有显著区别, 谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产 生荧光峰,另一组分不产生荧光; 生荧光峰,另一组分不产生荧光; • 可选用不同的激发光进行测定