分子荧光光谱法

氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；
铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
(2)生物与有机化合物的分析
荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能
发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生
荧光。 名 称 结 构 式
CH2N2
应
用
9-蒽基重氮甲烷
某些羧酸
丹磺酰氯
N(CH3)2
伯胺、仲胺、酚或 氨基酸
SO2Cl
三。实验方法
1.氧氟沙星荧光光谱绘制 取氧氟沙星对照品约0.100克，精密称定，置 于100ml量瓶中，用0.01mol/L HCl溶解后加水 至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取储备液 0.4ml置于50ml量瓶中，加0.5mol/L HAc溶液 至刻度，摇匀，在荧光光度计上扫描氧氟沙星 的激发光谱和发射光谱。激发波长367nm，发 射波长505nm
（2）定量方法
标准曲线法：
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
5.荧光分析法的应用
(1)无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；
取左旋氧氟沙星片一片，精密称定后置于100ml 量瓶中，加0.05mol/L HCl溶液10ml充分振摇溶 解后，加水稀释至刻度，摇匀。静置后干过滤。 精密量取滤液3.00ml置于100ml量瓶中，用 0.5mol/L HAc定容至刻度，摇匀。在 Ex=367,Em=505nm处测定荧光强度，根据标准 曲线计算氧氟沙星片的含量
氧氟沙星片含量 = (Cx3.30/ms) x 100%
思考题
1.干扰荧光分光光度法测定的因素有哪些？ 2.应如何确定被测物的激发和发射波长？ 3.
CRT型荧光光谱仪操作规程 一、标准曲线的测定和绘制
1.点击标准曲线，进入标准曲线界面 2.在石英比色皿中，装入第一个标准溶液 (10mg/L)，放入样品室内 3.输入浓度值10mg/L,点击测试 4.电脑上提示对话框波长是否到确定，点击确定 5.待电脑上显示荧光值后，点击添加 按照上述步骤，再分别测试 20mg/L,30mg/L,40mg/L,50mg/L的荧光值， 记录不同浓度的荧光值
二、荧光光谱法基本原理
分子的激发与失活
1. 分子的多重态 单重态 一个所有电子自旋都配对 的分子的电子状态。大多数有机 物分子的基态是单重态。当基态 一对电子中的一个被激发到较高 能级，其自旋方向不会立刻改变， 分子仍处于单重态。
三重态 有两个电子的自旋不配对 而平行的状态。激发三重态能量 较激发单重态低。
2.标准曲线制作
精密量取储备液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml 分别置于 50ml 量瓶中，加0.5mol/L HAc 溶液至刻度，摇匀。其浓 度相当于10,20,30,40,50 mg/L. 在Ex=367nm,Em=505nm处测定荧光强度，并建立 标准曲线。
3.氧氟沙星片含量测定
辐射跃迁: 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，
速率常数kf为106~109s-1。
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 （ 多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 ‘2的荧光； 107～10 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波 长长； ‘2 > 2 > 1 ；
2、激发光谱和荧光光谱
任何荧光化合物都具有两种特征 光谱： •荧光激发光谱（吸收光谱） —固定某一发射波长，测定该波 长下的荧光发射强度随激发波长 变化所得的光谱。 •荧光发射光谱（荧光光谱）—
—固定某一激发波长，测定荧光
发射强度随发射波长变化得到的 光谱。
3、荧光与结构的关系
（1）电子跃迁类型 发射 π*→π跃迁比π*→n跃迁更常见 （2）共轭效应 芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射
的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光 ( 测量 ) 波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
620
3.激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的 波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量 (如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一 激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波 长一定的荧光(如 ‘2 )。 c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。
6.点击拟合，电脑上会显示拟合曲线及相关参数， 记录相关参数
二、未知样品浓度的测定
1.点击样品浓度，进入未知样品浓度测试的界面 2.点击标准曲线，屏幕上会显示刚做过的标准曲 线 3.在石英比色皿中，装入未知样品浓度的溶液， 放入样品室内 4.点击测试 5.记录未知样品测试的荧光值及浓度
数未取代芳烃在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程 度增加，荧光峰红移，Φ↑。简单杂环化合物不发荧光， 但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。 （3）平面刚性结构效应 有刚性结构的分子容易发荧光， 刚性和共平面性的增加有利于荧光发射。
CH2
联苯 Φ=0.2
芴 Φ=1
(4)取代基的影响 芳环上有羧基、羰基或 亚硝基等吸电子基团取 代时，荧光减弱； 给电子取代基如-OH、NH2、-CN、-OCH3等会使 荧光强度增加。 重原子效应 含有重原 子的分子中，系间窜跃 的几率大,使荧光减弱， 磷光增强。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 和发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差 () 和固定能量差及可 变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率； 如图。 合适的可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相 似，发射光谱严重重叠，但 <15nm 的同步光谱只显示酪氨酸 特征光谱； >60nm时，只显示色 氨酸的特征光谱，实现分别测定。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧 光强度最大； 2.荧光光谱(或磷光光谱) 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光 (或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
无辐射跃迁 ☆振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级 转至较低振动能级的过程，其效率较高。
☆内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回
到低能级的分子内过程。 ☆系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多 重态发生变化的过程。 ☆外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转 换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的 减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不
一定发射荧光或磷光； ★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。 基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光 谱法。
一。目的和要求
学习荧光分光光度计的使用方法 掌握荧光分光光度法测定样品含量的基 本方法 荧光分光光度计 上海仪电CRT型
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布
与第一激发态上的各振动能级
分布类似；
基态上的
零振动能级与 第一激发态的
二振动能级之
间的跃迁几率 最大，相反跃
迁也然。
三、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数 吸收的光量子数
化合物 苯
C6H5COOH C6H5NO2 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5CN
相对荧光强度 10
3 0 17 18 20 20 20

C6H5Cl C6H5Br C6H5I