分子荧光分析法基本原理
分子荧光法测定实验报告
一、实验目的1. 熟悉分子荧光法的基本原理和操作步骤。
2. 掌握荧光光谱仪的使用方法。
3. 通过实验，测定罗丹明B的荧光光谱，分析其激发光谱和发射光谱。
4. 掌握荧光定量分析的方法。
二、实验原理分子荧光法是一种灵敏的定量分析方法，基于物质在特定波长范围内吸收光能后，电子从基态跃迁到激发态，再回到基态时释放出一定波长的荧光。
罗丹明B作为一种荧光物质，在特定波长范围内具有明显的荧光特性。
通过测定罗丹明B的激发光谱和发射光谱，可以确定其最佳激发波长和发射波长，从而进行定量分析。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：荧光光谱仪、紫外-可见分光光度计、移液器、容量瓶、试管等。
2. 试剂：罗丹明B标准溶液、无水乙醇、蒸馏水等。
四、实验步骤1. 准备罗丹明B标准溶液：准确移取一定量的罗丹明B标准溶液，用无水乙醇稀释至100mL，配制成一定浓度的罗丹明B标准溶液。
2. 测定激发光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，扫描激发光谱，记录激发波长范围内荧光强度的变化。
3. 测定发射光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，以激发光谱中最大激发波长为激发波长，扫描发射光谱，记录发射波长范围内荧光强度的变化。
4. 荧光定量分析：取一定量的罗丹明B样品溶液，按照上述步骤测定其激发光谱和发射光谱，计算样品溶液中罗丹明B的浓度。
五、实验结果与讨论1. 激发光谱：罗丹明B的激发光谱显示，在激发波长为540nm附近，荧光强度达到最大值。
因此，选择540nm作为激发波长。
2. 发射光谱：罗丹明B的发射光谱显示，在发射波长为590nm附近，荧光强度达到最大值。
因此，选择590nm作为发射波长。
3. 荧光定量分析：根据罗丹明B的激发光谱和发射光谱，以及标准曲线，计算样品溶液中罗丹明B的浓度为1.2×10^-5 mol/L。
分子荧光基本原理
分子荧光基本原理分子荧光是一种分子从高能级激发态返回到低能级基态时发出的光。
分子荧光主要是由于分子在受到激发后，电子跃迁至激发态，再回到基态时放出荧光。
这个过程是通过分子的内部结构和电子态之间的相互作用完成的。
分子荧光的基本原理可以通过分子的能级结构来解释。
在分子内部，存在着不同的能级，分别是基态、激发态、离子态等。
当分子受到能量输入（如光或热激发）时，电子可以跃迁到激发态。
在这个过程中，分子吸收能量，电子跃迁至高能级的激发态。
然后在一个相对较短的时间内，电子会从激发态返回到基态。
在这个过程中，分子释放出多余的能量，产生出发光。
这就是分子荧光的基本原理。
分子荧光的发生与能级结构有着密切的关系。
分子内部的能级结构是由分子的内部结构和分子轨道的排列规则来决定的。
在分子中，电子分布在不同的分子轨道上，这些轨道间的跃迁会导致分子的吸收和发射光谱。
当分子受到激发后，电子会占据一个比较高的能级的激发态。
随后，电子会通过辐射的方式返回到基态，释放出比较低能量的光子。
这个过程中，光子的波长和分子的能级结构有直接的关系。
分子的内部结构和键合方式也会影响分子的荧光性质。
比如，共轭结构的分子通常会表现出较强的荧光性质，因为共轭结构可以增加分子的π电子系统，加强分子的电子跃迁和荧光的产生。
此外，分子的溶剂环境也会影响分子的荧光性质。
在极性溶剂中，分子的电子态和能级结构会发生改变，从而改变了分子的光谱性质。
分子荧光的原理也可以应用于分析化学和生物化学领域。
分子荧光是一种非常敏感的检测技术，可以用于分析样品中的分子结构、浓度、和环境条件。
比如，荧光标记法可以用于追踪生物分子在细胞中的位置和运动。
利用分子的荧光性质，可以研究生物分子的相互作用、变化、和代谢过程。
此外，分子荧光也可以应用于环境监测和药物研发等领域。
总之，分子荧光是一种由分子内部结构和能级结构决定的发光现象。
分子在受到激发后，通过电子跃迁回到基态时释放荧光，这一过程受分子的结构、能级结构、溶剂环境等因素的影响。
荧光分析法的基本原理
荧光分析法的基本原理
荧光分析法是一种常用的分析化学方法，它利用物质在受到激发后发出的荧光
来进行定量或定性分析。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，因此在生物医学、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
荧光分析法的基本原理是物质受到激发后发出的荧光强度与其浓度成正比。
当
物质受到特定波长的激发光照射后，其中的分子会吸收能量并处于激发态，随后分子会自发地返回基态并释放出能量，这种能量以荧光的形式发射出来。
荧光分析法利用荧光强度与物质浓度的关系来进行分析，通过测量样品的荧光强度，可以间接地推断出样品中目标物质的浓度。
荧光分析法的基本原理还包括激发光源、激发光和荧光检测器。
激发光源通常
采用紫外灯或激光器，用于提供足够的能量来激发样品中的分子。
激发光是指对样品进行激发的光线，其波长通常由样品的特性决定。
荧光检测器则用于测量样品发出的荧光强度，并将其转化为电信号进行处理和分析。
在实际应用中，荧光分析法可以应用于各种领域。
在生物医学领域，荧光分析
法可以用于检测生物标记物、药物浓度、蛋白质含量等，具有灵敏度高、特异性强的优点。
在环境监测领域，荧光分析法可以用于检测水体中的重金属离子、有机物污染物等，能够快速、准确地进行分析。
在食品安全领域，荧光分析法可以用于检测食品中的添加剂、农药残留、重金属等有害物质，为食品安全提供可靠的分析手段。
总之，荧光分析法作为一种灵敏度高、选择性好的分析方法，具有广泛的应用
前景。
通过深入理解荧光分析法的基本原理，结合实际应用需求，可以更好地利用这一分析方法，为各个领域的分析工作提供更加准确、快速、可靠的支持。
分子荧光分析法
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1.分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
1.激发光源：能发出强度较大，连续稳定的光 源。
主要有：溴钨灯、氢灯、高压汞灯、氙弧灯 2.分光系统： 第一单色器（激发单色器）：位于光源与液槽
间，滤去非选择波长的激发光。 第二单色器（发射单色器）：位于液槽与检测器
之间，滤去反色光，散色光和杂质产生的荧 光。
第五章 分子荧光分析法
3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。
4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。 光二极管阵列检测器。
二、仪器的类型 1.光电荧光计：滤光片荧光计。
溴钨灯，滤光片，光电管。 2.荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，
光电倍增管。
第五章 分子荧光分析法
第三节 定性定量分析
第五章 分子荧光分析法
第一节 第二节 第三节 第四节
基本原理 仪器 定性定量分析 荧光新技术和应用实例
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程 分子的激发态 荧光的产生 激发光谱和荧光光谱 激发光谱和荧光光谱的关系 二、分子结构与荧光关系 荧光效率 分子结构与荧光的关系 影响荧光强度的外界因素 荧光强度与荧光物质浓度的关系
第十三章-荧光分析法PPT课件
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计（分子荧光）Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子荧光分析法基本原理
一. 分子荧光的发生过程
（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态
大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=½+(-½)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；
图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）
当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即
ÄS=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；
如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3
即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；
“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。
（二）分子去活化过程及荧光的发生：
（一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）
处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：
1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
图2 分子吸收和发射过程的能级图
2. 内转换：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内转换”。
（“ 内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间）
3. 外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用（如碰撞）而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程称“外转换” 。
4.系间跨跃：当电子单线激发态的最低振动能级与电子三线激发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的 S—T 跃迁，这一过程称为“系间跨跃” 。
（含有高原子序数的原子如 Br2、I2 的分子中，由于分子轨道相互作用大，此过程最为常见。
）
5. 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫—内转换—振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时，第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为“荧光发射”。
如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-8秒。
（它代表荧光的寿命）
由于不同电子激发态（S）的不同振动能级相重叠时，内转换发生速度很快（容易），在10-11~1013秒内完成，所以通过重叠的振动能级发生内转换的几率要比由高激发态发射荧光的几率大的多，因此，尽管使分子激发的波长有短（l1）有长（l2），但发射荧光的波长只有l3（>l1>l2）。
6. 磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为“磷光发射”。
（磷光的波长l4较荧光的波长l3稍长，发生过程较慢约 10-4~10s）
由于三线态 — 单线态的跃迁是禁阻的，三线态寿命比较长，（10-3~10s 左右），若没其它过程同它竞争时，磷光的发生就有可能；由于三线态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象。
因此，试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光。
总之：处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪种途径的速度快，哪种途径就优先发生。
如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快，则荧光发生几率高，强度大。
如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢，则荧光很弱或不发生。
（三）荧光量子效率：
物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值。
(1)
F 数值在 0~1 之间。
他的大小取决于物质分子的化学结构及环境（t0c、pH 、溶剂等）。
二. 激发光谱与荧光（发射）光谱
1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(F)，作F—l光谱图称激发光谱。
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长l ex，选用l ex可得到强度最大的荧光。
2. 荧光光谱：选择l ex作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录每一波长下的F，作 F- l光谱图称为荧光光谱。
荧光光谱中荧光强度最强的波长为l em 。
l ex 与l em一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
三. 荧光与分子结构的关系
1. 分子结构与荧光
具有p、 p 及n、 p 电子共轭结构的分子能吸收紫外和可见辐射而发生 p -p* 或 n - p* 跃迁，然后在受激分子的去活化过程中发生p*- p或p*- n 跃迁而发射荧光。
发生p - p* 跃迁分子，其摩尔吸光系数（å）比n - p* 跃迁分子的大100—1000倍，它的激发单线态与三线态间的能量差别比n - p* 的大的多，电子不易形成自旋反转，体系间跨越几率很小，因此， p - p* 跃迁的分子，发生荧光的量子效率高，速率常数大，荧光也强。
所以——只有那些具有 p- p 共轭双键的分子才能发射较强的荧光；
p 电子共轭程度越大，荧光强度就越大（l ex与l em长移）大多数含芳香环、杂环的化合物能发出荧光，且 p 电子共轭越长，F越大。
2. 取代基对分子发射荧光的影响
（1）（苯环上）取代给电子基团，使 p 共轭程度升高à荧光强度增加：如–CH3，–NH2 ，–OH ，–OR等。
（2）(苯环上）取代吸电子基团，时荧光强度减弱甚至熄灭：如：，–COOH ，–CHO， –NO2 ，–N=N–。
（3）高原子序数原子，增加体系间跨越的发生，使荧光减弱甚至熄灭。
如：Br，I 。
3. 共面性高的刚性多环不饱和结高的分子有利于荧光的发射。
例如：荧光素呈平面构型，其结构具有刚性，它是强荧光物质；而酚酞分子由于不易保持平面结构，故而不是荧光物质。