第五章 分子荧光分析法
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荧光光谱分析法
2
分子荧光分析的特点：
1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出 限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到 10-10甚至10-12 g/ml。
2. 选择性好 3. 线性范围宽 4. 应用范围窄
3
第一节
荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生
16
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；
基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关
电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一
个发射态，如l 3 。
为什么？
15
c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关，各小峰 的高度与跃 迁几率有关。
5
小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
电子能级的多重性 M=2S+1
四、荧光试剂
荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反 应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析
分子荧光分析的特点：
1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出 限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到 10-10甚至10-12 g/ml。
2. 选择性好 3. 线性范围宽 4. 应用范围窄
3
第一节
荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生
16
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；
基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关
电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一
个发射态，如l 3 。
为什么？
15
c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关，各小峰 的高度与跃 迁几率有关。
5
小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
电子能级的多重性 M=2S+1
四、荧光试剂
荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反 应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析
第5章 荧光分析法与化学发光分析法
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
30
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
31
5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
－Cl、－Br、－I等
第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等
23
3．影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值的影响
荧光熄灭剂的影响
散射光的干扰
24
温度和溶剂
温度：温度升高，荧光物质的荧光效率 和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而 长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小， 荧光强度减小
化学发光分析主要用于定量分析。 1．化学发光强度与反应物浓度的关系
I Cl （t）＝ Cl dc A dt
55
2．常用发光试剂
（1）鲁米诺类 （2）光泽精类
（3）钌(Ⅱ)-联吡啶配合物
（4）其它化学发光试剂
56
5.2.5 应用与示例
1．无机化合物的分析 可以利用某些具有还原性的无 机阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对 化学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测 定此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某 些离子。 2．有机化合物的分析 可以利用物质的还原性，直接 被氧化剂氧化发光测定。
51
3．液相化学发光
常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉 碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米 诺是最常用的发光试剂 。
分子荧光分析法
1.荧光效率
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
第五章 荧光及磷光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象。
光致发光
常见的光致发光现象是荧光和磷光。
荧光:
激发光停止照射后，发光过程持续
10-9-10-6s。
磷光:
激发光停止照射后，发光过程持续 10-3-10s。
分析方法特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个 数量级； ★线性范围宽，试样用量少，方法简便； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外 可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；
活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素和酚 酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有，
芴的荧光强，而联苯的荧光弱。
5.3 影响因素
5.3.1 温度与溶剂效应
溶剂效应
溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。 一般溶剂效应指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。 特殊溶剂效应指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作 用，如氢键的生成和化合作用。 一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于
12:36:43
去活化 (5) 磷光发射
T1最低振动能级→ S0时产生磷光辐射 10-2-10s，寿命长多了！能量更低！
室 温 无 磷 光
(6) 外部转换 external conversion
激发态分子和溶剂等能量转换 荧光/磷光 消失，称熄灭或猝灭
12:36:43
去活化演示 驰豫 吸收
e
e
e
基态单重态
激发单重态
激发三重态
5.2.2
去活化过程
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时， 通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能 量；激发态停留时间短、返回速度快的途径，发 生的几率大，发光强度相对大。
传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
chapter5分子磷光和荧光
有不同衍射图
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
分子荧光分析法
实验技术
一、样品的制备 二、测定条件的选择
A、激发波长和发射波长的选择 B、狭缝宽度的选择
三、反应条件的选择
A、溶液酸度的选择 B、显色剂的浓度 C、温度的影响
分子荧光分光光度法的应用
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好，重现性好、方法 简捷以及取样量少等优点，使其越来越成为分析化学工作者 必需掌握的一种重要分析方法。另外仪器设备不复杂也是其 一大优点。
（b）、有机化合物的分析
医药卫生、环境保护、 农副产品质检等。
有机化合物的荧光分析是荧光分析法研究中最活跃、应用最广泛、 发展最有前途、涉及生命科学课题最多的分析法。
B、定量测定中的应用
分子荧光分析法可用于物质的常量、微量 以及痕量分析。
定量测定的依据：
定量分析常用的基本方法 1、标准对照法; 2、标准曲线法；
1. 打开荧光光度计和计算机，预热，对荧光光度计进行仪器初始化。 2. 选择测量参数。依次在不同的激发波长下扫描发射光谱，通过叠 加的谱图确定物质的荧光发射峰。最后确定最大发射波长值。 3. 在确定的最大发射波长下做激发光谱，测量物质的最大激发波长值。 4．记录四种物质的发射光谱和激发光谱，对它们 的荧光谱图进行比较分析。 5. 数据记录。
----苯环类物质的荧光光谱分析及定量测定
一、方法原理 二、分子荧光分光光度计 分子荧光分理
荧光的激发光谱和发射光谱
如果固定荧光的发射波长（即测定波长），而不断改变 激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度，所得 到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱（简称 激发光谱）。
如果使激发光的波长和强度保持不变，而不断改变荧光的 测定波长（即发射波长）并记录相应的荧光强度，所得到的 荧光强度对发射波长的谱图则为荧光的发射光谱(简称发射光 谱)。
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(2-巯基乙醇存在，pH9~10的缓冲溶液)
2.无机化合物的荧光分析 测定方法：与具有π电子共轭结构的有机化合物形成 荧光配合物
研究对象 ▪阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、 Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、 Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr ▪阴离子：CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合→原有荧光 配合物的荧光减弱甚至熄灭
IF 2.3I0abc
IF Kc 稀溶液
五、影响荧光强度的因素
1. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去激活的
几率减少，增加荧光效率，从而增加荧光强度。
2. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成
都将使化合物的荧光发生变化。
3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
第二节 荧光分析仪器
激发滤光片
发射滤光片
930型荧光计光路示意图
一. 主要组成及部件的功能
荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图
光源
激发单色器
氙 灯
光电倍增管
样品池
问题：荧光分光光度 计与紫外-可见分光光 度计有何异同点？
数据处理 仪器控制
发射单色器
光源
激发 单色器
样品池
发射 单色器
检测器
数据处理 仪器控制
3．下列对荧光的叙述正确的是：（ C ）
A．从第一电子激发态的不同能级发出光量子回到基态 B．从激发三线态的不同能级发出光量子回到基态 C．从第一电子激发态的最低振动能级发出光量子回到基态 D．从激发三线态的最低振动能级发出光量子回到基态
判断题
1. 体系间跨跃是因为激发态分子和溶剂分子发生碰撞而交换能量 所致。( )
（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强 吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭
2.化合物的结构与荧光
（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系
磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
l
‘ 2
>
l
2
>
l
1
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光波长(选最大激发光波长),化合物发 射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图 中曲线I ） 。
选最强荧光强度的激发光波长λex为测定波长， 以提高灵敏度。
[课后练习]
▪名词解释：荧光与磷光、振动弛豫 ▪溶液荧光光谱有哪些特征？ ▪能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？ ▪为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？
填空题
1．荧光是 物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的 返回基态时发射出的光
2．荧光和磷光的区别在于荧光是从单线激发态开始的，磷
光是由
。
3．荧光发射光谱也称荧光光谱，其发射波长总是
激发波长。
4．能够发射荧光的物质应具备的条件是
、
。
5．影响荧光强度的外部因素有
。
选择题
1．荧光物质的激发光谱与紫外吸收光谱的形状：（ B ） A．完全一样 B．基本相似 C．肯定不一样 D．难以说清
2．对荧光测定最有干扰的是：（ B ） A．波长比入射光长的瑞利光 B．波长比入射光长的拉曼光 C．波长比入射光短的瑞利光 D．波长比入射光短的拉曼光
荧光分析仪器的主要部件
➢激发光源：汞灯、卤钨灯、氙灯、 ➢分光系统：滤光片（两个）、单色器（光栅） ➢样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光 ➢检测器：紫外-可见（光电倍增管） ➢显示系统：指针式、数字式及计算机显示
二、荧光分析仪器的类型 ➢1.荧光光度计 ➢2.荧光分光光度计
➢荧光分光光度计 激发单色器
样品池
发射 单色器 检测器
数据处理 仪器控制
紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池)
It
I0
荧光分光光度计 样品池
It IF,p
I0
第三节 定性和定量分析
一、定性分析
定性依据荧光光谱和激发光谱
二、定量分析
定量依据：F=Kc
1. 标准曲线法
直接荧光标准曲线法
F Fx
Cx
Cs
2.直接比较法 Fs F0 Cs Fx F0 Cx
荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、 羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分 子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。
(浓度限量1g~1mg/ml)
荧光熄灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄 灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激 发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与激发光波长关系曲 线(图中曲线II或III)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
2. 三维荧光光谱
I F ∝f (λex 、λem)
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光的产生与分子结构的关系
2. 荧光光谱的形状不仅与物质的性质有关，而且还与激发波长 有关。 （ ）
3. 一般而言，分子的共轭越多，刚性平面性越好，荧光效率越高。
() 4.在用荧光分光光度计测定时，仪器刻度一定要用对照品
溶液进行校正。
()
➢pH值 弱酸、弱碱
NH
+ 3
OH H+
OH -
NH 2
H+
NH -
pH<2
pH7~12 蓝色荧光
pH>13
4. 散射光： 一部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运
动方向发生改变而向不同方向散射。 瑞利散射光：选择适当的荧光测定波长或选用滤光片可消除
拉曼散射光：选择适当激发波长的方法消除
Cx
Fx Fs
F0 F0
Cs
第四节 荧光分析新技术
一、荧光新技术
➢激光荧光分析 ➢时间分辨荧光分析 ➢三维荧光分析 ➢核酸分子荧光探针 ➢薄层扫描法中的荧光扫描法
荧光分析的应用 1.有机化合物的荧光分析 研究对象：芳香族及具有芳香结构的化合物
▪有机化合物：多环胺类、萘酚类、具有芳环或芳杂环 结构的氨基酸类及蛋白质 ▪药物：生物碱类；甾体类；抗生素类(青霉素、四环； 维生素类(维生素A、B1、B2、B6、B12等) ▪中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻振动能级间的跃 迁。发生振动弛 豫的时间10 -12 s。
内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能 级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃 回第一激发单重态的最低振动能级。
荧光光谱
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
拉曼光谱
瑞利光320nm
瑞利光350nm
拉曼光360nm
拉曼光400nm
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
5. 荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分 子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强 度与浓度不呈线性关系的现象。
固定发射波长、扫描激发波长
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。
非辐射能量传递过程 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行
辐射能量传递过程
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大π键) （2）具有一定的荧光量子产率（）
发射的光量子数 吸收的光量子数
IF Ia
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常 数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生；
两种光源(紫外+可见)
空白溶液 (T=100%)
紫外无吸收 两面透光
荧光分光光度计
入射光与荧光垂 直方向
一种光源(紫外) 空白溶液(F=0) 荧光对照品溶液 (F=100%或50%)
低荧光材料 四面透光
紫外-可见分光光度计:
光源 单色器 样品池
2.无机化合物的荧光分析 测定方法：与具有π电子共轭结构的有机化合物形成 荧光配合物
研究对象 ▪阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、 Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、 Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr ▪阴离子：CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合→原有荧光 配合物的荧光减弱甚至熄灭
IF 2.3I0abc
IF Kc 稀溶液
五、影响荧光强度的因素
1. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去激活的
几率减少，增加荧光效率，从而增加荧光强度。
2. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成
都将使化合物的荧光发生变化。
3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
第二节 荧光分析仪器
激发滤光片
发射滤光片
930型荧光计光路示意图
一. 主要组成及部件的功能
荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图
光源
激发单色器
氙 灯
光电倍增管
样品池
问题：荧光分光光度 计与紫外-可见分光光 度计有何异同点？
数据处理 仪器控制
发射单色器
光源
激发 单色器
样品池
发射 单色器
检测器
数据处理 仪器控制
3．下列对荧光的叙述正确的是：（ C ）
A．从第一电子激发态的不同能级发出光量子回到基态 B．从激发三线态的不同能级发出光量子回到基态 C．从第一电子激发态的最低振动能级发出光量子回到基态 D．从激发三线态的最低振动能级发出光量子回到基态
判断题
1. 体系间跨跃是因为激发态分子和溶剂分子发生碰撞而交换能量 所致。( )
（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强 吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭
2.化合物的结构与荧光
（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系
磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
l
‘ 2
>
l
2
>
l
1
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光波长(选最大激发光波长),化合物发 射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图 中曲线I ） 。
选最强荧光强度的激发光波长λex为测定波长， 以提高灵敏度。
[课后练习]
▪名词解释：荧光与磷光、振动弛豫 ▪溶液荧光光谱有哪些特征？ ▪能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？ ▪为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？
填空题
1．荧光是 物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的 返回基态时发射出的光
2．荧光和磷光的区别在于荧光是从单线激发态开始的，磷
光是由
。
3．荧光发射光谱也称荧光光谱，其发射波长总是
激发波长。
4．能够发射荧光的物质应具备的条件是
、
。
5．影响荧光强度的外部因素有
。
选择题
1．荧光物质的激发光谱与紫外吸收光谱的形状：（ B ） A．完全一样 B．基本相似 C．肯定不一样 D．难以说清
2．对荧光测定最有干扰的是：（ B ） A．波长比入射光长的瑞利光 B．波长比入射光长的拉曼光 C．波长比入射光短的瑞利光 D．波长比入射光短的拉曼光
荧光分析仪器的主要部件
➢激发光源：汞灯、卤钨灯、氙灯、 ➢分光系统：滤光片（两个）、单色器（光栅） ➢样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光 ➢检测器：紫外-可见（光电倍增管） ➢显示系统：指针式、数字式及计算机显示
二、荧光分析仪器的类型 ➢1.荧光光度计 ➢2.荧光分光光度计
➢荧光分光光度计 激发单色器
样品池
发射 单色器 检测器
数据处理 仪器控制
紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池)
It
I0
荧光分光光度计 样品池
It IF,p
I0
第三节 定性和定量分析
一、定性分析
定性依据荧光光谱和激发光谱
二、定量分析
定量依据：F=Kc
1. 标准曲线法
直接荧光标准曲线法
F Fx
Cx
Cs
2.直接比较法 Fs F0 Cs Fx F0 Cx
荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、 羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分 子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。
(浓度限量1g~1mg/ml)
荧光熄灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄 灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激 发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与激发光波长关系曲 线(图中曲线II或III)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
2. 三维荧光光谱
I F ∝f (λex 、λem)
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光的产生与分子结构的关系
2. 荧光光谱的形状不仅与物质的性质有关，而且还与激发波长 有关。 （ ）
3. 一般而言，分子的共轭越多，刚性平面性越好，荧光效率越高。
() 4.在用荧光分光光度计测定时，仪器刻度一定要用对照品
溶液进行校正。
()
➢pH值 弱酸、弱碱
NH
+ 3
OH H+
OH -
NH 2
H+
NH -
pH<2
pH7~12 蓝色荧光
pH>13
4. 散射光： 一部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运
动方向发生改变而向不同方向散射。 瑞利散射光：选择适当的荧光测定波长或选用滤光片可消除
拉曼散射光：选择适当激发波长的方法消除
Cx
Fx Fs
F0 F0
Cs
第四节 荧光分析新技术
一、荧光新技术
➢激光荧光分析 ➢时间分辨荧光分析 ➢三维荧光分析 ➢核酸分子荧光探针 ➢薄层扫描法中的荧光扫描法
荧光分析的应用 1.有机化合物的荧光分析 研究对象：芳香族及具有芳香结构的化合物
▪有机化合物：多环胺类、萘酚类、具有芳环或芳杂环 结构的氨基酸类及蛋白质 ▪药物：生物碱类；甾体类；抗生素类(青霉素、四环； 维生素类(维生素A、B1、B2、B6、B12等) ▪中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻振动能级间的跃 迁。发生振动弛 豫的时间10 -12 s。
内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能 级交换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃 回第一激发单重态的最低振动能级。
荧光光谱
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
拉曼光谱
瑞利光320nm
瑞利光350nm
拉曼光360nm
拉曼光400nm
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
5. 荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分 子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强 度与浓度不呈线性关系的现象。
固定发射波长、扫描激发波长
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。
非辐射能量传递过程 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行
辐射能量传递过程
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大π键) （2）具有一定的荧光量子产率（）
发射的光量子数 吸收的光量子数
IF Ia
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常 数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生；
两种光源(紫外+可见)
空白溶液 (T=100%)
紫外无吸收 两面透光
荧光分光光度计
入射光与荧光垂 直方向
一种光源(紫外) 空白溶液(F=0) 荧光对照品溶液 (F=100%或50%)
低荧光材料 四面透光
紫外-可见分光光度计:
光源 单色器 样品池