【华南理工考研 有机化学】仪分实验-实验 10- -分子荧光光谱法
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法分子荧光光谱法是一种非常有用的分析技术，它可用于测定溶液中分子结构、组成、组分和吸收特性，以及提供关于反应机理的许多信息。
它被广泛应用于化学研究、生物研究、环境研究和制药技术等多个领域。
荧光光谱反应的本质是，一些物质能够从激发态吸收来自外部光源的一定能量，并从激发态到低能量的稳定态跃迁，从而释放出某种光，而这些释放出来的光就是荧光光谱。
基本原理在分子荧光光谱中，激发态是将能量投射到分子上，使其进入一种不稳定的、能量较高的激发态，然后分子会自动以一定的速率从这种高能态向低能态跃迁，跃迁过程中会释放出一定能量的荧光光谱。
具体而言，当激发态的分子能量超过一定的最低能量时，它将进入具有较低能量的稳定态，从而释放出光子。
通常说，这些释放出的光子的频率与激发态的能量有关。
应用分子荧光光谱法可以用于识别、测定和分离不同物质，它可以用于研究有机物、无机物、金属离子和药物，也可用于检测有毒物质。
分子荧光光谱法还可以用于研究分子间相互作用、分子构型变化和反应机理等问题，可以用来研究复杂有机化合物中的加合反应，也可以用来研究金属离子与有机物之间的相互作用。
优缺点分子荧光光谱法具有灵敏度高、分析结果准确、操作简单、检测范围广等优点，可用于大量的物质的有效分析。
此外，它还具有自动控制设备、能测出大量小浓度物质等优点。
然而，分子荧光光谱法也有一些缺点，比如它只能测量没有涂料、沉淀物和色素的物质，而且只有在激发态跃迁释放出荧光时，它才能完成光谱测量。
结论分子荧光光谱法是一种广泛应用的分析技术，它具有敏锐的测量特性，可以快速、准确地测量多种物质，因此被广泛应用于诸多研究领域。
不仅如此，它的测量过程还简单易行，使它可以成为一个非常有用的分析工具。
分子光谱分析实验报告
一、实验目的1. 理解分子荧光光谱分析的基本原理和操作方法；2. 掌握荧光光谱仪器的组成及各部分作用；3. 分析影响荧光强度的内部结构因素和外部环境因素；4. 了解光谱分析法的应用范围。
二、实验原理分子荧光光谱分析是利用某些物质分子受光照射时所发生的荧光的特性和强度，进行物质的定性分析或定量分析的方法。
当分子吸收紫外和可见光后，电子跃迁到激发态，随后以发射辐射的方式释放能量，再回到基态。
如果发射的波长与吸收的波长相同或不同，这种现象称为光致发光，其中最常见的光致发光现象是荧光和磷光。
荧光光谱分析主要包括激发光谱、发射光谱、同步光谱和三维荧光光谱。
激发光谱表示激发光波长与荧光强度之间的关系，发射光谱表示荧光光波长与荧光强度之间的关系。
同步光谱是指激发光波长和发射光波长同时改变时，荧光强度的变化情况。
三维荧光光谱是指在三维坐标系中，激发光波长、发射光波长和荧光强度之间的关系。
影响荧光强度的因素包括内部结构因素和外部环境因素。
内部结构因素主要包括分子的共轭程度、取代基、分子结构等。
外部环境因素主要包括溶剂、温度、pH值、浓度等。
三、实验内容与步骤1. 实验仪器与试剂：荧光光谱仪、激发光源、样品池、标准样品、溶剂等。
2. 实验步骤：（1）将荧光光谱仪开机预热，调整好仪器参数；（2）将标准样品放入样品池，调整样品池位置；（3）设置激发光波长，进行激发光谱扫描；（4）设置发射光波长，进行发射光谱扫描；（5）设置同步光谱参数，进行同步光谱扫描；（6）设置三维荧光光谱参数，进行三维荧光光谱扫描；（7）记录实验数据，分析数据，得出结论。
四、实验结果与分析1. 激发光谱扫描结果显示，标准样品在特定波长范围内有明显的荧光峰，说明该样品在该波长范围内具有荧光特性。
2. 发射光谱扫描结果显示，标准样品在激发光波长下具有明显的发射峰，说明该样品在该激发光波长下具有荧光发射特性。
3. 同步光谱扫描结果显示，激发光波长和发射光波长同时改变时，荧光强度也随之变化，说明激发光波长和发射光波长对荧光强度有显著影响。
分子发光光谱法
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
λex＝260nm
2. 荧光的激发光谱
让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光， 而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后 以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘 制的图，即为荧光激发光谱。 激发光谱曲线的最高 处，处于激发态的分子 最多，荧光强度最大.
λem＝370nm
3. 同步荧光光谱
分子发光光谱法
(Molecular Luminescence Spectroscopy)
分子发光光谱法包括：
光致发光 (Photoluminescence) 分子荧光（Molecular Fluorescence）
分子磷光（Molecular Phosphorescence） 化学发光（Chemiluminescence） 生物发光（Bioluminescence） 电致发光（Electroluminescence）
Electron donater Heavy atom effect
Electron accepter
2.影响荧光强度的因素—环境因素
(1)溶剂的影响
除一般溶剂效应外， 溶剂的极性、氢键、 配位键的形成都将使 化合物的荧光发生变 化；极性溶剂使 → * 跃迁能量减小 ，所以Em红移。
《仪器分析实验》分子荧光分析法
西北大学基础化学实验
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分子荧光光谱分析
分子荧光光谱分析分子荧光光谱分析的原理是基于分子的激发态能级和基态能级之间的电子跃迁。
当分子受到外界的激发能量（如光能）时，部分分子中的电子从基态跃迁到激发态。
当电子从激发态返回基态时，会释放出荧光光子，其能量与激发态的能级差相关。
这种发光现象被称为荧光。
荧光光谱是通过测量荧光发射的强度和波长来获得的。
通常情况下，荧光光谱的波长范围较宽，可以从紫外到可见光甚至红外。
荧光峰的位置和强度可以提供分子的结构信息，如它们的共振结构、官能团的位置和取代基的影响等。
因此，荧光光谱分析被广泛应用于有机分析化学、生物化学、医药化学等领域。
在分子荧光光谱分析中，常用的实验方法包括荧光激发光谱、荧光发射光谱和荧光寿命测量。
荧光激发光谱是测量分子在不同激发波长下产生的荧光发射强度的方法。
通过测量不同波长的激发光强度和相应的荧光发射强度，可以绘制激发光谱图。
从激发光谱图中，可以确定最佳的激发波长和激发强度，以获得最大的荧光发射信号。
荧光发射光谱是测量荧光信号的强度和波长的方法。
在荧光发射光谱实验中，分子在固定的激发波长下，通过改变检测器的波长来测量荧光光谱。
从荧光发射光谱图中，可以观察到不同波长下的荧光发射峰，并判断荧光光谱的特征。
荧光寿命测量是测量分子从激发态退激发到基态的时间的方法。
荧光寿命是荧光信号从达到最大强度到减少到原始强度的时间。
荧光寿命的测量可以提供有关分子动力学和化学反应速率的信息。
分子荧光光谱分析在许多领域有着广泛的应用。
例如，在环境监测中，可以通过测量水中有机物的荧光光谱来检测水中有机污染物的存在和浓度。
在生物药物研究中，荧光标记的分子可以用于检测和定量分析生物标志物的表达和鉴定。
此外，荧光光谱分析还可以用于材料科学、食品分析等许多其他领域。
总之，分子荧光光谱分析是一种重要且常用的分析方法，通过测量荧光发射的强度和波长可以获得分子的结构和性质信息。
不同的实验方法可以用于研究不同的分子特性和反应过程。
分子荧光光谱法剖析
达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的
最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出
的光线称为磷光。
由于激发三重态能量较激发单重态低，所以
磷光的波长比荧光的波长稍长。
磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测
到。因此磷光很少应用于分析。
内转换
振动弛豫 内转换 系间跨越
S2 T2
S1
能 量
T1
发
发
射
7
275~345
5
290~380
0
平面刚性构造效应
可降低分子振动，削减与溶剂的相互
作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相像
构造，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。
〔2〕 荧光量子产率Φ
物质分子放射荧光的力量用荧光量子产率〔Φ〕 表示：
发射荧光的分 发子 射数 的光子数 Φ= 激发态的分=吸 子收 数的光子数
单重态： 一个分子中全部电子自旋都配对的电 子状态。
三重态： 有两个电子的自旋不配对而平行的状 态。激发三重态能量较激发单重态低。
大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且 自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所 以大多数分子在基态时处于单重态。
当分子受光照射时，假设光子能量恰好等于分子的 某两个能级的能量之差，则分子吸取光子并从基态 跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能 级。但其自旋方向不会马上转变，分子仍处于单重 态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转， 生成三重态。
分子荧光光谱法
Molecular Fluorescence Spectroscopy
荧光是指一种光致发光 的冷发光现象。当某种 常温物质经某种波长的 入射光〔通常是紫外线〕 照射，吸取光能后进入 激发态，并且马上退激 发并发出比入射光的的 波长长的出射光〔通常
分子荧光光谱法
• 单重态： 一个分子中所有电子自 旋都配对的电子状态。
• 三重态：有两个电子的自旋不配 对而平行的状态。激发三重态能 量较激发单重态低。
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应用固体化学研究中心
分子的激发与失活
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应用固体化学研究中心
• 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级
回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。由于是相同 多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为 106~109s-1。
• 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发研究中心
1.概述
• 分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称为荧光光谱法或荧光分析法．是以
物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行 的定量分析，以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行 行的定性分析．
• 光致发光（Photoluminescence）:物体依赖外界 光源进行照射，从而获得能量，产生激发导至发 光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射 三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之 间的跃迁，都经过激发态。而能量传递则是由于 激发态的运动。紫外辐射、可见光及红外辐射均 可引起光致发光。如磷光与荧光。
光
S0
l1
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l 2 l 2
l3
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（2）激发态分子的失活
激发态分子不稳定，它要以辐射或无辐射跃迁的 方式回到基态。
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分子荧光光谱法
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 和发光分析；
分子荧光光谱法
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可 变波长三种；
同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率； 如图。
合适的可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相 似，发射光谱严重重叠，但 <15nm的同步光谱只显示酪氨酸 特征光谱； >60nm时，只显示色 氨酸的特征光谱，实现分别测定。
分子荧光光谱法
3.内滤光作用和自吸现象 内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收
光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
分子荧光光谱法
4、溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
分子荧光光谱法
四、仪器结构流程
（ 多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 ‘2的荧光； 10-
7～10 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波
长长； ‘2 > 2 > 1 ；
分子荧光光谱法
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
分子荧光光谱法
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
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★在碱性介质中不稳定
★易发生光降解
2.2 实验流程
１、试液配制 ２、VB6的荧光光谱的绘制 ３、标准工作曲线的制作 ４、未知液的配制
2.3 注意事项：
☆注射液的移取与稀释 ☆系列标液的测定顺序 ☆即放即测，防光降解 ☆荧光仪的开关机顺序
2.4 数据处理
1. 从荧光光谱图上读出最大激发（λex）和发射波长（ λem） 2. 用标准工作曲线法算出所配实测试液的浓度 3. 计算注射液中维生素B6的含量， 病计算测定量占
标示量 的百分数
本节内容结束
10-6 ~ 10-2 s F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
P 磷光： 10-6 ~ 100 s
1.2 荧光光谱
任何荧光化合物，都具有两种特征的光谱ve Fluorescence Intensity
激发光谱
800
Ex.
600
发射光谱
400
200
0
250 300 350 400 450 500 550 600
★ 高端生化研究：
☆ 分子相互作用研究； ☆代谢动力学跟踪； ☆ 显微成像（物理迁移与化学衍化的原位“显迹”）
二、维生素B6注射液中维生素B6含量的 荧光法测定
2.1 实验原理
R
HO
CH2OH
H3C
N
R = CH2NH2, CH2OH, CHO.
VB6 的化学结构
★ 在近中性的水溶液中
有较强的荧光发射:
I0：光源强度； φf：荧光量子产率； C：荧光体浓度）
Fluorescence Intensity
4800
4200
3600
3000
C
2400
1800
1200
600
0 550 560 570 580 590 600 610 620
Wavelength(nm)
（☆注意：在一定浓度范围内适用）
? 问题：
1.1 荧光的产生
S2
2 1
V=0
2
S1
1 V=0
VR
ic
VR
A1
A2
F
发生激发 态反应
isc
T1
2
1
V=0
P
3
S0
2 1
V=0
分子内的激发和衰变过程
激发态能量的跃迁与转 化的形式和速率：
A1,A2 吸收: 10-15 s VR 振动松弛： 10-12 s ic 内转化： 10-11 s isc 系间窜越：
厦门大学精品课程 仪器分析(含实验)
《仪器分析实验》
实验10 分子荧光分析法
Molecular Fluorimetry For short: M-F
一、分子荧光分析法简介
原子光谱（略）
光
谱
UV-Vis（紫外-可见）
分
分子吸收
析
(对光的吸收) IR（红外）
分子
光谱
光致发光
分子发光
荧光、磷光
其它发光形式 如：化学发光等
1）影响相对荧光强度的因素有哪些？
2）试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。
1.4 荧光仪的基本构造
？问题：荧光光度计与紫外-可见分光光度计在光路设置
上有什么不同？为什么？
1.5 分子荧光分析法的应用简介
★ 常规分析应用：
☆ 定性分析：φf；λex；λem；峰形等 ☆ 定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C ☆ 其它（略）
Wavelength (nm)
组成、结构与衍化信息
☆ 物质的化学结构 ☆ 环境与介质条件 ☆ 与其它溶质的相互作用 ☆ 反应动力学
1）共轭结构
萘 紫外区
2）刚性的平面结构 -O
蒽 蓝区
O
-O
3）取代基
COO荧光黄会发荧光
NH2
丁省 绿区 O
COO酚酞不发荧光
1.3 荧光定量
F = K﹒I0﹒φf﹒C