分子荧光分析法
合集下载
分子荧光光谱法
光致发光（Photoluminescence）: 荧光和
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
分子荧光法测定实验报告
一、实验目的1. 熟悉分子荧光法的基本原理和操作步骤。
2. 掌握荧光光谱仪的使用方法。
3. 通过实验，测定罗丹明B的荧光光谱，分析其激发光谱和发射光谱。
4. 掌握荧光定量分析的方法。
二、实验原理分子荧光法是一种灵敏的定量分析方法，基于物质在特定波长范围内吸收光能后，电子从基态跃迁到激发态，再回到基态时释放出一定波长的荧光。
罗丹明B作为一种荧光物质，在特定波长范围内具有明显的荧光特性。
通过测定罗丹明B的激发光谱和发射光谱，可以确定其最佳激发波长和发射波长，从而进行定量分析。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：荧光光谱仪、紫外-可见分光光度计、移液器、容量瓶、试管等。
2. 试剂：罗丹明B标准溶液、无水乙醇、蒸馏水等。
四、实验步骤1. 准备罗丹明B标准溶液：准确移取一定量的罗丹明B标准溶液，用无水乙醇稀释至100mL，配制成一定浓度的罗丹明B标准溶液。
2. 测定激发光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，扫描激发光谱，记录激发波长范围内荧光强度的变化。
3. 测定发射光谱：在荧光光谱仪上，设定罗丹明B标准溶液的浓度为1.0×10^-5 mol/L，以无水乙醇为参比溶液，以激发光谱中最大激发波长为激发波长，扫描发射光谱，记录发射波长范围内荧光强度的变化。
4. 荧光定量分析：取一定量的罗丹明B样品溶液，按照上述步骤测定其激发光谱和发射光谱，计算样品溶液中罗丹明B的浓度。
五、实验结果与讨论1. 激发光谱：罗丹明B的激发光谱显示，在激发波长为540nm附近，荧光强度达到最大值。
因此，选择540nm作为激发波长。
2. 发射光谱：罗丹明B的发射光谱显示，在发射波长为590nm附近，荧光强度达到最大值。
因此，选择590nm作为发射波长。
3. 荧光定量分析：根据罗丹明B的激发光谱和发射光谱，以及标准曲线，计算样品溶液中罗丹明B的浓度为1.2×10^-5 mol/L。
分子荧光分析法
1.荧光效率
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
分子荧光分析法
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1.分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
1.激发光源：能发出强度较大，连续稳定的光 源。
主要有：溴钨灯、氢灯、高压汞灯、氙弧灯 2.分光系统： 第一单色器（激发单色器）：位于光源与液槽
间，滤去非选择波长的激发光。 第二单色器（发射单色器）：位于液槽与检测器
之间，滤去反色光，散色光和杂质产生的荧 光。
第五章 分子荧光分析法
3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。
4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。 光二极管阵列检测器。
二、仪器的类型 1.光电荧光计：滤光片荧光计。
溴钨灯，滤光片，光电管。 2.荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，
光电倍增管。
第五章 分子荧光分析法
第三节 定性定量分析
第五章 分子荧光分析法
第一节 第二节 第三节 第四节
基本原理 仪器 定性定量分析 荧光新技术和应用实例
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程 分子的激发态 荧光的产生 激发光谱和荧光光谱 激发光谱和荧光光谱的关系 二、分子结构与荧光关系 荧光效率 分子结构与荧光的关系 影响荧光强度的外界因素 荧光强度与荧光物质浓度的关系
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
分析化学第11章--荧光分析法
第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
15 世纪被发现（重晶石在强烈阳光下的发光）
1944 年： Lewis 提出磷光用于分析的可能性；
1957 年： Keirs 将磷光分析用于定量分析及多组
份混合物分析；
1963 年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药 残留量分析。
67
internal conversion
S2
vibrational internal conversion relaxation intersystem crossing
瑞利峰 拉曼峰
31
第三节荧光分析仪器
instrument of fluorescence analysis 一、仪器的主要部件 二、仪器类型
32
I0
It
F
33
一、仪器的主要部件 激发光源(light source)
样品池(吸收池)(absorption cell) 单色器(monochromator ) 检测器(detecor) 记录及数据处理器(display)
发射 单色器
检测器 数据处理 仪器控制
45
二、仪器类型
1. 荧光光度计(fluorometer)
2. 荧光分光光度计(spectrofluorometer)
46
荧光光度计 光源 溴钨灯、汞灯
荧光分光光度计 氙灯
单色器
光谱 应用
滤光片、棱镜
荧光光谱 定量分析
光栅
激发光谱、荧光光谱 定量、定性分析
47
58
（五）生命科学中
59
1. 探测和分析蛋白质的分子结构
60
2. 基因检测-分子信标
61
3. 细胞生物学中的应用
62
4.膜融合机理的研究
63
三、荧光光度计的发展
1928年第一台光电荧光计问世以来.经过三 阶段: 1.手动式. 2.自动扫描 3.微机化
64
1. 分辨率提高：5.2μs～1ps,分辨率达±0.5ps. 2.扫描速度加快： 30000nm/min 3.多功能：可同机进行荧光、磷光和化学发光测
对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，
F k' c
28
五、影响荧光强度的外部因素 relation between fluorescence and molecular structure
1.溶剂的影响
2.温度的影响 3. 溶液pH的影响 4.溶液荧光的猝灭
NH3 NH2 NH
OH H
OH H
27
由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程 度及荧光效率成正比，即：
F kΦ I 0 (1 10
kΦ I 0 (1 e
F ΦI a I a I 0 I I 0 (1 10
abc
abc
)
)
)
2.3 abc
当abc≤0.05（即溶液很稀）时，
F 2.3kΦ I 0 abc
发光的波长不同) (2)分子荧光和原子荧光(发射荧光的粒子不同)
7
特点 (1)灵敏度高, 通常比分光光度法高 2～4个 数量级 (2)选择性好 (3)样品用量少和操作简便
8
第二节基本原理
一、分子荧光产生过程
二、激发光谱与荧光光谱
三、荧光物质的分子结构
四、荧光强度与溶液浓度的关系
五、影响荧光强度的外部因素
蒽
0.46
400
一般而言，π电子共轭体系越大，荧光效率越高，且 荧光光谱红移。
H
H C C H
C
C
H
强荧光
无荧光
23
（3）刚性平面结构
刚性平面结构可减少分子的振动，使分子与溶剂和其它 溶质分子的相互作用减小，因而有利于提高荧光效率。
24
25
(4) 取代基效应 化合物 荧光相对强度
苯
苯酚
OH
10
12
internal conversion
S2
vibrational internal conversion relaxation intersystem crossing
S1
energy fluorescence absorption external conversion
T2 T1
phsophorescence
54
（二）药物（中药）
1. 测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚
2. 香内酯荧光分光法定量分析，其发射光谱
λem=(385±1)nm，λex=301nm或激发光谱
λex：(328±1)nm，λem：425nm
55
（三）无机元素
1. 测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨梅黄素
在磷酸介质中形成配合物，此配合物在乙醇溶液
缺点：应用范围小。
50
一、定性分析
荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，
因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。
定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标
准品对照，看是否一致。
51
二、定量分析 F－F0
1.标准曲线法：
Fx －F0
cx
c
52
2. 直接比较法
如果荧光物质的标准曲线过零点，且线性良好， 可用直接比较法测定。在线性范围内，测定标样和
18
NH2
苯胺
苯甲酸 硝基苯
20
3 0
COOH
NO2Leabharlann 给电子基团：如–OH, –OR, –NH2, –CN， –NR2等， 增强荧光。 吸电子基团：如–COOH, 减弱甚至熄灭荧光。
C O , –NO2, –NO等，
26
四、 荧光强度与溶液浓度的关系 根据Lambert-Beer定律：
所以，
pH<2 无荧光
7~12 蓝色荧光
>13 无荧光
29
造成荧光熄灭的原因： （1）碰撞熄灭 （2）静态熄灭 （3）转入三重态的熄灭：
（4）荧光物质的自熄灭：
（5）内滤光作用和自吸现象
30
5.散射光（scattering light）
（1）瑞利（Reyleigh）散射光
（2）拉曼（Raman）散射光
怎样检测样品中的核黄 素（维生素B2） ？
核黄素（维生素B2） 黄色至橙黄色结晶性粉末
饱和水溶液呈中性， 呈淡黄绿色，有荧光。
1
molecular fluorescence analysis
郭建丽
卫生化学教研室
2
第一节概述
荧光的发现
植物愈创木切片黄色 水溶液 ——天兰色荧光；
3
荧光的发现
4
5
49
第三节荧光分析方法与应用 fluorescence analysis and application
特点：
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；
检测下限：0.1～0.1g/cm-3
相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少
第一滤光片 光源 狭缝 样品池 第 二 滤 光 片
样品
光源 程序
狭 缝
激发 单色器
表面 吸收 物质
发射 单色器
指示器
信号输出
检测器
荧光计示意图 记录器 荧光分光光度计示意图 放大器
检测器
48
可获得三维光谱图的仪器
如：日立4500型荧光分光光度计。
可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
量
4.促使应用技术的发展
例如：时间分辨(相分辨)；同步荧光；三维荧光；荧 光光纤化学传感器
65
MFS与UV/Vis 法比较：
原理
灵敏度, 选择性
测定方法
I0 F It
UV/Vis 吸收
MFS 发射
10-5～10-6mol· -1 L
10-7～10-9 mol· -1 L
I0 F
66
第五节 磷光分析法简介 molecular phosphorescence analysis 磷光的发现
9
一、荧光的产生过程 1. 分子能级与跃迁
S1
S0
10
2. 单重态与三重态
处于分立的电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳 定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级低。 11
3.激发态→基态的能量传递途径
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
vibrational relaxation
S0
l1
l2
l 2
l3
13
二、激发光谱和荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
S1
energy
T2 T1
phsophorescence
absorption
试样的荧光强度，进行比较：
Fs F0 Kc s Fx F0 Kc x Fs F0 Fs F0 cs cx cs Fx F0 Fx F0 c x
53
三、荧光分析法的应用
（一）药物（西药类）
1. 采用荧光分光光度法测定奥沙普嗪肠溶胶 囊的含量，测定波长为λex=287.0nm， λem=368.0nm。 2. 替硝唑 λex=360nm ,λem=420nm 3. 氟康矬 λex=261nm , λem=284nm
1944 年： Lewis 提出磷光用于分析的可能性；
1957 年： Keirs 将磷光分析用于定量分析及多组
份混合物分析；
1963 年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药 残留量分析。
67
internal conversion
S2
vibrational internal conversion relaxation intersystem crossing
瑞利峰 拉曼峰
31
第三节荧光分析仪器
instrument of fluorescence analysis 一、仪器的主要部件 二、仪器类型
32
I0
It
F
33
一、仪器的主要部件 激发光源(light source)
样品池(吸收池)(absorption cell) 单色器(monochromator ) 检测器(detecor) 记录及数据处理器(display)
发射 单色器
检测器 数据处理 仪器控制
45
二、仪器类型
1. 荧光光度计(fluorometer)
2. 荧光分光光度计(spectrofluorometer)
46
荧光光度计 光源 溴钨灯、汞灯
荧光分光光度计 氙灯
单色器
光谱 应用
滤光片、棱镜
荧光光谱 定量分析
光栅
激发光谱、荧光光谱 定量、定性分析
47
58
（五）生命科学中
59
1. 探测和分析蛋白质的分子结构
60
2. 基因检测-分子信标
61
3. 细胞生物学中的应用
62
4.膜融合机理的研究
63
三、荧光光度计的发展
1928年第一台光电荧光计问世以来.经过三 阶段: 1.手动式. 2.自动扫描 3.微机化
64
1. 分辨率提高：5.2μs～1ps,分辨率达±0.5ps. 2.扫描速度加快： 30000nm/min 3.多功能：可同机进行荧光、磷光和化学发光测
对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，
F k' c
28
五、影响荧光强度的外部因素 relation between fluorescence and molecular structure
1.溶剂的影响
2.温度的影响 3. 溶液pH的影响 4.溶液荧光的猝灭
NH3 NH2 NH
OH H
OH H
27
由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程 度及荧光效率成正比，即：
F kΦ I 0 (1 10
kΦ I 0 (1 e
F ΦI a I a I 0 I I 0 (1 10
abc
abc
)
)
)
2.3 abc
当abc≤0.05（即溶液很稀）时，
F 2.3kΦ I 0 abc
发光的波长不同) (2)分子荧光和原子荧光(发射荧光的粒子不同)
7
特点 (1)灵敏度高, 通常比分光光度法高 2～4个 数量级 (2)选择性好 (3)样品用量少和操作简便
8
第二节基本原理
一、分子荧光产生过程
二、激发光谱与荧光光谱
三、荧光物质的分子结构
四、荧光强度与溶液浓度的关系
五、影响荧光强度的外部因素
蒽
0.46
400
一般而言，π电子共轭体系越大，荧光效率越高，且 荧光光谱红移。
H
H C C H
C
C
H
强荧光
无荧光
23
（3）刚性平面结构
刚性平面结构可减少分子的振动，使分子与溶剂和其它 溶质分子的相互作用减小，因而有利于提高荧光效率。
24
25
(4) 取代基效应 化合物 荧光相对强度
苯
苯酚
OH
10
12
internal conversion
S2
vibrational internal conversion relaxation intersystem crossing
S1
energy fluorescence absorption external conversion
T2 T1
phsophorescence
54
（二）药物（中药）
1. 测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚
2. 香内酯荧光分光法定量分析，其发射光谱
λem=(385±1)nm，λex=301nm或激发光谱
λex：(328±1)nm，λem：425nm
55
（三）无机元素
1. 测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨梅黄素
在磷酸介质中形成配合物，此配合物在乙醇溶液
缺点：应用范围小。
50
一、定性分析
荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，
因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。
定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标
准品对照，看是否一致。
51
二、定量分析 F－F0
1.标准曲线法：
Fx －F0
cx
c
52
2. 直接比较法
如果荧光物质的标准曲线过零点，且线性良好， 可用直接比较法测定。在线性范围内，测定标样和
18
NH2
苯胺
苯甲酸 硝基苯
20
3 0
COOH
NO2Leabharlann 给电子基团：如–OH, –OR, –NH2, –CN， –NR2等， 增强荧光。 吸电子基团：如–COOH, 减弱甚至熄灭荧光。
C O , –NO2, –NO等，
26
四、 荧光强度与溶液浓度的关系 根据Lambert-Beer定律：
所以，
pH<2 无荧光
7~12 蓝色荧光
>13 无荧光
29
造成荧光熄灭的原因： （1）碰撞熄灭 （2）静态熄灭 （3）转入三重态的熄灭：
（4）荧光物质的自熄灭：
（5）内滤光作用和自吸现象
30
5.散射光（scattering light）
（1）瑞利（Reyleigh）散射光
（2）拉曼（Raman）散射光
怎样检测样品中的核黄 素（维生素B2） ？
核黄素（维生素B2） 黄色至橙黄色结晶性粉末
饱和水溶液呈中性， 呈淡黄绿色，有荧光。
1
molecular fluorescence analysis
郭建丽
卫生化学教研室
2
第一节概述
荧光的发现
植物愈创木切片黄色 水溶液 ——天兰色荧光；
3
荧光的发现
4
5
49
第三节荧光分析方法与应用 fluorescence analysis and application
特点：
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；
检测下限：0.1～0.1g/cm-3
相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少
第一滤光片 光源 狭缝 样品池 第 二 滤 光 片
样品
光源 程序
狭 缝
激发 单色器
表面 吸收 物质
发射 单色器
指示器
信号输出
检测器
荧光计示意图 记录器 荧光分光光度计示意图 放大器
检测器
48
可获得三维光谱图的仪器
如：日立4500型荧光分光光度计。
可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
量
4.促使应用技术的发展
例如：时间分辨(相分辨)；同步荧光；三维荧光；荧 光光纤化学传感器
65
MFS与UV/Vis 法比较：
原理
灵敏度, 选择性
测定方法
I0 F It
UV/Vis 吸收
MFS 发射
10-5～10-6mol· -1 L
10-7～10-9 mol· -1 L
I0 F
66
第五节 磷光分析法简介 molecular phosphorescence analysis 磷光的发现
9
一、荧光的产生过程 1. 分子能级与跃迁
S1
S0
10
2. 单重态与三重态
处于分立的电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳 定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级低。 11
3.激发态→基态的能量传递途径
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
vibrational relaxation
S0
l1
l2
l 2
l3
13
二、激发光谱和荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
S1
energy
T2 T1
phsophorescence
absorption
试样的荧光强度，进行比较：
Fs F0 Kc s Fx F0 Kc x Fs F0 Fs F0 cs cx cs Fx F0 Fx F0 c x
53
三、荧光分析法的应用
（一）药物（西药类）
1. 采用荧光分光光度法测定奥沙普嗪肠溶胶 囊的含量，测定波长为λex=287.0nm， λem=368.0nm。 2. 替硝唑 λex=360nm ,λem=420nm 3. 氟康矬 λex=261nm , λem=284nm