野桑蚕丝胶1基因Ser1A_及其上游调控序列的克隆和序列分析
蚕丝蛋白基因的克隆与表达
蚕丝蛋白基因的克隆与表达蚕丝蛋白是一种高度优质的天然纤维素材料，其独特的物理化学性质和生物学活性，让它成为纺织、食品、医疗等领域不可替代的重要资源。
而蚕丝蛋白的生产则来自于蚕，而基因工程技术则为蚕丝蛋白的生产提供了更好的途径和方法。
蚕丝蛋白基因的克隆是一项关键的研究工作。
在此之前，已经有一些研究者尝试克隆蚕丝蛋白基因，但由于生物材料难以获取，技术也不够成熟，一直未能得到成功。
直到20世纪80年代，随着分子生物学和基因工程技术的不断发展，科学家们开始在蚕的基因中寻找与蚕丝蛋白相关的基因序列。
他们采用cDNA文库筛选和克隆技术，最终获得了蚕丝蛋白基因的全序列信息。
这一成果无疑是基因工程领域的重大突破，也为人类利用蚕丝蛋白提供了新的思路和方法。
蚕丝蛋白基因的克隆是基因工程的重要环节，但更为重要的是基因的表达和生产。
在基因克隆成功后，科学家们需要将其引入到其他生物系统中，让其在目标生物中表达出蚕丝蛋白。
而当时，最为流行的方法就是利用大肠杆菌等原核细胞来表达蚕丝蛋白基因。
然而，这种方法面临的问题很明显：由于转录后的蚕丝蛋白基因会产生大量的表达产物，而该产物在大肠杆菌中无法形成一个纤维结构，因此无法形成实际应用的纤维素材料。
为此，研究人员开始尝试利用真核细胞来表达蚕丝蛋白基因，他们试图将蚕丝蛋白基因引入哺乳动物细胞中，这样就可以利用蛋白质后修饰等生物学过程，让蚕丝蛋白在真核细胞中形成一个稳定的纤维结构。
这一方法的优势在于可以形成具有生物学功能的蚕丝蛋白，同时也可以进行大规模生产。
在顺利的情况下，可以通过细胞培养技术，实现数千升的底物生产。
而且，利用真核细胞表达的蚕丝蛋白本身具有更好的稳定性和结构性能，可用于医疗等领域，从而为蚕丝蛋白的多元化应用提供更加广阔的空间和可能性。
在基因工程技术不断发展的今天，蚕丝蛋白基因的克隆和表达已经成为研究的前沿话题。
众多研究者将继续探索和发展蚕丝蛋白基因的多元化应用，以期更好地满足不同领域的需求。
家蚕丝胶蛋白基因1(ser-1)启动子的克隆及其活性分析
Ｖｏ ． ３ Ｎｏ ６ １２ ．
ＮＯ Ｖ． ２ ００７
科 技 通 报
Ｂ ＴＩ ＯＦ Ｓ ＥＮＣＥ ＵＩＬＥ Ｎ ＣＩ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮ０Ｉ０ＧＹ
第２ ３卷 第 ６期
２０ ０ ７年 ｉ ｉ月
家 蚕 丝胶 蛋 白基 因 １ ＳＴ１ 启 动 子 的克 隆 （ｅ一 ）
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蚕丝基因研究进展
蚕丝基因研究进展
黄君霆
【期刊名称】《蚕学通讯》
【年(卷),期】1995(000)001
【摘要】1.丝胶基因群组成家蚕丝胶的一群结构蛋白质,是在中部丝腺不同区域依
幼虫发育时期分别被合成和分泌的.已经分离、克隆了Ser—1、Ser—2、S3、S4、S5等5个丝胶蛋白质基因.Ser—1基因全长约23600 bp(碱基对),在家蚕基因组中是单拷贝的.Ser-1基因被7个内含子序列分隔成8个外显子.外显子el为90bp、
e2为31bp、e3为1300bp、e4为78
【总页数】6页(P36-40,27)
【作者】黄君霆
【作者单位】中国农业科学院蚕业研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S881.2
【相关文献】
1.家蚕蚕丝蛋白基因表达调控研究进展 [J], 汪生鹏;孙霞
2.piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展 [J], 钟伯雄;危浩;
庄兰芳
3.家蚕丝素基因的研究进展 [J], 翁宏飚;牛宝龙;孟智启;徐孟奎
4.YAG介导的天蚕丝素基因向家蚕的转移——天蚕丝素基因—YAC克隆在家蚕的
表达 [J], 李振刚;范久戈
5.家蚕丝素基因研究进展 [J], 陈华;朱良均;闵思佳
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野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆分析与原核表达
野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆分析与原核表达丛海峰;徐世清;司马杨虎;张升祥;王更先;董航;刘莹;柳学广【期刊名称】《蚕业科学》【年(卷),期】2007(33)2【摘要】超氧化物歧化酶是野桑蚕保护酶体系的重要酶类。
利用RT-PCR方法克隆出野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)cDNA(EMB I登陆号:AM410997),其开放阅读框ORF长465 bp,编码154个氨基酸。
同源性及系统进化分析表明,推导出的氨基酸序列与3种果蝇的同源性平均为69.3%,与线虫为57%,各物种中与Cu/Zn结合的残基高度保守。
利用ExPASy的ScanProsite以及PSort和TMpred对此编码的蛋白质结构和功能域分析,预测出其具有2段Cu/Zn-SOD特异序列,且该蛋白不存在信号肽以及跨膜区。
将Cu/Zn-SOD cDNA克隆到pET-28 a(+)表达载体,测序鉴定后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定其表达的融合蛋白质分子量为19.4 kD。
【总页数】7页(P234-240)【关键词】野桑蚕;铜锌超氧化物歧化酶;序列分析;原核表达【作者】丛海峰;徐世清;司马杨虎;张升祥;王更先;董航;刘莹;柳学广【作者单位】苏州大学生命科学学院;山东农业大学林学院;溧阳市蚕桑技术指导站【正文语种】中文【中图分类】S885.9;Q78【相关文献】1.翘嘴鳜铜锌超氧化物歧化酶基因的分子克隆与原核表达 [J], 程周玉;许亮清;胡向萍;胡宝庆;简少卿;阳刚;张明;文春根;宁瑞红2.蜡样芽胞杆菌905铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达 [J], 莫小丹;王勇军;王琦;梅汝鸿3.野桑蚕Bmand-Sxl基因的克隆及原核表达 [J], 宋艳;柳学广;司马杨虎;朱晓苏;徐丽;徐世清4.小胸鳖甲胞外铜锌超氧化物歧化酶重组蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 [J], 孜拉吉古丽·西克然木;马纪;库尔班·吐松;刘小宁5.野桑蚕泛素基因的克隆及原核表达 [J], 陈正凯;周君;包立军;徐剑;沈卫德;陆小平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
蚕丝合成相关基因的克隆与表达分析
蚕丝合成相关基因的克隆与表达分析近年来，世界各地都有着蚕丝生产和相关技术的研究。
随着人们对突破蚕丝生产领域的渴望的增加，基因克隆和表达分析的研究也越来越成为关注焦点。
蚕丝的产生与合成蚕丝纤维是一种天然的纤维，通常来自于家蚕的茧。
蚕丝是由蛋白质组成的，含有大量的谷氨酸和丝氨酸。
产生蚕丝的主要器官是蚕茧腺，该器官位于家蚕的头部发育器官附近。
当家蚕开始缠绕茧时，茧腺开始分泌蚕丝蛋白并卷曲成茧。
由于家蚕缺乏活性异肽酶，因此茧腺分泌的蛋白质以单一的方式排列，形成均一的纤维。
蚕丝合成相关基因的克隆蚕丝蛋白是构成蚕丝的主要成分，因此研究蚕丝合成相关的基因对于理解蚕丝形成机制具有重要意义。
目前已经通过测序技术鉴定出了许多家蚕蚕丝蛋白基因，这些基因编码的蛋白质具有多样性和复杂性。
其中，家蚕的蚕丝蛋白家族分为A、B、C三个亚家族。
每个亚家族都有多个基因，不同基因之间在基因结构以及编码的蛋白质序列上都有差异。
在克隆家蚕蚕丝蛋白基因的过程中，常常采用RT-PCR和RACE等技术。
基于已有的基因序列，可以通过NCBI数据库等资源获取基因的信息，从而为克隆工作提供有用的参考。
在克隆过程中，需要特别注意不同基因之间的共同点和差异点，避免误操作和病毒污染等问题。
此外，还需要保证所得到的基因与自然界中的蚕种具有同源性，以确保实验结果的可重复性和可靠性。
蚕丝合成相关基因的表达分析蚕丝蛋白基因的表达与调控是蚕丝合成过程的关键。
表达分析研究可以揭示不同组织器官和生长阶段蚕丝蛋白基因的表达模式，为优化蚕丝生产流程提供科学依据。
目前，常用的基因表达分析技术有Northern blot、RT-PCR、实时荧光定量PCR等。
基于实时荧光定量PCR的表达分析技术具有灵敏度高、特异性强、数据准确、通量大的优点。
在使用该技术时，需要先设计合适的引物和探针，遵循实验操作规范，并对实验结果进行质量控制和统计分析。
根据表达分析结果，可以通过基因转表达等手段调控蚕丝膜生产的重要基因，从而提高蚕丝的产量和质量。
柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因部分序列的克隆与分析
结果与分析
1.柞蚕Serpin基因的cDNA克隆
柞蚕蛹脂肪体 RNA抽提结果
cDNA克隆后PCR产物
2.柞蚕Serpin基因部分序列的cDNA序列分析
柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制，扰乱昆虫的正常代谢，最终导致昆虫发育异常
甚至死亡的特点，把它广泛应用在了害虫的防治上；
• 另外，丝氨酸蛋白酶抑制剂作为新型药物在疾病诊断、
治疗和预防等方面也发挥了重大作用。
研究背景
• 昆虫在长期的进化过程中形成了独特的防御体系，如黑 化反应、分泌抗菌肽杀死微生物等； • 这两个免疫反应过程都需要多种丝氨酸蛋白酶参与的级 联反应系统来保证信号的传递及放大； • Serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂在此过程中发挥抑制调节 作用，使得免疫反应迅速并且把它限定到一定程度与范 围内以避免对宿主造成伤害。
研究背景
•柞蚕是鳞翅目吐丝昆虫，在我国是一种重要的经济昆虫。 •克隆并分析柞蚕Serpin基因，可以为进一步从分子水平 上研究柞蚕先天性免疫机理提供参考。
材料与方法
•1.材料：市场上购买的柞蚕蚕蛹；
•2.提取柞蚕蛹脂肪体总RNA；
•3.合成第一链cDNA；
•4.设计引物,RT-PCR法克隆Serpin基因；
致谢
•本毕业设计的实验和论文是在导师刘朝良教授的悉心指导下完
成的，并受到了朱保建老师以及师兄刘秋宁和戴立上的热心帮
助，同时还要感谢蚕学教研室主任魏老师和实验室老师林老师 的大力支持。 •通过此次毕业设计，在锻炼了自己动手和独立操作能力的同时 进一步增强了自己对专业知识的理解和应用能力以及对实验结
果的分析处理能力。
家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式研究
; glutathione Stransferases; sequence analysis; expression pattern
谷胱甘肽 S 转移酶(GSTs, EC 2.5.1.18)是一类 重要的同工酶超家族，广泛分布在动物、植物、酵母、 细菌等生物体中，具有消除内源和外源性有毒物质 的功能(Hemingway, 2000；Sheehan , 2001)。依 据细胞定位，GSTs 主要存在于微粒体和细胞质中， 哺乳动物的线粒体中也有发现。胞质和线粒体 GSTs 是由同源或异源的单体组成的一系列二聚体蛋白，
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15 (4): 595~601
研究论文·
家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式 *
左伟东, 余泉友, 李 斌, 刘 志, 代方银, 鲁 成 **
(西南大学农业部蚕桑学重点实验室，重庆 400715)
分别取脂肪体，并立即置于液氮中保存备用。
1.3 总 RNA 的提取与 cDNA 第 1 链的合成
用 RNA 试剂盒 TRIzo（l Invitrogen）试剂提取各
组织的总 RNA。cDNA 第 1 链采用 Oligo (dT)18 和
AMV 反转录酶（Promega）按操作说明合成。1.4 家蚕 GST 基因克 Nhomakorabea及序列测定
摘要: 谷胱甘肽 S 转移酶(GSTs)是昆虫体内重要的解毒酶系，在对外源和内源化合物解毒代谢中起着重要的作用。以
GenBank 中已知的昆虫 GST 的氨基酸序列在家蚕（
)基因组序列中作 TBLASTN 检索，获得了多个可能的家蚕
GST 同源基因。对其中的一个 GST 新基因进行了 EST 分析和克隆，结果表明,该基因编码区全长 663 bp。以该基因推导的氨基
野桑蚕丝胶1基因Ser1A’及其上游调控序列的克隆和序列分析
调控 序列 的 一１１ ～ ＋４ 置存 在 多态 性 ， Ｃ ０５ ８位 Ｐ Ｒ扩 增结 果 有 １６ ｂ 、３ｂ ０ ３ｐ ６６ ｐ及 同时 出现这 两 种 条带 的情况 ［］ ｇ。家蚕 （ ｏ ｙ ｒ） 由野桑 蚕 （ ｏ ｙ ｎ ａｉａ 驯化 而来 ， 者的亲 Ｂ ｍｂ ｘｍｏｉ是 Ｂ ｍｂ ｘｍａ ｄ ｒｎ ） 二 缘关 系很 近 。家蚕 经历 了强烈 的人 工选 择 ， 成为 了完全 驯 养 的 昆虫 ， 依 赖 人 类 而 生存 ， 野 并 而
（ ＨＱ７ ２ ７ ） １ ６ ｂ （ ０ ３ ８ 及 ０ １ ｐ ＨＱ７ ２ ７ ） ０ ３ ９ 。对 野桑 蚕 丝胶 １ 因（ 基 ＨＱ７ ２ ８ ） ０ ３ ０ 编码 序 列 进 行 克隆 ， 通过 序列 比对 ， 分析 家 蚕 与野 桑蚕 丝胶 １ 因 同源序 列之 间 的差 异 ， 基 旨在 为进 一 步 了解 丝胶 １ 基 因的表 达调 控有 所 帮助 。
子［ 。丝 胶 ２基 因也 通过 不 同 的剪 切 方式 形成 两条 ｍＲ ４ ］ ＮＡ 编码 丝 胶 ２蛋 白［ 引。丝 胶 ｌ蛋 白
和丝胶 ２蛋 白的表达 受 到组 织 的严格 调控 ， 也受 到幼 虫发 育 时期 的调控 ［ 。基 因转 录调控 中 ， ５ ］ 启 动子是 关键 ， 动 子序 列所 含 的顺式 作 用元 件 与转 录 调控 因子 的 结合 决 定 基 因的 转 录 。家 启 蚕丝胶 １基 因启动 子 中存 在 三个顺 式 作用 元件 Ｓ （ １ ３ Ａ … ０ ８ ） Ｓ 一１ ９ 一１ ５ 和 Ｓ ５ 、 Ｂ（ ４ ～ ３） Ｃ （ ０ ～ 一１ ３ ， 能特 异 的与 转 录因子 （ ＧＦ １ Ｓ Ｆ ３ 结合 ［ 。丝腺 转 录 因子 １ Ｓ １ 属 一２ ４ ８ ）都 Ｓ － ， Ｇ 一） ６ ］ （Ｇ ） 于 ｈ ａ／ ｅｄ ＨＮＦ ３家 族 ， 一 能特 异结 合 Ｓ 位点 ， 为决定 了丝胶 １基 因 的组织 特异 性表 达［ Ａ 认 ”。体 外 转录 实验 表 明去 除 Ｓ 元 件 能 下调 丝 胶 １ 因启 动 子 的活 性 ［ 。丝 腺转 录 因子 ３ Ｓ 一 ） Ａ 基 ６ ］ （ ＧＦ ３
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野桑蚕丝胶1基因Ser1A c 及其上游调控序列的克隆和序列分析*黄 科1,2 伍杰1 陈典刚1 张永红1 李春峰1 周泽扬1,3(1.西南大学蚕学与系统生物学研究所,生物技术学院,重庆 400716;2.重庆文理学院花卉研究所,重庆 402160;3.重庆师范大学生命科学学院,重庆 401331)摘 要 家蚕由野桑蚕驯化而来,而野桑蚕sericin1及其上游调控序列的相关研究较少。
本研究以家蚕sericin1及其上游调控序列设计引物克隆野桑蚕ser icin1及其上游调控序列,将克隆得到的野桑蚕Ser icin 1序列翻译后用muscle 软件与家蚕Sericin 1蛋白序列比对,结果表明预测的野桑蚕Ser icin 1氨基酸序列与家蚕Sericin 1A c (Ser1A c )氨基酸序列相似性很高,达98%。
野桑蚕丝胶1基因上游调控序列与家蚕一样也存在多态性,克隆得到了1061bp 和636bp 的两条序列,中间存在425bp 的插入序列,与家蚕丝胶1基因上游调控序列相似性分别为98%和97%。
关键词 野桑蚕 家蚕 丝胶1基因蚕丝蛋白主要由丝素和丝胶组成。
丝胶蛋白在中部丝腺特异表达,主要由丝胶1蛋白和丝胶2蛋白组成[1-2]。
家蚕丝胶1蛋白由4条不同的mRNA 编码,由同一条mRNA 经不同的剪切方式形成,其长度分别为10.5kb 、9.0kb 、4.0kb 和2.8kb [3]。
1997年Garel A 等比较系统地阐明了家蚕4.0kb 丝胶1基因的m RNA 序列,在家蚕基因组中丝胶1基因含8个内含子[4]。
丝胶2基因也通过不同的剪切方式形成两条mRNA 编码丝胶2蛋白[2]。
丝胶1蛋白和丝胶2蛋白的表达受到组织的严格调控,也受到幼虫发育时期的调控[5]。
基因转录调控中,启动子是关键,启动子序列所含的顺式作用元件与转录调控因子的结合决定基因的转录。
家蚕丝胶1基因启动子中存在三个顺式作用元件SA (-103~-85)、SB (-149~-135)和SC (-204~-183),都能特异的与转录因子(SGF -1,SGF -3)结合[6]。
丝腺转录因子1(SGF -1)属于head/H NF -3家族,能特异结合SA 位点,认为决定了丝胶1基因的组织特异性表达[7]。
体外转录实验表明去除SA 元件能下调丝胶1基因启动子的活性[6]。
丝腺转录因子3(SGF -3)在丝腺核抽提物中含量最多,能与SC 位点特异的结合,体外转录实验同样证明去除SC 位点丝胶1基因启动子的活性也存在下调[8]。
我们在克隆家蚕丝胶1基因上游调控序列构建中部丝腺特异表达转基因载体时,发现不同家蚕品系丝胶1基因上游调控序列存在差异,在调查的66个家蚕品系中,丝胶1基因上游调控序列的-1015~+48位置存在多态性,PCR 扩增结果有1063bp 、636bp 及同时出现这两种条带的情况[9]。
家蚕(Bomby x mori )是由野桑蚕(B omby x m andar ina)驯化而来,二者的亲缘关系很近。
家蚕经历了强烈的人工选择,成为了完全驯养的昆虫,并依赖人类而生存,而野1第31卷 第2期2011年 6月 蚕 学 通 讯New sletter of Ser icultural Science *资助项目:重庆市攻关项目资助(编号:CST C2010AA 1003),中央高校基本科研业务费专项资金资助(编号:XDJK2009C158)。
2蚕学通讯31卷桑蚕完全在自然条件下生存。
与家蚕相比,野桑蚕具有较强的疾病防御及抗逆能力,但其蚕茧大小、生长速率等经济性状则显著弱于家蚕。
本实验调查了不同地方的野桑蚕丝胶1基因上游调控序列,结果表明野桑蚕sericin1上游调控序列也存在多态性,分别为636bp (H Q702378)及1061bp(H Q702379)。
对野桑蚕丝胶1基因(H Q702380)编码序列进行克隆,通过序列比对,分析家蚕与野桑蚕丝胶1基因同源序列之间的差异,旨在为进一步了解丝胶1基因的表达调控有所帮助。
1材料与方法1.1材料与试剂野桑蚕材料来自山东、重庆青木关、四川泸州、资阳、南充、湖南、苏州和日本。
克隆用宿主菌DH5A、质粒pSLfa1180fa由本实验室保存。
DNA聚合酶、M-M LV反转录酶购自PRO-MEGA公司;限制性内切酶H ind III、E co RI、M lu I、Sal I和S ma I及pMD18-T-vector购于T aKaRa公司;胶回收试剂盒购于上海华舜公司。
1.2野桑蚕丝胶1基因的克隆以GenBank中登录的家蚕丝胶1基因(ser icin1A)的核酸序列(AB112019.1)设计引物, Ser1F:5.AT GCGTT TCGTT CTGT GCT GC3.,Ser1R:5.T TAGTT GTAT TAAA CAC-CGAT3.,扩增野桑蚕丝胶1基因。
参照Tr ipure试剂说明提取重庆青木关野桑蚕5龄第3天丝腺总RNA,然后以野桑蚕总RNA为模板,按M-MLV反转录酶的使用说明进行cDNA 第一链的合成。
以野桑蚕cDNA为模板,用引物对Ser1F/Ser1R进行PCR扩增,反应条件为:94e预变性4min;94e30s,55e40s,72e4min,35个循环;72e延伸10min。
PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收目的产物,克隆到pMD18-T-vector中,酶切鉴定后送交上海英俊公司进行测序。
1.3野桑蚕丝胶1基因上游调控序列的克隆根据GenBank中登录的家蚕丝胶1基因上游调控序列(AB007831.1)和家蚕丝胶1基因mRNA序列(AB112019.1)设计引物,上游引物为Ser1p F:5.AAA GCAT AAGCGGT-CAGAAA CC3.,下游引物Ser1p R:5.GGT CT TT GGAT CGCT TGAT CC3.,通过PCR扩增野桑蚕丝胶1基因上游调控序列。
野桑蚕基因组DNA的抽提采用蛋白酶K/RNA酶A的方法提取。
以抽提的野桑蚕基因组DNA为模板,用引物对Ser1p F/Ser1p R进行PCR扩增,反应条件为:94e预变性4m in;94e50s,60e55s,72e90s,35个循环;72e延伸10m in。
将PCR产物回收、克隆、酶切鉴定并测序。
1.4序列分析克隆的野桑蚕丝胶1基因序列用DNAStar软件预测其蛋白质序列与家蚕Sericin1A c (Ser1A c,BAD00699.1),sericin1A(Ser1A,BAD00698.1),sericin1B(Ser1B,BA D00700.1),sericin1B(ser1B,Q17240)作muscle序列分析。
将测定的野桑蚕丝胶1基因上游调控序列和家蚕品系J115Sericin1上游调控序列及GenBank中登录的S ericin1上游调控序列AB007831.1作m uscle序列分析。
2 结果2.1 野桑蚕丝胶1基因的克隆以5龄3天野桑蚕丝腺cDNA 为模板,用引物对Ser1F/Ser1R 扩增得到一条约2.1kb 的条带。
将该片段回收连接到pM D18-T 载体中,用H ind III 和E coR I 双酶切鉴定筛选的重组质粒,酶切出一条长度约2.1kb 的片段(图1)。
阳性克隆进行测序后,由于野桑蚕丝胶1基因重复序列较多,导致不能拼接出完整的ORF 序列。
针对此种情况,先将克隆的野桑蚕丝胶1基因酶切,形成较小的片段后进行亚克隆,亚克隆测序后再进行拼接。
将克隆的野桑蚕丝胶1基因用多种限制性内切酶分别进行酶切,结果发现M lu I 可以将克隆的野桑蚕丝胶1基因酶切成约700bp 和1.4kb 的两个片段。
利用pMD18-T vecto r 上S al I 和S ma I 酶切位点,将克隆的野桑蚕丝胶1基因同时以M lu I 、S al I 和Sma I 进行酶切,回收700bp 小片段亚克隆到pSLfa1180fa 载体的M lu I 、S al I 位点,回收1.4kb 大片段亚克隆到pSLfa1180fa 载体的Mlu I 、Sma I 位点。
将两个亚克隆经酶切鉴定(图2)及测序拼接,得到一条完整的ORF 序列(GenBank 登录序列号:H Q702380)。
图1 野桑蚕丝胶1基因的P CR 及重组质粒的酶切检测A.野桑蚕丝胶1基因P CR 结果,1.PCR 结果,2.K -EcoT 14dig est markerB.H ind I II and EcoR I 酶切重组质粒,1.双酶切结果,2.K -EcoT 14digestmarker 图2 亚克隆酶切鉴定A.M luI,Sa lI 酶切重组质粒,1酶切结果, 2.K -EcoT 14dig est marker B.M luI,SmaI 酶切重组质粒,1.酶切结果, 2.K -EcoT 14digest marker2.2 野桑蚕丝胶1基因上游调控序列克隆以8个不同地方野桑蚕基因组DNA 为模板,用引物对Ser1p F/Ser1p R 进行野桑蚕丝胶1基因上游调控序列PCR 扩增,从山东野桑蚕基因组DNA 中扩增出一条约1kb 条带,从湖南野桑蚕、四川南充野桑蚕和重庆青木关野桑蚕基因组DNA 中扩增出一条约600bp 条带,另外4个样品没有扩增结果(图3)。
将扩增出约600bp 条带的青木关野桑蚕及扩增出1kb 条带的山东野桑蚕的PCR 产物回收后,克隆到pMD18-T 载体。
重组质粒经过酶切验证后进行测序。
32期 黄 科等:野桑蚕丝胶1基因Ser1A c 及其上游调控序列的克隆和序列分析图3 野桑蚕Sericin1启动子PCR 扩增1.泸州野桑蚕;2.湖南野桑蚕;3.资阳野桑蚕;4.南充野桑蚕;5.日本野桑蚕;6.山东野桑蚕;7.苏州野桑蚕;8.青木关野桑蚕;M.DL2000mar ker2.3 野桑蚕丝胶1基因序列分析克隆的野桑蚕Sericin 1序列用DNAStar 预测其蛋白质序列与家蚕Sericin 1A c (Ser1A c ,BAD00699.1)、Sericin 1A (Ser1A,BAD00698.1)、Sericin 1B 作muscle 序列分析(图4),结果表明:预测的野桑蚕丝胶1蛋白与家蚕Sericin 1A c 、Sericin 1A 、Sericin 1B(Ser 1B,BAD00700.1)、Sericin 1B (ser 1B,Q17240)有较强的相似性,相似性分别为98%、98%、92%、97%。
据Garel 等预测的丝胶1蛋白(Ser 1B,Q17240)一级结构中,Ser 1B 多肽中含1、2、3、4、5、7、8、9外显子[4],而野桑蚕丝胶1蛋白与家蚕Ser1A c 相似性最高,其只含1、2、7、8、9外显子,因此将克隆的2176bp 野桑蚕丝胶1基因命名为B.mandarin Sericin1A c 。