原生质体培养与诱变

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酶解法的优缺点
优点：获得量大，适用广泛。


缺点：
会影响所获原生质体的活力。 原因： 商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白 酶、过氧化物酶以及酚类物质。

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3. 原生质体纯化的方法
（1）过滤-离心法 （2）漂 浮 法 （3）沉 降 法 （4）不 连 续 梯 度 法
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（1）过滤-离心法 （沉降法）

荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)和电镜
技术
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② 细胞分裂
③ 愈伤组织或胚状体形成 ④ 植株再生
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几种不同类型的原生质体分裂和发育速度比较
第一次分 植板 原生质体类 裂 率 型 时间 % (%) 烟草叶片 4d 60 60 细胞分裂情况 2周—20个细胞 组成的细胞团 愈伤组 织分化 速度 1m形 成芽 胚状体 3周后 成苗 原生质 体到再 生植株 3m 4m
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度
3. 4. 5.
渗透压稳定剂 质膜稳定剂 分离条件：
离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持
续时间。
6.
分离用具
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酶的种类、组合、浓度
几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)
材料 烟草叶片 半纤 崩 纤维 维素 溃 素酶 酶 酶 1.0 1.0 1.0 果 胶 酶 离析 酶 0.1~0.2 0.5 蜗 牛 酶 研究者 Uchimiya Scott 李仕琼
18 使用浓度：0.01%
二、原生质体活力测定方法
（2） 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。 （3） 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法 (0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
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6.1.2.2 原生质体活力测定方法
由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原 生质体。也称为微小原生质体。 胞质体(cytoplast) 2 不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。
原生质体的应用
Regenerative ability
再生能力
Cell differentiation
Ontogenic processes
细胞分化
个体发生过程
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10

15
16
6.1.2 原生质体脱壁情况鉴定与活力测定
6.1.2.1
原生质体脱壁情况鉴定方法
① 低渗爆破法
a) 没有细胞壁，胀破后留下的残迹是无形的。 b) 如果原生质体还带有部分细胞壁，则原生质体 从无壁部分胀破，破碎后留下的残迹仍保持半 圆形的细胞壁。
Байду номын сангаас
② 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)

4. 琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管 以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿， 待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇 床上低速旋转培养。 培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压 来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生 长和发育，这种方法由于改善了培养物的通 气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂 和细胞团的形成。 32
（1）机 械 分 离 法 （2）酶 解 分 离 法
7
（1）机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶
液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原 生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织， 从伤口处可释放出完整的原生质体。 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少， 能够用此法产生原生质体的植物材料受到 限制。 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的 破坏作用。
2.双层培养法——液体-固体双层培养法
优点： 固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体 培养基中，如果在下层固体培养基中添加一 定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的 一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞 团的形成。 缺点： 不易观察细胞的发育过程。

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3. 固体薄层培养法
优点： 使原生质体处于固定位置，避免了原生质 体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的 细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定 点观察。 缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有 一定影响；另外，固体中单细胞生活能力 弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间 31 会推迟2d左右。
（二）胞质环流法 显微镜下观察原生质体是否存在胞质环流。 （三）渗透压变化 放入低渗溶液中，可正常膨大。 放入高渗溶液中，可正常膨小。 （四）氧电极法
光合作用—放氧 呼吸作用—耗氧
（五）形态识别 形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，
20
三、影响原生质体数量和活力的因素
1.
2.
供试材料及预处理方法 酶解条件：
① 细胞壁再生 ② 细胞分裂 ③ 愈伤组织或胚状体形成
④ 植株再生
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① 细胞壁再生是细胞分裂的先决条件
细胞壁再生所需时间与植物种类和起源细胞 的分化程度及生理状态有关。 再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微 纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成 多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间 或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的 纤维团，最后形成完整的细胞壁。 检测新壁合成的方法
0.1
Lakshmi
Lakshmi
檀香愈伤组织 1.0
榆幼叶
0.1~0.2
Dorin
0.5 Ahuja 0.5 诸葛强
23
山毛榉幼叶
1.0
0.5
胡杨悬浮细胞 0.5
1.0
pH
分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的 问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH 值是不一致的。 如制备菜豆叶片原生质体时：
禾谷类叶片 2.0 油菜花粉 1.0
马铃薯子叶 1.0
马铃薯花粉 0.5
0.5
1.0
戴朝曦
王蒂
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几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)
材料 纤维 素酶 半纤 崩溃 果胶酶 维素 酶 酶 0.2 离 研究者 析 酶 0.2 孙勇如等
枸杞愈伤组织 0.5 檀香幼叶 2.0
0.5
0.5 0.5 0.5 0.05 0.01~0.03

25
渗透压稳定剂
原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将 引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤 液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内 外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而 破坏内部结构。 常用的渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡 萄糖、蔗糖等，浓度约在0.40M~0.80M。渗 透压稳定剂还可促进分离的原生质体再生细 胞壁并继续分裂 。
用于分离原生质体的材料
1. 材料预处理
用黑暗处理和低温处理等方法，可提高某些 材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4oC处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的 原生质体才能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分 离原生质体，才能获得高产量。 6
2. 原生质体分离的方法
6.
7. 8. 9.
材料预处理 原生质体分离的方法 原生质体纯化 原生质体活力测定 影响原生质体数量和活力的因素 原生质体培养方法 影响原生质体培养的因素 原生质体再生过程 原生质体的诱变
Flash
4
6.1.1 植物原生质体的分离纯化
1. 2.
3.
材料预处理 原生质体分离的方法 原生质体纯化方法
5

二、影响原生质体培养的因素
1.
2.
原生质体的活力 原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原
生质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞 只能分裂一、二次，密度在104个／ml以上， 植板率常显著提高。
3. 4.
渗透压稳定剂 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
Organogenesis
器官发生
Somatic genetics
体细胞遗传学
Protoplast 原生质体
Cell physiology
细胞生理
Cell fusion 细胞融合
Organelle, DNA uptake
细胞器、DNA的摄取
Cell cloning 3 细胞克隆
本章内容
1.
2. 3. 4. 5.

40-100mm网筛 低速离心
利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中， 先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原 生质体沉积于试管底部。 优缺点：

纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互 挤压， 12 常引起原生质体的破碎。

采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖[25%]、Percoll、 Ficoll）， 使原生质体漂浮在液 Protoplast 体表层的纯化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 （2）飘浮法 用不同浓度和不同离心速度分次 13 漂浮的方法。
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 33 培养基为基础 改进的。
二、影响原生质体培养的因素
5. 培养条件
温度，光照
6. 植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
7. 供体细胞的生长同步性
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三、原生质体再生过程
1.
2.
概念：原生质体再生过程是指分离、纯化 的原生质体在适当的培养方法和良好的培 养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持 续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织 或通过胚状体分化出完整植株的过程。 过程：