5基于途径分析的L_异亮氨酸发酵溶氧控制研究

基于最优途径分析和溶氧对代谢过程的影响, 本文 提出了利用控制溶氧来提高 L 异亮氨酸产量的方法。 2. 2 L 异亮氨酸溶氧控制 2. 2. 1 不同 转速对溶氧的影响 在发酵培养基组 成 和其它发酵条件相 同的情况下, 考察了不同 转速值 对 应发酵 过程 相 对溶 氧 ( DO ) 变化 的 情况 ( DO 以 饱 和 N a2 SO3 溶液中溶氧 浓度为 0, 以蒸 馏水中最 大溶氧 浓 度 0. 21 ! 10- 3 km ol/m 3 为 100% 计算 ) , 结果见图 2。
收稿日期: 2006 08 09 修回日期: 2006 12 28 * 天津市科技攻关项目 ( 05Y FG PGX 07000 ) ** 通讯作者, 电子信箱: w en ty@ im. ac. cn
色氨酸产量达到 9. 03g /L。 现阶段国内外对 L 异亮氨酸途径分析的研究还比
较欠缺, 因而本文以途径分析理论为指导, 确定了黄色 短杆菌由葡萄糖生产 L 异亮氨酸的最佳途径。根据途 径分析的结果利用改变溶氧的方法来改变细胞内部的 代谢流 分 布, 使 其在 特 定环 境下 生成 更 多的 L 异 亮 氨酸。
经途径分析 后, 一个特殊的 代谢路径的 所有酶 被 过量表达时, 编码不必要的酶的基因被敲除, 就会构建 出一个高产的路径。为了避免通过 TCA 循环和乙醛酸 支路生成 OAA 而造成碳源的浪费, 可以通过过量表达 PEP羧化 酶的基因直接使 PEP 生成 OAA 或过量表 达 丙酮酸激酶的基因和丙酮酸 羧化酶的基因通过 Pyr生
通过途径分析可知, 葡 萄糖进入 L 异亮氨酸生 成 途径有两种方式, 一是 PEP Pyr A c C oA OAA, 另一 种是 CO2 的回补反应, 即 PE P直接生成 OAA。若通过 TCA 循环生成 OAA, 则会生成 CO2 造成 碳源损失。在 模型 1和模型 2 中, 由 1m ol葡 萄糖生成 1m olL 异亮 氨 酸, 产率高达 100% , 见图 1。其 原因就是 PEP或 PYR 直接生成 OAA, 且葡萄糖由 EM P途径进入代谢网络而 不通过 HM P 途 径进 入代谢 网络, 从而避 免了 碳源 的 浪费。
Vo .l 27 No. 2 2007
Hale Waihona Puke 但谷氨酸代谢流却 明显降低, 在 发酵中后期 控制较 低 溶氧, 谷氨酸合成代谢流较大。 X iao等 [13] 研究了不 同 溶氧对谷氨酸发酵中两个关键酶 ( 谷氨酸脱氢酶 GDH 和乳酸脱氢酶 LDH ) 和代谢流的影响, 研究表明, 在 过 低溶氧条件下, TCA 循环代谢流量减小, 不足以平衡葡 萄糖酵解速率, 从而刺激了 LDH 的酶活, 使代谢流转向 乳酸生成, 造成乳酸积累; 而过高溶氧, GDH 酶活明 显 降低, 且 TCA 循环流 量加大, 生成 大量 CO2, 造成碳 源 损失, 两种情况 均不利于谷 氨酸生成。刘 勇等 [ 2] 的 研 究表明, 在 L 异亮氨酸发酵中, 转速不同对各种氨基酸 产量有明 显 影 响, 低 转 速时 产 生 杂 酸 较 多。 宋 文 军 等 [14] 给出了 L 异 亮氨酸发 酵中后 期不同转 速下的 代 谢流分布, 研究表 明, 转速过低, TCA 循环代 谢流量 减 小, 但副产氨基酸流量增加, 差不多每一种副产氨基酸 的代谢流均要比高 转速时要大, 尤其是副产 缬氨酸 明 显过多。随着转速增加, TCA 循环代谢流量增加, 各副 产氨基酸流量减小, 这说明供氧充足有利于抑制杂酸。 但是供氧过高又会造成 TCA 途径流量过大, 导致 L 异 亮氨酸的代谢流减小, 这说 明控制合适 的溶氧对 L 异 亮氨酸发酵至关重要。若能在发酵过程中恰当控制溶 氧, 就可以改变代谢流 量, 从而增大 L 异亮氨酸 产率, 减少杂酸生成。
感分析仪测定。 1. 4. 2 OD 值的 测定 将发酵液稀释 一定倍数后, 在 波长 620nm 处用分光光度计测定。 1. 4. 3 发酵液中氨基酸含量测定 采用 E lite AAA 型 氨基酸分析仪测定。
2 结果和讨论
2. 1 L 异亮氨酸生物合成途径分析 根据 L 异亮氨酸代谢网络以及各步反应的化学计
摘要 利用途径分析方法对黄色短杆菌 ( B revibacterium f lavum ) TC 21 生产 L 异亮氨酸的途径进 行了分析, 确定了黄色短杆菌 TC 21生产 L 异亮氨酸的最佳途径的通量分布, 根据途径分析的结 果, 发酵过程中的代谢流量对 L 异亮氨酸产量有明显影响, 而代谢流量与发酵过程中的溶氧密切 相关, 因此可以通过控制溶氧来提高 L 异亮氨酸产量。在发酵过程的不同阶段, 根据菌体生长和 产酸的需求, 改变合成途径的代谢流量, 可以有效提高产酸率。实验证明, 通过溶氧分阶段控制 发酵生产 L 异亮氨酸, 比溶氧恒定控制方式发酵产率提高了 15. 77% 。实验结果说明, 用途径分 析的结果指导发酵过程中的溶氧可以大幅度提高 L 异亮氨酸的产量。 关键词 L 异亮氨酸 途径分析 溶氧控制 黄色短杆菌 中图分类号 Q815
种子培 养基: 葡萄糖 30, KH2 PO4 1. 5, M gSO4 0. 4, FeSO4 0. 01, M nSO4 0. 01, ( NH 4 ) 2 SO4 3, 尿 素 2, 豆饼水 解液 20m l/L, 生物素 0. 5m g/L, VB1 2. 5m g /L, pH 7. 0~ 7. 2。
量平衡式, 可由计算机计算出该代谢可分为 9 个模型。 产率最高的基本模型代表了最优途径。最优途径和通 量分布见图 1[ 5]。
图 1 由葡萄糖到 L 异亮氨酸的最优途径和 通量分布 F ig. 1 Op tim al pathways and f lux d istr ibu tion for converting glucose to L isoleu cine
图 2 L Ile发酵在不同 转速下 DO 的变化 F ig. 2 Change of DO of d ifferen t stirr ing speed
in L Isoleucine ferm enta tion
图 3 不同转速对生长速率和产酸速率的影响 虚心表示转速对产酸的影响, 实心表示转速对 O D620的影响
种子 培 养: 接 一 环生 长 良好 的 斜 面种 子 至 装 有 25m l种子培养基的 500m l摇瓶中, 置于 旋转式摇床 上 ( 200 r/m in ), 31 振荡培养 38h。
发酵: 按 15%接种量将种子液接入 5L 自动控制发 酵罐中, 装液量 3L, 通风量 1 ~ 3L /m in, 根据 溶氧控 制 搅拌转速, 培养温度 31 , 通过自动流加浓氨水溶液控 制 pH 7. 0, 发酵 88h。 1. 4 分析方法 1. 4. 1 发酵液中残糖测定 采用 SBA 40 系列生物传
发 酵 培 养 基: 葡 萄 糖 70, ( NH 4 ) 2 SO4 15, FeSO4 0. 015, M gSO4 0. 5, M nSO4 0. 015, KH 2 PO4 1. 5, K2H PO4
2007, 27( 2)
杨 宁 等: 基于途径分析的 L 异亮氨酸发酵溶 氧控制研究
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3, 生物素 140 g /L, VB1 0. 1m g /L, M et 0. 02, 豆饼水 解 液 20m l/L, 玉米浆 25m l/L, pH 7. 0 ~ 7. 2。 1. 3 培养方法
中国生物工程杂志 Ch ina B iotechnology, 2007, 27( 2): 70~ 75
基于途径分析的 L 异亮氨酸发酵溶氧控制研究*
杨 宁 1 王 健 2 徐庆阳 1 陈 宁 1 温廷益 1, 3**
( 1 天津科技大学生物工程学院 天津 300222 2 吉林大学生物与农业工程学院 长春 130022) ( 3 中国科学院微生物研究所 北京 100080)
1 材料和方法
1. 1 供试菌株 黄色短杆 菌 B rev iba cterium f lavum TC 21 (M et- +
E thr + ABr + AEC r ) , 天津科技大学代谢控制发酵研 究室保藏菌种。 1. 2 培养基 ( g /L )
斜面培养基: 葡萄糖 1, 酵母膏 5, 蛋白胨 10, 氯化 钠 2. 5, 琼脂 20, pH 7. 0~ 7. 2。
成 OAA。为了避 免 因 生成 CO2 而 造 成浪 费, 应该 对 6 磷酸葡萄糖脱 氢酶进 行截 堵。按 照途 径分析 结果, HM P途径、TCA 循环和乙醛酸支路应该减弱, 从而使碳 架流转向异亮氨酸的合成, 因为 TCA 循环 中的酮戊二 酸脱氢酶和柠 檬酸合成酶 催化的反应 是不可逆 的, 能 量和许多中间代谢物需要 TCA 循环来 提供, 所以该循 环中的酶不能被完全去除。现阶段国内外各种研究表 明 [ 2, 3, , 12~ 14] 溶氧对代谢 过程有显 著影响, 故本文 采用 控制溶氧的方法来改变 L 异亮氨酸代谢, 进而提高 L 异亮氨酸产率。
虽然溶氧影响 L 异亮氨酸合成代谢的机理尚未完 全清楚, 但国内 外已有多人 对溶氧与代 谢过程的 关系 进行了研究。 Zhang等 [ 12] 给出了谷氨酸发 酵过程中溶 氧与代谢流量的量化关系, 研究表明, 在其它条件相同 情况下, 高溶氧条件下 TCA 循环代谢流量大于低溶氧,
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中国生物工程杂志 China B io techno logy
F ig. 3 Rate of grow th and rate of L Iso leuc ine by d ifferent revolution s p er m inu te
由图 2 可知, 在控制不同转速的发酵过程中, 相对 溶氧 ( DO )均表现出相似的变化规律, 但发酵的不同阶 段对氧的需求不同。在发酵初期 ( 0 ~ 32h ) , 菌体耗 氧 速率明显快于供氧速率, 表现为相对溶氧的迅速下降; 而 32h后, 好氧速率 和供氧速 率基本 保持平衡。发 酵 末期 ( 60h 后 ) , 相对溶 氧回 升, 发 酵结 束相 对溶 氧 达 40% 以上。 2. 2. 2 不同转速对 L 异亮 氨酸生产菌 生长和产酸 的 影响 在其它发 酵条件相同 的情况下, 控制 不同转 速 进行 5L 罐的分批发酵, 得到发酵过程不同时刻生长速 率与产酸速率随时间的变化曲线结果, 如图 3所示。