基因操作中大分子的分离和分析
第讲 目的基因的克隆与分离
第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。
目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。
本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。
一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。
PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。
PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。
2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。
基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。
其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。
基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。
3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。
这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。
限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。
二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。
它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。
分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。
2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。
这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。
化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。
3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。
通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。
生物大分子的分离与制备(共89张PPT)
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生物分子的结构与功能分析：
1. 蛋白质结构分析
2. 酶活力检测
3. 蛋白质组学分析
4. DNA序列分析
5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交
7. 基因克隆8. 基因组构建9. cDNA构建
10. 筛选11. 报告基因检测12. 基因芯片
13. 基因敲除
➢ 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋 白质的合成。
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生物化学分离方法与一般的化学分离方法相比，有下列
几个特点： • 生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化
合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢 变化，如蛋白质和核酸的水解。
有些化合物的含量极微，如激素等。 许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变 变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。
• 功能或分子生物化学阶段（1950 年至今）。研究生命的本质和奥秘： 运动、神经、内分泌、生长、发育、繁殖等的分子机理 。
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生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究的方法：
– 观察：生命现象
– 分离：未知蛋白组分，新基因片段，新的次生代谢物。 （抽提、过 滤、离心、色谱）
立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之 间相互聚集并从溶液中析出。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。
脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热 （50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后 凝聚成油块而被除去。
凝胶电泳在基因操作中的用途
凝胶电泳在基因操作中的用途凝胶电泳是一种常用的分离DNA、RNA和蛋白质的方法，它广泛应用于基因操作中。
本文将从凝胶电泳的原理、分类及其在基因操作中的用途等方面进行阐述。
一、凝胶电泳的原理凝胶电泳的原理是利用凝胶作为分离介质，通过电场作用将目标分子分离出来。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯凝胶等。
在凝胶中，通过电泳电场的作用，DNA、RNA和蛋白质等分子会向电极移动，分子的迁移速度与其分子大小、电荷量和凝胶孔径大小有关。
在电泳过程中，DNA、RNA和蛋白质等分子会被分离出来，可以根据其大小、电荷量等特性进行鉴定和分析。
二、凝胶电泳的分类凝胶电泳按照不同的分离介质和分子类型可以分为不同的类型。
常见的凝胶电泳包括：1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常见的DNA分离方法，适用于分离较小的DNA分子。
琼脂糖凝胶可以根据其浓度和孔径大小调整分子分离的范围。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种高分辨率的分离方法，适用于分离较大的DNA和蛋白质分子。
聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小可以通过调整交联剂的浓度和聚合物的比例来控制。
3.聚丙烯凝胶电泳聚丙烯凝胶电泳是一种分离较大分子的方法，适用于DNA和RNA的分离。
聚丙烯凝胶的孔径大小可以通过调整聚合物的浓度和孵育时间来控制。
三、凝胶电泳在基因操作中的用途凝胶电泳在基因操作中具有广泛的用途，主要包括：1.分离DNA和RNA凝胶电泳是一种常用的DNA和RNA分离方法，可以用于提取DNA和RNA等分子。
在分离DNA和RNA的过程中，可以通过调整凝胶孔径大小和电场强度来控制分子的分离范围。
2.检测PCR产物凝胶电泳可以用于检测PCR产物，通过分析PCR产物的大小和数量来判断PCR反应的效果。
在PCR反应中，PCR产物可以通过引物的设计来控制其大小，通过凝胶电泳可以检测PCR产物的大小和数量。
3.分离蛋白质凝胶电泳可以用于分离蛋白质，通过调整凝胶孔径大小和电场强度来控制蛋白质的分离范围。
《基因工程的》教学大纲设计
红河学院《基因工程》理论课程教学大纲一、课程基本情况与说明（一）课程代码：（二）课程英文名称: Genetic Engineering（三）课程中文名称: 基因工程（四）授课对象：生物技术专业生物科学专业（五）开课单位：生命科学与技术学院（六）教材：《基因工程》，孙明主编，高等教育出版社，2006（七）参考书目[1] 《基因工程》，楼士林，北京科学出版社；[2] 《基因工程原理与应用》，陈宏，中国农业出版社；[3] 《基因工程》，刘祥林、聂刘旺，科学出版社。
（八）课程性质《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程，同时也是生物科学专业的专业选修课。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程(包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程)中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
（九）教学目的1.使学生对基因工程基本原理及其主要操作技术有比较全面、系统的认识；2.使学生通过学习能够清楚基因工程的实质及发展现状；3.调动学生对基因工程技术的兴趣，使学生能运用所学的基本理论、知识和技能，分析和解决生产实践中相关的一般问题。
（十）教学基本要求要求学生通过本课程的学习了解并掌握基因操作基本原理和操作技术，清楚基因工程的实质和发展现状，并能够在实际的生产实践中较灵活的运用。
（十一）学时数、学分数及学时数具体分配学时数：54学时分数：3学分（十二）教学方式本课程是一门实践性很强的课程，理论课程与实验课程同步进行，在教学过程中，教师应充分利用现代教育技术，结合多媒体资料，使学生直观了解课程内容。
基因工程在生物制药领域的应用探讨
基因工程在生物制药领域的应用探讨作者：匡光永来源：《中国民商》2021年第08期摘要：随着经济社会的发展，生物制药领域开始引入基因工程技术，使用基因工程技术对自身进行改造和发展。
本文从生物制药领域中的基因操作技术分析概念入手，进行以基因工程为基础的其中几类药物类型的分析，从而了解基因工程生物制药所面临的机遇以及需要解决的问题，从而使其得到更好的发展。
关键词：基因工程;生物制药;前景一、生物制药领域中的基因操作技术分析（一）基因大分子分离技术DNA大分子的分离技术，最常用的是DNA电泳。
在电泳之前，首先要提取基因所在的位置，以细菌的质粒DNA为例，现阶段使用的提取方法是碱裂解法，具体是将含有质粒的大肠杆菌用NaOH和SDS混合的变性液进行处理，再用高速离心机离心处理，从而将质粒DNA分离出来。
进一步地，如果想要分离出目的DNA片段，就需要用到DNA电泳技术，常用的电泳是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
凝胶电泳的原理其实很简单，DNA是一种多聚阴离子，将其放置在电场中，DNA分子就会迁移到正电极的方向，DNA分子的长度越长，携带的净电荷越多，向正电极方向迁移的速率就越快，因此，在电场强度一定的条件下，DNA 分子的迁移速率取决于DNA片段的大小和构型。
电泳的步骤为：配胶-制胶板-样品的处理-点样-电泳-检测。
（二）PCR技术PCR技术，即聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术，可以实现短时间内少量甚至微量DNA分子的大量扩增。
PCR技术是分子克隆技术的基石，是基因工程中必不可少的技术。
PCR技术的原理来源于DNA的半保留复制，在生物体内，DNA的复制过程分为三个阶段：复制的起始、延伸和终止，PCR也分为三个阶段：高温变性、复性和延伸，这三个阶段不断的循环往复，从而得到大量的目的基因。
PCR技术已广泛应用于基因的克隆，分子探针的制备和基因定位等实验中，在生物制药领域中也常用于诊断试剂的开发。
生物化学与分子生物学教案
生物化学与分子生物学教案标题：生物化学与分子生物学教案一、课程简介生物化学和分子生物学是生命科学领域的重要学科，它们从分子水平研究生命的现象和本质。
本教案旨在帮助学生理解生物化学和分子生物学的概念、技术和方法，掌握生命体系内化学反应的原理和机制。
二、课程目标1、理解生物化学和分子生物学的基本概念，掌握生命体系内的重要化学反应。
2、理解基因、蛋白质等生物大分子的结构与功能，掌握基因表达的调控机制。
3、掌握生物大分子的分离、分析、鉴定技术，了解生物学研究的实验设计和方法。
4、培养学生的科学素养，提高其分析问题、解决问题的能力。
三、课程内容1、生物化学基础：介绍生命体系内的化学反应、能量转换、物质代谢等基本概念和过程。
2、分子生物学：介绍基因、DNA、RNA、蛋白质的结构与功能，基因表达的调控机制等。
3、生物大分子的分离与分析：介绍生物大分子的分离、纯化、分析、鉴定技术，如蛋白质分离纯化、氨基酸序列分析、DNA测序等。
4、实验技术：介绍生物化学和分子生物学实验的基本技术和方法，如基因克隆、DNA重组、基因敲除等。
5、实验设计：培养学生根据研究问题设计实验、分析实验结果的能力。
四、教学方法1、课堂讲解：教师讲解基本概念、理论和实验技术。
2、案例分析：通过具体案例分析，帮助学生理解生物化学和分子生物学的应用。
3、实验室实践：学生在教师指导下进行实验操作，掌握实验技能。
4、小组讨论：学生分组讨论，培养团队协作和沟通能力。
5、问题解答：鼓励学生提问，教师解答学生的疑问。
五、评估方式1、课堂表现：学生的课堂参与度、小组讨论表现等。
2、作业：学生完成课后作业，检验学习成果。
3、实验报告：学生在实验后提交实验报告，包括实验目的、过程、结果和分析。
4、期末考试：全面考察学生对课程内容的掌握情况。
六、教学资源1、教材：选用优秀的生物化学和分子生物学教材，如《生物化学原理》、《分子生物学》等。
2、参考书：推荐相关领域的参考书，帮助学生深入学习。
DNA的粗提取与鉴定PCR蛋白质的提取与分离
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链 四个亚铁红素基团
一、血红蛋白的提取和分离 1.分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多 少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的 蛋白质。
方法步骤 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液
加入物质
目的 ① ② ③ ④ ⑤
2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1 蒸馏水 3.溶解细胞核内的DNA 4.析出含 DNA 的黏稠物 5.滤取含 DNA 的黏稠物 6.将 DNA 的黏稠物再溶解 7.过滤含 DNA 的 NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的DNA 冷却的 95％的酒精 50 mL A:(1)向试管中加入0. 015 mol ／L 的 NaCl 溶液 5mL (2)加入 DNA 9.DNA 的鉴定 (3)4 mL 二苯胺试剂 B:(1)向试管中加入0.015mol／L 的 NaCl 溶液 5mL 2 mol／L 的 NaCl 溶液 20 mL 2 m1／L 的 NaCI 溶液 40mL 蒸馏水
答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出
3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色
答：D
4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液 中的上清液? 答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于 上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以 要除去上清液(含有蛋白质)。
二、方法与过程
1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）
0.1g/mL柠檬酸钠100mL 500mL烧杯中，玻棒搅拌， 离心、分离或静置沉淀。 活鸡鲜血180mL 2.提取DNA。 ⑴.提取血细胞核物质： ①取血细胞5-10mL＋20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向 快速搅拌。 ②纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。 ③原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速 搅拌，机械加速血细胞破裂。 ⑵.溶解核内的DNA： 滤液＋2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向 轻缓搅拌。
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程第一章基因工程概述1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT)基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术.2、基因工程的历史基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化基因工程发展阶段的几个重要事件：一系列新的基因工程操作技术的出现；各种表达克隆载体的成功构建；一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现3、基因工程的内容（P9）4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)第二章分子克隆工具酶5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答)概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内特点（参加PPT）命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。
分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。
真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ6、几个基本概念粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。
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第二章 基因操作中大分子的分离和分析
2、透析袋电洗脱法---回收大片段DNA
将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来，放在透析
袋中，置于电泳缓冲液中电泳，DNA将从凝胶块中“跑” 出来，贴在透析袋内壁上。
取出凝胶块，更换新鲜缓冲液，反方向电泳，使DNA游离
于缓冲液中；
取出含DNA的缓冲液，通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀可获
溴化乙锭(EB)可很好地摻入到双链DNA
中，在紫外光的激发下会发出橙红色的荧 光，可用于对DNA进行染色和观察。
用于观察的紫外光共有3种波长
短波紫外光(254nm)观察效果好，但对 DNA的破坏很大
一般使用中波紫外光(302nm)
所观察的DNA需要回收时，尽量使用长 波紫外光(366nm)，否则得到的DNA被 紫外光照射后将丧失“生命力”。
1953年Watson和Crick建立了DNA分子的双螺旋结 构模型，论文发表在《Nature》，获1962年诺贝尔生 理学-医学奖。
计算机模拟DNA构型
B
A
Z
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
form B A Z
condition
rh92~95 低Na+ rh75,高Na+ RNA-DNA 富含G-C 高K+
2、碱裂解法提取质粒DNA的原理
由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，其工作 原理广泛适用于微生物质粒的提取。
碱裂解法提取质粒的整个过程主要用到3种溶液，
即溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。
核心原理：
在碱性条件下(pH12.0~12.5)线状DNA发生变性，质粒 DNA维持环状。 在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成 沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。
三、质粒DNA的分离和纯化
1、提纯质粒DNA的三个步骤：
培养细菌
对数生长期的细菌。
收集和裂解细菌：通过离心法收获细菌菌体。
细菌的裂解方法有：非离子型或离子型去污剂、有机溶 剂、碱裂解法以及加热处理等。
纯化质粒DNA
琼脂糖凝胶电泳 CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心法
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
Base turn 10 11 12
Rat
pair
36° 32.7° 30 °
Height pair 3.38 Ǻ 2.56 Ǻ 3.71 Ǻ
diameter 19 Ǻ 23 Ǻ 18 Ǻ
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
2、DNA分子的重要特性
变性(denaturation）
一个典型哺乳动物细胞约含10-5μg RNA，其中80~85%为rRNA (28S、18S和 5S 3种rRNA)，其余15~20%主要由各种
类型的低分子量RNA组成(如tRNA、
MicroRNA)。mRNA为总RNA的1~5%， 同时由于mRNA是单链，容易受到核酸
酶的攻击，导致在RNA的操作过程中易
按体积比2:1用无水乙醇或1:1用异丙醇在酸性条件下
（加1/10 体积的3M 醋酸钠，pH5.2）沉淀DNA。
用RNase去除RNA
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
4、通过试剂盒分离纯化质粒DNA
核心技术：使用一种特制的微型离心纯化柱，在柱中有
一种特殊的硅胶膜(silica membrane)。在高浓度盐条件下 该膜可以结合多至20μg的DNA，最后用小体积的水或低 离子强度的缓冲液可将DNA洗脱下来。
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
二、染色体DNA的分离和纯化
真核生物和原核生物细胞的基因组DNA，其分子 大小约为103~106 kb。其目的是分离目的基因或基因表 达调控因子如启动子以及提供构建染色体载体和染色 体基因整合平台等等。
1、材料准备 使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容 易提取和含量最高的组织。
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
一、DNA的结构及其特性 二、染色体DNA的分离和纯化
三、质粒DNA的分离和纯化
四、DNA的琼脂糖凝胶电泳 五、DNA片段的纯化 六、DNA的浓缩 七、RNA的分离和纯化
八、分子杂交
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
一、DNA的结构及其特性
1、DNA的组成和结构
RNA酶抑制剂的使用
在RNA样品中和RNA反应中加入RNA酶抑制剂(蛋白类 抑制剂)。
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
3、RNA的抽提和纯化 酚-异硫氰酸胍抽屉法
Trizol试剂是使用最广泛的抽提总RNA的专用试剂，主 要由苯酚和异硫氰酸胍组成，适用于绝大多数生物材料。 特点：该RNA样品几乎不含蛋白质和DNA，可直接用于 分子杂交、mRNA纯化、RT-PCR、分子克隆等等。
乙醇处理时的温度通常是-20℃，时间在30分钟以上。
若DNA片段小于1kb，或量比较少(少于0.1μg/ml)，则于 -70℃沉淀，或延长沉淀时间。
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
2、正丁醇抽提法
向DNA溶液中加入1倍 体积的正丁醇，充分混匀，以1600r/min离心1min，弃上相
与电流大小成正比 DNA的结构影响其泳动速率：
分子量相同的DNA分子，其物理构象越接近球状，泳动 时遇到的阻力就越小，泳动就越快。
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
质粒DNA的三种构型：
1）共价闭合环状超螺旋 （SC构型） 2）缺口环状 （OC构型） 3）线状 （L构型） 质粒DNA在电场中的泳动速率：
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
DNA的泳动方向是从负极向正极
Bio-Rab电泳仪电源
水平电泳槽和一些梳子
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
影响DNA样品的泳动速率的因素
DNA样品迁移率与凝胶浓度成反比 与DNA分子量对数成反比
在操作时，常用一个已知含量和相对分子量的DNA样品 (Marker)做对照，用来比对待测样品的相对分子量和含量
得纯化的DNA片段。
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
3、Glass Milk (bead)结合法---回收小片段DNA
琼脂糖凝胶在3倍体积的3mol/L NaI溶液作用下于55℃会溶
化，从而使DNA释放到水溶液中；
在高盐浓度下硅粒(glass bead, 水溶液呈牛奶状)可特异性吸
附DNA；
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
抽提/裂解缓冲液(具体内容见教材P100-101)
溶液Ⅰ：灭菌后，4℃保存 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液Ⅱ：现用现配，室温下使用( pH12.0~12.5 ) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ：灭菌后，4℃保存，用时冰浴(pH4.6) 5mol/L乙酸钾 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml
超螺旋＞开环形＞线性
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
Marker---DNA分子标尺
DNA点样孔
15000 bp 1000 bp 8000 bp 5000 bp
开环和线性DNA 分子
超螺旋DNA分子
2500 bp
1000 bp
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
五、DNA片段的纯化
1、低熔点琼脂糖凝胶电泳法----回收大片段DNA
指在温度、pH等因素作用下，DNA分子的氢键受到破 坏，双链分开的过程。
复性(renaturation)
是变性的逆过程，DNA互补配对成为双链的过程。
带电性
一般pH下，带负电荷，可电泳分离。
水溶解性
DNA分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等 电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是提取和分离DNA 的依据。
低熔点琼脂糖在水溶液中的熔解温度很低，在65℃以下；
当琼脂糖水溶液的温度降低到20~30 ℃时，会凝结成固形物。
具体操作过程
在分离特定DNA片段时，可用低熔点琼脂糖凝胶进行分 析； 切割带有目的DNA的琼脂糖凝胶块，加入适量缓冲液， 加热到60℃，凝胶溶化，DNA进入水溶液中； 通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀可获得纯化的DNA片段
通过离心对硅粒进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅
粒中将吸附的DNA洗脱出来。
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
4、Qiagen纯化柱---回收小片段DNA
是目前使用最方便的工具，其核心技术是使用带硅胶膜的
纯化柱。
首先用3倍体积的特殊高盐溶液于55℃溶化带目的DNA片
段的琼脂糖凝胶块，将DNA释放到水溶液中； 将水溶液通过纯化柱，经过结合-洗涤-洗脱步骤，直接 得到纯化的DNA样品。
于降解。
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
2、控制即使高温灭菌也不可完全清除其活性。
溶液和用具的去RNA酶处理
耐热的物品，如玻璃制品，通过高温干热灭菌效果较好 一次性使用的物品，如微量移液吸头和微量离心管，一 般通过湿热灭菌就可使用，严格的操作是用0.1%焦碳酸 二乙酯(DEPC)处理过的水浸泡后再灭菌 电泳用具：专用！用3% H2O2和0.1% DEPC水浸泡，清 洗干净。
大肠杆菌：菌液培养至对数生长期后期 植物：幼嫩的植株或黄化幼苗
动物：肝脏应清除净胆囊
第二章 基因操作中大分子的分离和分析
2、细胞裂解 关系到能否提取到DNA以及影响DNA得率高低和 质量的关键步骤。
细胞裂解缓冲液：防止和抑制内源DNase对DNA的降解 100 mmol/L Tris-HCl, pH8.0 100 mmol/L EDTA；250 mmol/L NaCl
第二章 基因操作中大分子的分离和分析