基因编辑技术PPT
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基因编辑技术和原理ppt课件
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
什么是基因编辑技术？
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技 术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点 上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片 段。此过程既模拟了基因的自然突变， 又修改并编辑 了原有的基因组， 真正达成了“编辑基因”。
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转 录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形 成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并 启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA) 靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
三种不同技术的比较
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业法权益
基因编辑的不足 • 基因编辑是一项新技术， 还存在构建复杂和价
格的问题， 其脱靶效应限制了其在基因治疗等 应用上的发展。
什么是基因编辑技术？
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技 术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点 上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片 段。此过程既模拟了基因的自然突变， 又修改并编辑 了原有的基因组， 真正达成了“编辑基因”。
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转 录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形 成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并 启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA) 靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
三种不同技术的比较
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业法权益
基因编辑的不足 • 基因编辑是一项新技术， 还存在构建复杂和价
格的问题， 其脱靶效应限制了其在基因治疗等 应用上的发展。
crispr cas9技术课件PPT
8
2.CRISPR/Cas9技术的缺点 1.脱靶效应
2021/3/10
7
CRISPR/技术的前景及优缺点
➢ 3.2 CRISPR-Cas9系统的应用前景 ➢ 1.在基因敲除方面具有绝对的优势 ➢ 2.可以用于因单基因突变造成的遗传病治疗 ➢ 3.在家畜及农业育种方面带来新的基因编辑技术
2021/3/10
1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重 新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。 较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来的并发症。
➢ 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质 高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。
➢ 2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞
EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引 导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
2021/3/10
3
CRISPR/cas9作用机理
1.CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在 的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列 作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基 因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔 序列整合到两个重复序列之间
基因编辑技术在医学领域的应用培训课件
目前最常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统，它通过向 导RNA将Cas9核酸酶引导到目标基因位点，实现精准的基因 编辑。
基因编辑技术的发展历程
基因编辑技术的发展经历了早期的基因敲除技术、ZFNs（锌指核酸酶）和 TALENs（转录激活因子样效应物核酸酶）等阶段，直到近年来CRISPR-Cas9系 统的出现，使得基因编辑技术取得了突破性的进展。
02
伦理和法律监管
随着基因编辑技术的发展，伦理 和法律监管将逐渐加强，确保技 术的安全和合理应用。
03
社会接受度逐渐提 高
随着技术的成熟和应用的广泛， 社会对基因编辑技
基因编辑技术的基本原理
介绍了CRISPR-Cas9系统的工作机制，以及基因编辑过程中的关 键步骤。
生物多样性
基因编辑技术可能对生物多样性产生威胁，因为 它可能导致基因库的单一性和脆弱性增加。
法规与监管
法规缺失
目前全球范围内对于基因编辑技 术的监管还存在一定的空白和不 确定性。
监管难度
由于基因编辑技术的复杂性和快 速变化，监管机构面临着监管难 度和挑战。
国际合作
加强国际合作和交流，共同制定 和完善基因编辑技术的法规和监 管体系，以确保技术的安全可控 发展。
在医学领域的应用前景
遗传性疾病的治疗
基因编辑技术有望治愈一些遗传性疾病，如囊性 纤维化、血友病等。
癌症治疗
通过编辑癌症细胞的基因，实现精准治疗和个性 化治疗。
罕见病治疗
针对罕见病患者，基因编辑技术有望提供有效的 治疗方案。
社会对基因编辑技术的态度与接受度
01
公众认知度提高
随着基因编辑技术的普及和宣传 ，公众对基因编辑技术的认知将 逐渐提高。
基因编辑技术的发展历程
基因编辑技术的发展经历了早期的基因敲除技术、ZFNs（锌指核酸酶）和 TALENs（转录激活因子样效应物核酸酶）等阶段，直到近年来CRISPR-Cas9系 统的出现，使得基因编辑技术取得了突破性的进展。
02
伦理和法律监管
随着基因编辑技术的发展，伦理 和法律监管将逐渐加强，确保技 术的安全和合理应用。
03
社会接受度逐渐提 高
随着技术的成熟和应用的广泛， 社会对基因编辑技
基因编辑技术的基本原理
介绍了CRISPR-Cas9系统的工作机制，以及基因编辑过程中的关 键步骤。
生物多样性
基因编辑技术可能对生物多样性产生威胁，因为 它可能导致基因库的单一性和脆弱性增加。
法规与监管
法规缺失
目前全球范围内对于基因编辑技 术的监管还存在一定的空白和不 确定性。
监管难度
由于基因编辑技术的复杂性和快 速变化，监管机构面临着监管难 度和挑战。
国际合作
加强国际合作和交流，共同制定 和完善基因编辑技术的法规和监 管体系，以确保技术的安全可控 发展。
在医学领域的应用前景
遗传性疾病的治疗
基因编辑技术有望治愈一些遗传性疾病，如囊性 纤维化、血友病等。
癌症治疗
通过编辑癌症细胞的基因，实现精准治疗和个性 化治疗。
罕见病治疗
针对罕见病患者，基因编辑技术有望提供有效的 治疗方案。
社会对基因编辑技术的态度与接受度
01
公众认知度提高
随着基因编辑技术的普及和宣传 ，公众对基因编辑技术的认知将 逐渐提高。
《基因编辑新技术》课件
• 基因疾病的治疗 • - 临床案例：ADA - S C ID • 癌症治疗方案 • - CA R - T细胞治疗 • - 基因修复及监测
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基因编辑在生物制造产业的应用
• 基因编辑在农业领域的应用 • 合成细胞的设计 • 其他应用
基因编辑伦理和风险
• 伦理问题 • - 人类胚胎基因编辑 • - 基因编辑后代问题 • 风险控制 • - 安全性问题 • - 环境问题 • 国际规范和政策
《基因编辑新技术》PPT课件
# 基因编辑新技术 ## 简介 1. 什么是基因编辑技术？ 2. 基因编辑技术的发展历程 3. 基因编辑技术的应用前景
基因编辑原理
• 基本原理 • 基因编辑方法 • - TA LEN • - CRISPR-Cas9 • - ZFN • 基因编辑过程介绍
基因编辑在医学上的应用
结论
• 基因编辑技术的优缺点 • 未来展望
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
基因编辑在生物制造产业的应用
• 基因编辑在农业领域的应用 • 合成细胞的设计 • 其他应用
基因编辑伦理和风险
• 伦理问题 • - 人类胚胎基因编辑 • - 基因编辑后代问题 • 风险控制 • - 安全性问题 • - 环境问题 • 国际规范和政策
《基因编辑新技术》PPT课件
# 基因编辑新技术 ## 简介 1. 什么是基因编辑技术？ 2. 基因编辑技术的发展历程 3. 基因编辑技术的应用前景
基因编辑原理
• 基本原理 • 基因编辑方法 • - TA LEN • - CRISPR-Cas9 • - ZFN • 基因编辑过程介绍
基因编辑在医学上的应用
结论
• 基因编辑技术的优缺点 • 未来展望
crisprcas基因编辑技术原理与应用ppt课件
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
应用
Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞 操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是 CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。
目录
CRISPR/Cas基因编辑技术
发现 原理 应用 优点 缺点 发展 前景
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
发现
在1987年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不 足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现 了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复 核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚 不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在 为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。2000年，相似的重复序列在其 它真细菌和古细菌中被发现并被命名为短间隔重复序列（Short Regularly
What
01
Clustered regularly interspaced
shortpalindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-
associated (Cas) systems
（常间回文重复序列丛集关联蛋白系统）
CRISPR表示成簇的规律间隔的短回文重复序列， 02 而Cas是一种和CRISPR系统相关联的蛋白质、
应用
基因打靶技术在基因功能研究中的应用、研制人类疾病动物 模型、改良动物品系和研制动物反应器等。
基因编辑技术在医学研究中的应用培训课件
全。
拓展应用领域
基因编辑技术有望在更多医学领 域得到应用，如罕见病治疗、器
官移植等。
国际合作与交流
全球范围内的科研机构和企业将 加强合作，共同推动基因编辑技
术的发展和应用。
战略建议提
01
加强技术安全性研究
加大对基因编辑技术安全性研究 的投入，确保技术的安全可控。
03
推动法规政策制定
积极参与国际法规政策的制定和 修订，为基因编辑技术的发展和
经过严格的临床试验和监管审批流程，确 保基因疗法药物的安全性和有效性得到科 学验证和官方认可。
下一代测序技术在药物研发中应用前景
精准医学与个体化治疗
通过下一代测序技术，对患者基因组进 行深度测序和分析，实现精准医学和个
体化治疗策略的制定。
药物基因组学研究
通过测序技术分析药物在基因组水平 上的作用机制和个体差异，为药物研
01
罕见病基因突变分析
利用基因编辑技术对罕见病患者进行基因突变分析，为精准治疗提供依
据。
02
基因编辑技术在复杂疾病中的应用
针对复杂疾病的多个致病基因，利用基因编辑技术进行多靶点治疗，提
高治疗效果。
03
个性化治疗方案设计
根据患者基因突变情况，制定个性化的治疗方案，提高治疗的针对性和
有效性。
04
生物制药产业中基因编辑技术创 新发展动态
细胞治疗产品开发流程简介
细胞来源与选择
根据治疗需求，选择合适的细胞类型，如干细胞 、免疫细胞等。
细胞修饰与改造
利用基因编辑技术，对细胞进行基因修饰或改造 ，以增强其治疗效果或降低副作用。
ABCD
细胞培养与扩增
在体外环境下，对细胞进行培养、扩增，以获得 足够数量的治疗用细胞。
拓展应用领域
基因编辑技术有望在更多医学领 域得到应用，如罕见病治疗、器
官移植等。
国际合作与交流
全球范围内的科研机构和企业将 加强合作，共同推动基因编辑技
术的发展和应用。
战略建议提
01
加强技术安全性研究
加大对基因编辑技术安全性研究 的投入，确保技术的安全可控。
03
推动法规政策制定
积极参与国际法规政策的制定和 修订，为基因编辑技术的发展和
经过严格的临床试验和监管审批流程，确 保基因疗法药物的安全性和有效性得到科 学验证和官方认可。
下一代测序技术在药物研发中应用前景
精准医学与个体化治疗
通过下一代测序技术，对患者基因组进 行深度测序和分析，实现精准医学和个
体化治疗策略的制定。
药物基因组学研究
通过测序技术分析药物在基因组水平 上的作用机制和个体差异，为药物研
01
罕见病基因突变分析
利用基因编辑技术对罕见病患者进行基因突变分析，为精准治疗提供依
据。
02
基因编辑技术在复杂疾病中的应用
针对复杂疾病的多个致病基因，利用基因编辑技术进行多靶点治疗，提
高治疗效果。
03
个性化治疗方案设计
根据患者基因突变情况，制定个性化的治疗方案，提高治疗的针对性和
有效性。
04
生物制药产业中基因编辑技术创 新发展动态
细胞治疗产品开发流程简介
细胞来源与选择
根据治疗需求，选择合适的细胞类型，如干细胞 、免疫细胞等。
细胞修饰与改造
利用基因编辑技术，对细胞进行基因修饰或改造 ，以增强其治疗效果或降低副作用。
ABCD
细胞培养与扩增
在体外环境下，对细胞进行培养、扩增，以获得 足够数量的治疗用细胞。
基因编辑技术比较CRISPR Cas9,casF,Cpf1 ppt
CRISPR-CPf1作用原理
cas9 / casF /cpF1总结
Part.4
Cpf1/Cas9比较
Cas9/ casF / Cpf1总结
谢谢观看
CRISPR：
CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中 的特殊DNA重复序列家族，是成簇的规律间隔的短 回文重复序列。右图展示了完整的CRISPR位点的结 构。
CRISPR/cas9基因编辑原理
主要内容
crRNA ( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activatingRNA )结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。
CRISPR/cas9、casF、Cpf1 基因编辑技术
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
➢ 1. CRISPR/cas9基因编辑技术 ➢ 2. CRISPR/casF基因编辑技术 ➢ 3. CRISPR/cpF1基因编辑技术 ➢ 4. cas9 / casF /cpF1总结
CRISPR/cas9的基本原理
Part.1
CRISPR/cas9基因编辑原理
CRISPR/casF基因编辑技术
Part.2
CRISPR/ casF基因编辑技术
原理： casF能切割与crRNA互补的DNA，并且使用单个RuvC活 性位点进行pre-crRNA加工和切割。 casF分子量：cas9蛋白的一半 Cas蛋白结构域:HNH、RuvC 向导RNA：crRNA pre-crRNA加工方式：casF蛋白加工 DNA识别区：富含T的PAM 序列（5′TBN 3′，B是G、T或C） 优点：分子量小、对PAM区要求低，有利于基于载体向细胞内 递送和更广泛的可靶向基因组序列范围
《crisprcas9技术》课件
CRISPR-Cas9的应用
基因组编辑及修补
CRISPR-Cas9技术可以精确的定位基因组中特定位点 进行编辑和修补，是医学、农业、工业等领域中重 要的基因体系。
基因靶向表达
利用CRISPR-Cas9技术的靶向控制基因表达可以实现 治疗疾病、生产有用生物制品等应用。
基因调控
CRISPR-Cas9技术可选择性、有 Nhomakorabea地进行基因调控，
应用前景
• CRISPR-Cas9技术未来将 广泛用于医疗、农业、 工业、环保等领域，成 为生物技术创新的重要
• 推基动于C力R。ISPR-Cas9技术的 新产品、新技术、新应 用也将成为未来投资的 热点领域。
2
编辑系统的工作原理
CRISPR-Cas9通过识别、结合、切割目标基因位点，进一步实现对基因组的编辑 和修补，使基因组发生特定改变，达到治疗或改良目的。
3
PAM序列的特点
PAM序列指的是Cas9靶序列的附近序列，是单导RNA结合Cas9蛋白并定位于靶点 上的关键信息之一，其特点包括长度和序列的多样性。
农业遗传改良
利用CRISPR-Cas9技术对商业作物进行精准改良是未
CRISPR-Cas9技术的局限和挑战
1 异源物质的干扰
2 细胞外的嵌合酶
CRISPR-Cas9技术会受到外部异源物质的干扰， 影响其在目标细胞内的有效性。
CRISPR-Cas9技术需要有效的嵌合酶才能达到 预期效果，因此嵌合酶的研究一直是制约该 技术发展的瓶颈之一。
应用领域
CRISPR-Cas9技术已广泛应用于基因组编辑、基因表达调控、疾病治疗和药物筛选等领域，且 应用前景广阔。
CRISPR-Cas9系统的构成和原理
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5ˊ-G
AATTC-3ˊ
3ˊ-CTTAA +
G-5ˊ
3ˊ突出黏性末端(PstⅠ)：Leabharlann 5ˊ-CTGCA↓G-3ˊ
5ˊ-CTGCA
G-3ˊ
3ˊ-G↑ACGTC-5ˊ
3ˊ-G
+ ACGTC-5ˊ
平端缺口（钝性末端）( SmaⅠ）
5ˊ-CCC↓GGG-3ˊ 3ˊ-GGG↑CCC-5ˊ
5ˊ-CCC 3ˊ-GGG
是感染细菌的一类病毒 ，寄生于细菌中，并能溶解 细菌细胞，故称噬菌体。
26
噬 菌 体 生 活 周 期
27
28
3、酵母 酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。
4、病毒
29
第五节 重组DNA技术
30
基本步骤
目的基因的获取
↓
克隆载体的选择
↓
目的基因与载体 连接成重组DNA
↓
重组DNA导入受体菌
2.来源：原核生物
11
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。
Ⅰ型酶、Ⅲ型酶： 具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没
有多大的实用价值。
Ⅱ型酶： 应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切
割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
12
4.识别和切割位点：
↓
重组体的筛选
↓
克隆基因的表达 31
1、 制备目的基因
（1）化学合成： 已知目的基因的核苷酸序列或根据基因产物的氨基酸序
列推导出相应基因DNA碱基序列。 目前使用DNA合成仪合成的片段长度有限，一般用于小
CELLECTIS S.A. NASDAQ
1
2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功
2
基因组编辑技术简介
Genome Editing
3
2015.11.22 HuangCH @ J208
修改遗传信息的第一步： 按我们的设计来重组DNA
4
第一节 基 本 概 念
5
重组DNA技术：
是指在基因水平上，将目 的DNA在体外重组于能自我复制 的载体DNA分子上，然后将重组 DNA导入宿主细胞中进行增生， 以获得大量的目的DNA片段，或 以此为基础，通过基因的诱导 表达，得到大量相应蛋白质产 物的过程。
识别位点：即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列 。
通常是4～8个碱基对、具有回文序列的DNA片段 5’ – G A A T T C - 3’ 3’ – C T T A A G - 5’
13
① 5`突出粘性末端 ② 3`突出粘性末端 ③ 平头（钝性末端）
14
5ˊ突出黏性末端(EcoRⅠ)：
5ˊ-G↓AATTC-3ˊ 3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ
又称为分子克隆技术或基 因工程技术
6
第二节 重组DNA技术的发展史
7
基因工程的诞生
1、Berg的开创性实验－第一个实现DNA重组 猴病毒SV40的DNA+λ噬菌体的DNA
1980年Nobel化学奖
2、Boyer-Cohen实验－第一个取得基因工程成功 1973年构建双重抗药性重组质粒 1973年是基因工程诞生的元年
17
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。 （1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身
连接，提高重组效率。 碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸 酶（CIP）。CIP能在 1% SDS溶液中68 ℃加热15 min而 失活，故CIP较为常用。
18
5、末端转移酶 催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。
6、T4多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。 用途：⑴放射性标记DNA的5`端
⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。 7、S1核酸酶
单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。
24
pBR322质粒载体 ①相对分子质量小，长度为4.3kb。 ②含有氨苄青霉素和四环素的抗性 基因(Ampr和Tetr)。 ③有24种限制性内切酶位点。 ④有一个复制起始点（ori）及与 DNA复制有关的序列，赋予该质粒 复制子特性。 ⑤为松弛型复制子。
25
2、噬菌体（bacteriophage,phage)
P-AATTCGT OH-GCA
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
16
3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外 切酶活性。
可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序 列分析等。
耐热DNA聚合酶 最适反应温度为75～80℃ 具有5ˊ→3ˊ外切酶活性，不具有3ˊ→5ˊ外切酶活性
克隆位 点，MCS）。
5、具有较高的遗传稳定性。
22
3、常用载体 质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋 予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一 的限制酶切点等。
23
1、质粒（plasmid）: 质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定 遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的 DNA分子。
8
第三节 工具酶
9
1、 “基因剪刀”－限制性核酸内切酶
Werner Arber 理论预见限制酶
Hamilton O. Smith Daniel Nathans 得到第一个限制酶 用限制酶切得
SV40 DNA片断
1978年Nobel生理或医学奖
10
1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并 在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核 酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶）。
19
第四节 重组DNA技术常用载体
20
一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的 一类DNA分子。
分类： 克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外
源DNA片段。 表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因
表达产物。
21
二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多
+
GGG-3ˊ CCC-5ˊ
切割方式：对dsDNA 2条链同时切割产生3种不同缺口
15
2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成 3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。
大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不 但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
ACG-OH TACTTAA-P