基因编辑技术和原理 ppt课件

成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点,
在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并
启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的
CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)
2020/12/27
2
基因编辑的研究背景
• 传统的动物育种方法受到种源的限制， 其程需要耗费大量的人力、物力和财力，经 历漫长的培育过程。而且不同种间的杂交很 困难，育种成果很难取得突破性进展。
2020/12/27
3
基因编辑原理
•
现代基因组编辑技术的基本原理是
相同的，即借助特异性 DNA 双链断裂激
2020/12/27
6
基因编辑原理
2020/12/27
7
基因编辑技术的种类
目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为： 人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)
技术； 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like
链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同
的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一
般为12~20 bp. 实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个
碱基为 T 时其结合效果更佳。
2020/12/27
13
3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
9
ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成 的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂 (DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末 端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位 点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变 或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
• 目前， TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植
物的位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有 较大的应用优势， 但仍然有些问题需要解决，例如:脱 靶效应、TALEN 与基因组进行特异结合与染色体位置 及邻近序列有关等。
2020/12/27
14
• 1987年，Ishino 等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因
附近发现串联间隔重复序列，随后发现这种间隔重复 序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。经过几十 年的研究，在2007年终于证明这种重复序列与细菌获
CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转
录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形
2020/12/27
12
TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE
array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶
标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 FokⅠ形
成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双
活细胞天然的修复机制，包括非同源末
端连接和同源重组修复 两条途径。
2020/12/27
4
• 1.非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修 复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随
机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的
基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ
机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的
基因编辑技术和原理
2020/12/27
1
什么是基因编辑技术？
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技 术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点 上， 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片 段。此过程既模拟了基因的自然突变， 又修改并编辑 了原有的基因组， 真正达成了“编辑基因”。
effector nucleases，TALEN)技术； RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(CRISPR- Cas 9）。
2020/12/27
8
1. ZFN 基因组编辑技术
• ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具
有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年
2020/12/27
11
2. TALEN 基因组编辑技术
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中 发现一种转录激活子样效应因子，它的蛋白核酸结合域的氨 基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。随后 ，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的 锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比 ZFN 更广阔的应用潜力。
Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现
了Cys2- His2锌指模块，到1996年，Kim等首次人工连接了锌
指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指
连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN
在基因组编辑中的应用。
2020/12/27
2020/12/27
10
• ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位
点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷 制约了该技术的推广:(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表 达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异 性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。
基因敲入。
（ 移码突变：在正常DNA分子中，碱 基缺失或增加3的倍数，造成这位置之后
的一系列编码发生移位错误的改变，这 种现象称移码突变。）
2020/12/27
5
• 2. 同源重组修复（HR） 是一种相对高保真度的修 复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下 ，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的 整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。如 果在一个基因两侧同时产生DSB，在一个同源供体存在 的情况下，可以进行原基因的替换。