第三代基因编辑技术CRISPRCas9.
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享在现代生物学研究中，基因编辑技术的出现为研究人员提供了一种高效、精确、低成本的方式来研究基因功能和调控机制。
CRISPR-Cas9系统作为一种革命性的基因编辑工具被广泛应用于基因组编辑、疾病治疗和农业改良等领域。
本文将为您介绍CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程，并分享一些最佳实践。
CRISPR-Cas9基因编辑技术概述CRISPR-Cas9是一种依靠细菌天然的免疫机制发展而来的基因编辑技术。
CRISPR是一种特殊的DNA序列，可与Cas9酶一起，通过识别和切割DNA序列来精确编辑基因组。
CRISPR-Cas9系统的主要组成部分包括CRISPR RNA （crRNA）、转录单元结构化RNA（tracrRNA）和Cas9酶。
crRNA负责识别目标DNA序列，而tracrRNA将crRNA与Cas9酶结合起来形成活跃的CRISPR-Cas9复合物。
CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程1. 设计并合成RNA引导序列在使用CRISPR-Cas9进行基因编辑之前，首先需要设计并合成RNA引导序列。
该序列用于指导Cas9酶精确识别和切割目标基因组DNA。
合成的RNA引导序列通常由crRNA和tracrRNA合成而成，也可以合成一个融合的single-guide RNA （sgRNA）。
2. 构建CRISPR-Cas9载体CRISPR-Cas9基因编辑需要将Cas9酶和RNA引导序列导入目标细胞内。
可使用载体如质粒或病毒进行基因编辑构建。
选择合适的载体需考虑目标细胞类型、转染效率和所需编辑范围等因素。
将Cas9基因和RNA引导序列克隆至载体后，可通过转染或病毒介导转染等方法将其导入目标细胞。
3. 确定编辑效果在导入CRISPR-Cas9系统后，使用分子生物学方法来验证编辑效果。
例如，PCR、测序、Western blot或免疫组化等技术可以用于检测目标基因的突变、修复或敲除效果。
CRISPR Cas9基因编辑技术的局限性与未来发展方向
CRISPR Cas9基因编辑技术的局限性与未来发展方向CRISPR Cas9基因编辑技术是近年来备受关注的生物技术之一。
通过此技术，科学家们可以直接随意地编辑组成人或动物基因组的DNA序列，实现精确的基因编辑。
这种技术的优点是显而易见的，它可以帮助人们修改人类和动物细胞中的基因，从而创造出新的，更优化的特性。
这也使得它在医学上具有广泛的应用前景，如治疗基因缺陷和疾病、改善农作物和家畜的生长等。
然而，尽管这种技术有许多优点，但在使用过程中还是存在一些局限性，包括以下几个方面。
1. 编辑效率不一致CRISPR Cas9技术可能会在基因组中引入意外的突变，导致难以预测的副作用。
此外，它的编辑效率也会受到各种因素的影响，如某些细胞类型和DNA序列特异性等。
这就意味着这种技术不能够百分之百地创造出精确的结果。
2. 缺乏选择性这种基因编辑技术的目的是将指定的DNA序列删除或更改，但与此同时也会影响到其他基因。
因此，CRISPR Cas9技术的缺乏选择性在一定程度上会限制其应用范围。
3. 风险基因编辑技术和其引发的副作用可能会对生命产生潜在的风险。
这意味着要仔细考虑和评估基因编辑技术的安全性，避免其对个人和环境产生负面影响。
虽然存在这些局限性，但是CRISPR Cas9技术依然有着许多应用的前景，而科学家们正在寻找解决方案以克服这些局限性。
1. 提高编辑效率科学家正在寻求方法以提高CRISPR Cas9技术的编辑效率，其中包括优化Cas9酶的等离子体形态和更改RNA引导序列的长度和序列，以提高此技术的编辑效率和准确性。
2. 更优化的选择性为了解决选择性差的问题，科学家们正在研究CRISPR Cas9技术的内在机制，以创造新型的Cas9酶，使CFISPR Cas9技术更容易地将基因编辑技术应用于特定的DNA序列。
3. 提高安全性通过对新型基因编辑技术的更好了解，科学家了解了如何评估CRISPR Cas9技术的安全性，并探索如何改进和完善已有的标准，以确保人们和社会能够更好地理解和使用它。
基因组编辑方法
基因组编辑方法
基因组编辑，又称基因编辑（gene editing），是指一种通过删除、插入或替换基因组的某个片段或特定碱基使基因组发生特定变化的分子技术。
基因组编辑技术主要包括以下几种方法：
- 第三代基因编辑技术：CRISPR-Cas9，这种技术能以极其简单的方式对基因进行精准操作——编辑。
- TALEN 技术：这是一种依靠 TALEN 蛋白对基因组进行编辑的方法。
TALEN 蛋白由一对核酸酶和一对与目的 DNA 序列互补的核酸组成，可以在特定的位置切断 DNA 双链，并进行基因编辑。
- ZFN 技术：ZFN 是一种由一对锌指核酸酶和一段与目的 DNA 序列互补的寡核苷酸组成的基因编辑工具。
ZFN 可以特异性地识别并结合到目的 DNA 序列上，然后在锌指核酸酶的催化下切断 DNA 双链，实现基因编辑。
利用基因组编辑技术，可以精确地定位到基因组上的某一个位点，在这个位点上剪断目的DNA片段，插入新的DNA片段，从而使特定位点基因序列发生突变，实现对DNA序列的遗传改造操作。
CRISPRCas9基因编辑技术综述
CRISPR/Cas9基因编辑技术综述作者：钦越陈志杨章平来源：《河南农业·教育版》2021年第07期摘要：CRISPR/Cas9首次在细菌中被发现，是适应性免疫系统的一部分，现已广泛用于工程改造基因组中激活或抑制基因表达。
同时，CRISPR/Cas9有望通过提供一种有效的技术来剖析癌症发生的机制，确定药物开发的靶标，并可能为基于细胞的疗法提供支撑以加速癌症的研究。
对CRISPR/Cas9技术的发展历史和应用范围做了概述及展望，以期为CRISPR/Cas9技术的后续发展提供思路。
关键词：CRISPR/Cas9;基因编辑;哺乳动物长期以来，基因疗法一直被寄予希望可以治疗或纠正人和动物体内的各种疾病和缺陷。
随着簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的发现、基于CRISPR的原核生物适应性免疫系统（CRISPR相关系统，Cas）的机制以及它的再利用成为一种有效的基因编辑工具，使得分子生物学领域发生了革命性的变化，并激发了人们对新的和改进的基因治疗的兴趣。
CRISPR/Cas9（规律性成簇间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）系统是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，是现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低的技术之一，已成为当今最主流的基因编辑系统。
一、CRISPR/Cas9系统的起源1987年，日本科学家在研究大肠杆菌的时候发现其基因组上有一段29bp的序列反复出现了数次且彼此之间被一段 32bp的序列所隔开。
1993年，西班牙科学家Francisco Mojica在地中海噬盐菌中也同样发现了这段重复序列。
随着后续的研究，他在二十多种不同的微生物体内都发现了这种重复DNA结构，并将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。
基因编辑技术CRISPRCas9的操作指南与注意事项
基因编辑技术CRISPRCas9的操作指南与注意事项基因编辑技术是一种能够修改生物体基因组DNA序列的高效方法，它为生物学研究、疾病治疗和农业改良等领域带来了突破性的进展。
其中一项重要的基因编辑技术就是CRISPR-Cas9系统，它是目前最常用且最受欢迎的基因编辑工具之一。
本文将为您介绍CRISPR-Cas9的操作指南与注意事项。
CRISPR-Cas9是一种借鉴自细菌免疫系统的基因编辑工具，它通过特定的引导RNA（gRNA）和Cas9酶来实现基因组的精确编辑。
下面将详细介绍使用CRISPR-Cas9进行基因编辑的操作指南与注意事项。
1. 设计gRNA在使用CRISPR-Cas9之前，首先需要设计合适的gRNA。
gRNA是由20个碱基的引导序列和一个PAM序列组成，它能够识别需要编辑的基因组DNA序列。
设计gRNA时，需要遵循以下几点：- 选择目标位点：选择一个适当的目标位点，最好是在外显子区域或有功能影响的区域。
- 避免副作用：避免选择存在副作用的位点，如可能引发多个剪切位点或产生错配修复机制引起的小片段插入或删除。
- 考虑gRNA的特性：gRNA应具有足够的特异性和高效率的结合能力。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白一旦设计好了gRNA，就可以进行gRNA和Cas9蛋白的合成。
这可以通过基因合成技术或购买合成的gRNA和Cas9蛋白完成。
确保在实验进行前将它们充分储存和离心，以保证其质量和纯度。
3. 转染将gRNA和Cas9蛋白转染入要编辑的细胞中，通常可以选择化学转染、电转染或病毒转染等方法。
选择适当的转染方法取决于您的实验目的和细胞类型。
4. 验证突变编辑后的细胞需要进一步验证是否成功进行了基因编辑。
最常用的验证方法是利用Polymerase Chain Reaction（PCR）分析、Western blotting或Sanger测序等技术检查目标DNA是否发生了预期的突变。
确保验证过程的准确性和可靠性。
基因编辑技术CRISPR Cas9及其是与非的思考
基因编辑技术CRISPR/Cas9及其“是与非”的思考摘要：基因编辑技术是一种可以体外对目标基因进行修改的技术，其在基因功能研究、基因治疗及遗传改良方面显示出了巨大优势。
近期，运用CRISPR/Cas9技术修饰人类胚胎以及基因编辑婴儿的出现，引发了学术界和社会大众强烈反响。
本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术及其涉及的相关论文问题进行了阐述，并提出了笔者对该事件的思考。
关键词：基因编辑技术；基因编辑婴儿；CCR5突变；伦理道德1 基因编辑技术及其原理基因编辑（gene editing）技术是分子生物领域一直以来研究的焦点问题。
较早出现的基因编辑技术有重组锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）技术与转录激活因子样效应蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技术[1, 2]。
这两种技术均可以对基因组进行定点修饰的基因编辑技术，可精确地定位到基因组的某一位点上并剪断靶标DNA片段从而插入新的基因片段，同时模拟了基因的自然突变，从而达到了对原基因组的修改、编辑。
因此，该项技术在基因功能研究、基因治疗以及遗传改良等方面展示出的巨大的潜力成功地引起了研究者们的关注。
早在1987年，日本科学家在大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）K12的iap 附近发现串联间隔重复序列，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。
2005年，三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关。
近年来，出现了第三代新型的基因编辑技术，RNA引导的成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPER）及其相关（CRISPR associated）核酸酶技术，简称为CRISPR/Cas，其中CRISPR/Cas9是目前研究最为深入的基因编辑系统。
CRISPRCas9
crispr/cas9CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。
CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。
原理此系统的工作原理是crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。
而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA )，足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。
作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。
将蛋白与无核酸酶的Cas9( Cas9 nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。
因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
应用基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。
但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。
即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。
2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。
第三代基因编辑技术CRISPRCas9
2002 该结构被正式定义为成簇、
规律间隔短回文重复序列（CRISPR）
2005 三个研究小组均发现
CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿 主菌的染色体外的遗传物质高度同 源
2007 Barrangou 等首次发现并
证明细菌可能利用CRSPR系统对抗噬 菌体入侵。
2013 Zhang 研究组首次在人
293T细胞与小鼠Nero2A细胞中利 用 Crispr/Cas9系统实现了基因定点突变。
II型CRISPR免疫
II型CRISPR免疫
CRISPR系统结构
Crispr/Cas9系统核心：Cas9核 酸酶、sgRNA
(间隔相邻基序)
Cas9切割后的DNA修复
Proteins containing DNA-binding domains that recognize specific DNA sequences down to the base pair
Difficult: -Need a customized protein for each gene sequence -Low delivery efficiency
33
不限
/E-CRISP/index.html
33
23-5000
/crispr
23
不限
https:///indn/submit
Phase I
PD-1 Knockout T Cells
August Phase I PD-1 Knockout T
11, 2016
Cells
新型疗法
不良反应： 细胞因子释放综合征
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T） 基因编辑技术应用在 CAR-T 上的成功案例： Cellectis 公司UCART19
第三代基因编辑技术CRISPRCas9解析
新型疗法
不良反应： 细胞因子释放综合征
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）
基因编辑技术应用在 CAR-T 上的成功案例： Cellectis 公司UCART19
新型疗法
降低排异反应
TCR α
UCART19+TALEN
CD52
使细胞对阿仑单抗耐药，用于 CAR-T细胞筛选，提高筛选效率 和疗效
RQR8
CRISPR-P
CHOPCHOP GT-Scan
33
23 28
23-5000
不限 不限
/crispr
https:///index.php .au/gt-scan/submit
可增加细胞对利妥昔单抗的敏感性 降低副作用率，保证安全性
新型疗法
CRISPR /Cas9
CAR-T
2.0 Ver CAR-T
发展机会： 1. 具备 CRISPR 技术储备 2. 临床研究经验丰富
&
&
3. 靶点储备丰富 4. 免疫细胞储备
Thanks！
2016.8.27
CRISPR/Cas
(gRNA-Cas9): DNA 20nt crRNA (CRISPR RNA) fused to a tracrRNA and Cas9 endonuclease that recognize specific sequences to the base pair Easy: - all-in-one gRNA-Cas9 vector system - multi gene editing is feasible Mali et al., 2013 Cong et al., 2013 Jiang et al., 2015
基因组编辑技术CRISPRCas9原理及应用
基因组编辑技术CRISPRCas9原理及应用CRISPR-Cas9基因组编辑技术：原理、应用与前景引言：近年来，CRISPR-Cas9基因组编辑技术引起了广泛的关注，并被誉为“基因编辑的革命”。
由于其高效、精准、廉价、简便等特点，CRISPR-Cas9已被广泛应用于生命科学研究、疾病治疗、农业改良和生物制药等领域。
本文将首先介绍CRISPR-Cas9的原理，然后探讨其在不同领域的应用，并展望其未来发展前景。
一、CRISPR-Cas9基因组编辑技术的原理：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种常见于细菌和古菌的基因组中存在的一类短重复序列，它们的间隔区域（spacers）存在与外源侵略元素（例如噬菌体、质粒）的序列（protospacers）相对应的片段。
CRISPR系统通过将外源侵略元素的DNA序列整合到自身基因组中，形成新的spacer，从而构建了一种免疫记忆系统。
Cas9是一种细菌来源的蛋白质，具有剪切DNA双链的能力。
当发生外源侵袭时，CRISPR系统将受到侵略元素的DNA序列转录成非编码的crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA），以及一个编码Cas9的mRNA。
这些RNA分子最终会结合形成成熟的gRNA （guide RNA），并与Cas9蛋白质形成复合体。
gRNA通过与目标DNA序列的互补配对，引导Cas9蛋白质与目标DNA序列结合，并且Cas9蛋白质的核酸酶活性将目标DNA双链切割成两段。
二、CRISPR-Cas9技术在生命科学研究中的应用：1.基因功能研究：通过CRISPR-Cas9技术，可以有效地靶向特定基因的编码区域进行敲除、靶向特定位点进行基因突变，从而揭示基因在生物系统中的功能和调控机制。
这种基因编辑技术的高效性和精确性，使得科学家们能够更加准确地研究基因与表型之间的关联，有助于解析复杂疾病的发病机制。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Reference
Crispr/Cas9 研究历史
1987
Ishino Y等在K12大 肠杆菌的碱性磷酸酶 基因附近发 现串联间隔重复序列
2002
该结构被正式定义为成簇、 规律间隔短回文重复序列（CRISPR）
2005
三个研究小组均发现 CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿 主菌的染色体外的遗传物质高度同 源
Cardiovascular Disease
Viral Diseases
Crispr系统应用
Wenhui Hu, et al. PNAS. 2014, 111(31):11461-6 CRISPR/Cas9 基因编辑技术能够有效利用其 sgRNAs 靶向作用于 HIV-1 原病毒 LTR(长末端重复序列) 区，对 HIV-1 原病毒进行有效 清除。在感染 HIV-1 的细胞中使用携带 2 个 sgRNAs
Easy: - all-in-one gRNA-Cas9 vector system - multi gene editing is feasible Mali et al., 2013 Cong et al., 2013 Jiang et al., 2015
Feasibility
Difficult: -Need a customized protein for each gene sequence -Low delivery efficiency Beerli et al., 1998 Perez-Pinera et al., 2012 Gaj et al., 2013 Moscou and Bogdanove, 2009 Boch et al., 2009 Gaj et al., 2013
基因编辑工具
ZFN
Target
Protein: DNA
TALEN
Protein: DNA
CRISPR/Cas
(gRNA-Cas9): DNA
Structure
Zinc finger DNA binding motifs in a ββα configuration, the α-helix recognizes 3 bp segments in DNA
CRISPR/Cas9 系统可以明显抑制病毒复制与再生效率。
Crispr系统应用
建立癌症模型
2015年，Zhang F与Phillip
A.Sharp团队构建了一个包含癌细胞系。将处理后的细胞接种
于免疫缺陷小鼠后，小鼠出现了 明显的肿瘤转移表型。 Chen SD ,et al. Cell. 2015 March 12; 160(6): 1246–1260
Crispr系统应用
体外培养的人类正常肠道成体干 细胞中通过CRISPR/Cas 引入 4 个结肠癌基因突变(APC、P53、
KRAS和SMAD4), 建立结直肠癌
类器官模型
Matano M, et al. Nat Med, 2015, 21(3):256–262.
Proteins containing DNA-binding domains that recognize specific DNA sequences down to the base pair
20nt crRNA (CRISPR RNA) fused to a tracrRNA and Cas9 endonuclease that recognize specific sequences to the base pair
(间隔相邻基序)
Cas9切割后的DNA修复
编辑效率检测
T7E1 Assays
sgRNA设计
功能
物种数 15 9
最大输入长度（nt） 23-500 不限
网址 /ZiFiT
CRISPR Design ZiFiT
设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估 脱靶效应评估 设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估 设计/脱靶效 应评估
Cas9 Design
Cas-OFFinder E-CRISP CRISPR-P
10
25 33 33
不限
15-25 不限 23-5000
/cas-offinder /E-CRISP/index.html /crispr
CHOPCHOP
GT-Scan
23
专题内容
第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9
基因编辑技术
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术, 可以 精确地定位到基因组的某一位点, 并剪断靶标DNA片段
并插入新的基因片段
基因编辑工具
锌指核酸内切酶（ZFN）
类转录激活因子效应物核酸 酶（TALEN）
成簇、规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9 Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9（CRISPR/Cas9）
28
不限
不限
https:///index.php
http://gt-sቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ.au/gt-scan/submit
基因编辑流程
T7E1
Crispr系统应用
Cancer Genetic Diseases HIV
Immunodeficiency
2007
Barrangou 等首次发现并 证明细菌可能利用CRSPR系统对抗噬 菌体入侵。
2013
Zhang 研究组首次在人 293T细胞与小鼠Nero2A细胞中利 用 Crispr/Cas9系统实现了基因定点突变。
II型CRISPR免疫
II型CRISPR免疫
CRISPR系统结构
Crispr/Cas9系统核心：Cas9核 酸酶、sgRNA