2013年生物下游加工过程
微生物工程下游加工工程
产物保存的方法与技术
冷藏保存
将产物保存在低温条件下，抑制微生 物的生长和酶的活性，延长保存时间。
冷冻保存
将产物保存在极低温度下，使产物中 的水分子形成冰晶，延缓化学反应和 生物代谢，延长保存时间。
真空保存
在真空环境下，降低氧气的含量，抑 制微生物的生长和酶的活性，延长保 存时间。
通过过滤介质将细胞和培养液 分离，达到产物浓缩的目的。
超滤法
利用膜的截留作用，使小分子 物质透过膜而大分子物质被截 留，从而实现产物的浓缩。
沉淀法
通过加入沉淀剂使产物从溶液 中析出，达到浓缩的目的。
结晶原理与技术
结晶原理
通过降低溶液的过饱和度 或提高溶液的浓度，使溶 质从溶液中析出形成晶体。
结晶技术
目标产物的稳定性、提取剂的选择和用量、提取温度和时间等。
微生物发酵产物的分离纯化
分离纯化的方法包括
色谱法、电泳法、结晶法等。
分离纯化过程中需要考虑的因素包括
杂质的去除、产物的回收率和纯度、分离效率和成本等。
提取与分离技术的选择与优化
01
选择合适的提取与分离技术需要考虑目标产物的性质
、杂质的情况、产物的产量和纯度要求等因素。
02
技术优化可以通过实验设计、响应面分析等方法进行
，以找到最佳的工艺参数和操作条件。
03
技术优化可以提高产物的产量和纯度，降低生产成本
和提高经济效益。
03
微生物细胞破碎与产物释放
微生物细胞破碎的方法
01
02
03
机械破碎法
利用物理手段如高速搅拌、 超声波等破碎细胞壁，释 放细胞内物质。
生物技术下游加工过程的特点
生物技术下游加工过程的特点
生物技术下游加工是将单一生命现象转换为有效分子目标，以满足科技革新以
及业界发展的需要。
此过程依赖于生物技术范式、工艺流程和现代生物检测技术。
通过下游加工，利用多种酶、活性蛋白以及挑选性化合物，将生物学功能分子转变为有效的、立体的分子目标。
具体来说，生物技术下游加工经历四个基本阶段：初级处理、定量和定性分析、后处理和应用研究。
完整的下游处理，需要有针对不同生物材料的性能和特性进行精确测量，运用蛋白质、核酸分子以及小分子药物等多种技术，来实现各种分子转换。
由于下游加工和反应技术的进步，人们可以更加细致的开展个性化的研究，例
如转基因技术的改造，来改善物种性状，增强物种的抗病力、抗逆能力，有助于提高农作物产量、改善农作物质量。
另外，在制药方面，下游加工的发展相当迅速，妥善处理几聚体蛋白质，促进
体外发酵、受体拓展等，实现了药物研发过程从贝叶斯研究到分子靶标研究，扩大了传统化合物研发领域，这对高等教育普遍奠定了一种跨越式发展的理念，促进了新的科学 egieshen研究新的生态可持续发展的策略。
在总结中，生物技术下游加工是生物学功能分子从分子层次变为实现有效分子
目标的过程。
它仅靠生物技术范式、工艺流程及现代生物检测技术来实现，它的发展推动了个性化科学研究并促进了新的科学理念和生态可持续发展策略。
生物下游技术总结提纲
一、生物产品的特点：1、是产物浓度低的溶液原因：①细胞间接触抑制限制细胞量②产物对细胞有反馈抑制③培养条件限制氧传递2、培养环境组分复杂3、产物稳定性差：①产物易受物化条件影响发生化学降解②产物易受生物酶降解4、由于分批操作，细胞变异性大，使产物批间差异大。
5、产品用于食品与药物，对质量要求高。
二、生物工程下游加工一般工艺流程：1、预处理和固液分离该步对产物浓缩与质量改善不大，可选用操作有限。
①预处理：将悬浮液中与溶液浓度相近的细胞分离出来方法：加热、调pH、絮凝②固液分离：不溶物的去除方法：I、细胞移动：沉降、浮选II、溶液移动：过滤（上压力、下压力、错流过滤）III、离心IV、膜分离（不常用）此外，若目标产物为胞内产物，则需要：①细胞破壁：匀浆法、研磨法、酶解法②碎片分离：离心、双水相、膜分离2、提取（初步分离）该步去除与目标产物性质差异大的杂质，使产物浓度与质量显著提高。
其可选操作范围广：沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶、膜分离3、精制（高度纯化）该步去除与目标产物有类似化学功能和物理性质的杂质。
其可选操作要求对产物有高度选择性：重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离4、成品加工该步采用方法由产品最终用途要求决定，方法：浓缩、干燥、无菌过滤、成型等。
一、悬浮液预处理方法：根据可分离物质的性质选择处理方法：1、对热稳定性好的产品：加热作用：降低黏度，加速聚集以除杂。
要求：温度不宜过高，处理时间不宜过长。
2、利用产品不同的电离度与电荷性质：调节pH方法：加入草酸、无机盐或碱应用：等电点沉淀、膜过滤、絮凝3、根据产品在不同条件下分散状态的差异：凝聚与絮凝①凝聚：加入无机带电离子（如铁盐）中和胶粒电荷、胶体脱稳，胶粒聚集形成凝聚体。
②絮凝：加入天然或合成的大分子量聚电解质（如甲壳素或PAM）将胶粒交联成网形成絮凝团。
4、为防止滤孔阻塞使用惰性助滤剂。
如将硅藻土、石棉等预涂在滤布上或按一定比例与悬浮液混合后进行过滤，使混合颗粒形成格子型滤饼结构，方便清液通过。
(生化工程课件)下游加工过程概论
聚戊烯醇
n
OR
聚戊烯醇：R＝H，n＝10～20 聚戊烯醇乙酸酯：R=Ac,n=10～20
②“柚子全组分综合利用技术”项目
平和文旦柚
柚子果囊 果酒
柚子果皮
里层白皮
外层青皮
柚子叶
粒粒柚饮料
果胶
柚皮糖
柚皮苷 天然色素
③“枇杷全组分综合利用技术”项目
枇杷
枇杷叶
枇杷核
枇杷花
淀粉 三萜酸、苦杏仁苷、皂苷
膳食纤维
13.4 生物下游加工过程的一般步 聚
逆胶束示意图
1、胶束与反胶束的形成
正胶束
表面活性剂溶于水在水中聚集一起形成（正胶束）;极性基团 在外,非极性基团在内,溶解非极性物质; 将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时， 表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常 情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束 (normal micelle)。结构示意见图a。
13.6 非蛋白类杂质的去除
❖ （1） DNA
❖
A 阴离子交换（pH 4.0)
❖
B 亲和层析（不被吸附）
❖
C 疏水层析
❖ （2）热原 （蛋白质溶液中的去热原）
❖
A 生产过程无菌
❖
B 所有层析介质无菌
❖
C 所用溶液无菌
❖
D 亲和层析（多粘菌素）
❖ （3）去病毒
❖
A 加热 （60 C)
❖
B 过滤
❖
C 灭活剂
13.7 目标蛋白的表征和分析方法
❖ （1） HPLC ❖ （2） SDS-PAGE ❖ （3） 氨基酸顺序分析 ❖ （4） 氨基酸，肽图，免疫化学 ❖ （5） 与标准品对照分析
下游加工过程
下游加工过程：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的，动植物细胞组织培养的，酶反应等各种生物工业产生过程获得的生物原料，经提取分离，加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。
下游加工的一般步骤：1预处理和固液分离（目的：改变发酵液的性质，便于固液分离及提取）2提取（目的：除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件）3精制（目的：除去与产物的物理化学性质比较相近的杂质）4成品制作清洁生产：是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以减少对人类和环境的风险。
下游技术中的物理过程；1平衡分离过程，这种操作是建立在相平衡关系上的。
例如蒸发，蒸馏，干燥结晶等2拟平衡分离过程，在混合体系外加上一个能引起物质分离的势能场。
例如离心分离，电泳等3非平衡分离操作，利用物质移动速度差和广义的，基于屏蔽效应的分离操作。
例如超滤，反渗透膜等下游技术化学过程一化学性分子识别：1分子间相互作用2分子识别二化学反应。
例如柠檬酸工业中常用石灰乳与柠檬酸反应生成溶解度很低的柠檬酸该盐沉淀。
亲和色谱，手臂也就是连接担体和配体的隔离基，以便配体再结合蛋白质时不引起立体障碍。
如何改变发酵液特性：一降低液体粘度：降低粘度可以提高过滤速率，方法有加水稀释和加热等二调pH 三凝聚与絮凝凝聚：指在电解质的作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。
凝聚值越小，即凝聚能力越大絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。
四加入助滤剂五加入反应剂杂蛋白质的除去:沉淀法，变性法，吸附法过滤装置：1板框式过滤机2真空转鼓过滤机：四区：卸渣区，再生区，过滤区，洗涤吸干区。
细胞破碎率：1直接测定法即计数破碎前后细胞数。
2目的产物测定法即测定目的产物的释放量3导电率测点法分子萃取：相似相容原理：1分子结构相似2能量相似，在生物工业中，的对后一点考虑的主要是分子极性，介电常数越大，极性越大超临界流体：就是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点———临界点后的流体。
简述(或图示)生物下游加工过程的一般流程
生物技术的下游加工是指从生物来源净化和隔离所需产品所涉及的各个阶段。
这一过程对于药品、酶和其他有价值的生物产品的生产至关重要。
一个典型的下游加工工作流程涉及若干步骤，包括细胞干扰、分离和净化以及抛光，以获得最后的净化产品。
下游加工的第一步是细胞干扰，其中生物源（如细菌细胞，酵母，或植物组织）被打开释放细胞内成分。
这可以通过机械方法（如同化或声化），化学方法（使用洗涤剂或溶剂），或酶方法（使用酶来分解细胞壁）来实现。
一旦细胞被中断，下一步是将所期望的产物与其他细胞组分分开。
分离和净化涉及过滤、离心和色谱等各种技术。
滤泡常用于去除大颗粒，而离心则可以根据它们的密度分离部件。
另色谱学是一种强大的技术，可以根据其与固定相（如树脂或凝胶）和移动相（如缓冲溶液）的相互作用，分离和净化想要的产物。
不同种类的色谱，如离子交换，大小排斥，以及亲和色谱等，可以根据产品的具体特点使用。
在分离和净化步骤后，下游加工的最后一步是抛光，这涉及额外的净化，以确保产品符合规定的质量标准。
这可能包括进一步的色谱阶梯，以及超滤波，透滤等技术，以及精液化。
超滤和透析可以用来去除较小的杂质和浓缩产物，而脱脂是使产物冻干以提高其稳定性和保质期的一种方法。
下游加工的一个实例是生产用于糖尿病治疗的胰岛素。
胰岛素传统上来自动物的胰腺，但随着基因工程的进步，现在可以使用重组DNA技术生产。
重组胰岛素的下游加工涉及细胞干扰基因工程微生物，随后利用色谱学和其他技术分离和净化胰岛素。
最终产品被抛光去除任何残留的杂质，然后配制成患者使用的胰岛素注射。
下游加工是生物技术的一个关键部分，可以净化和分离生物来源的宝贵产品。
工作流程通常包括细胞干扰、分离和净化以及抛光，使用各种技术确保最终产品达到质量标准。
这一进程使重要的生物药品和其他生物产品得以生产，对保健和各种行业产生了重大影响。
生物工程下游技术 重点
一、绪论1.生物下游加工过程的几个阶段：①预处理和固液分离；主要技术：过滤和离心②提取（初步分离）；目的：除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件；技术：盐析法、有机溶剂沉淀、化学沉淀、大孔吸附树剂、膜分离技术③精制（高度纯化）；目的：除去与产物性质差异较小的杂质；技术：色谱分离技术、结晶、重结晶④成品制作；喷雾干燥，气流干燥，沸腾干燥，冷冻干燥，结晶2.评价分离效果的重要参数浓缩率（m）；回收率；纯度二、发酵液预处理和固液分离名解：凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。
絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。
1.改变发酵液过滤特征的方法物理化学方法：调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加絮凝剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻—解冻、添加助滤剂（——降低液体粘度（加热法、加水稀释法），调整PH，凝聚与絮凝，加入助滤剂，加入反应剂）2.发酵液的相对纯化⑴高价无机离子的除去方法①Ca2+—草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（回收草酸）②Mg2+—三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物③Fe2+—黄血盐，普鲁士兰沉淀⑵杂蛋白的去除方法①沉淀法：酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。
②变性法：加热；大幅度调节PH值；加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
③吸附法：吸附剂或沉淀剂吸附除去杂蛋白—活性炭、硅胶、氧化铝3．常用固液分离的方法⑴离心：在液相非均一系统中，利用离心力达到液－液、液－固、液－液－固分离的方法，统称为离心分离。
离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机⑵过滤：根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
过滤机种类：板框压滤机、真空转鼓过滤机、硅藻土过滤机三、细细胞破碎的主要方法和适用对象，了解基本机理。
（见P65图）细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
生物工程下游纯化的一般工艺流程
总流程大体包括4个阶段：发酵液预处理和固液分离→提取（初步分离）→精制（高度纯化）→成品制作。
1. 发酵液的预处理和固液分离（或称不溶物的去除）发酵液的预处理可采用的方法及原理：1)加热：把悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。
可降低悬浮液的黏度，而且能够加速聚集作用以去除某些杂蛋白等物质，操作比较简单。
对产品的要求较高，热稳定性要好；温度不宜过高，时间不宜过长。
此方法应用较少。
2)调PH：加入草酸、无机酸或碱。
PH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质。
如蛋白质、氨基酸——等电点沉淀法，膜过滤——改变易吸附分子的电荷性质。
3)凝聚和絮凝：将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的块状体，再进行分离。
4)使用惰性助滤剂：惰性助滤剂是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围，使非常稀薄或非常细小的悬浮液在过滤时发生的快速挤压和介质堵塞现象得到减轻，易于过滤。
固液分离可采用的方法及原理：1)过滤法：迫使液体通过固体支承物或过滤介质，把固体截留，从而达到固液分离的目的。
①传统过滤真空过滤，利用空气和真空之间的压力差进行过滤；压滤，用泵产生的液压或气压作为过滤推动力。
②错流过滤过滤时，料液给过滤介质表面一个平行的大流量冲刷，过滤介质表面积累的滤饼就减少到可以忽略的程度。
离心法：利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行分离、浓缩或提炼。
包括离心沉降、离心过滤、离心分离和超离心。
2)膜分离：利用具有一定选择性透过的过滤介质进行物质分离。
有些操作还涉及到细胞的破碎，细胞破碎的方法如下：1)机械法①研磨和匀浆②超声波：超声波法是一种液相剪切破碎法，频率超过15—20kHx(千赫)的超声波是人耳难以听到的一种声音，它可破碎微生物细胞。
③高压匀浆：机理一：通过针形阀时，压力下降的速度和大小是细胞破碎的原因；机理二：细胞破碎是来自涡流的旋涡使液体细胞颤振的结果；机理三：悬浮细胞在平坦表面上的高速喷射撞击是细胞破碎的主要原因。
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4)下游加工过程应与生产规模相适应。
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5） 分离过程应考虑产品的物性和稳定性
6）分离过程应与发酵或生物反应过程相适应
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四、分离效率的评价
浓缩率（富积率，concentration factor）
原料(Raw material) 分离器 产品(Product)
FW, VW, cT,W, cX,W
6、分批分离还是连续纯化
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生物技术下游加工过程的一般流程和单元操 作
动、植物组织、体液等
胞外产物
酶反应液
提取
发酵液 → 预处理 → c分离 → c破碎 → 碎片分离 → 粗分离 → 高度纯化 → 制成品 培养液 加 热 沉 淀 匀 化 离 心 沉 淀 分子筛 无菌过滤 调 pH 离 心 超 声 萃 取 吸 附 离 子 超滤 絮 凝 过 滤 胞 溶 过 滤 萃 取 亲 和 冻干 错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤 吸 附 喷干 结 晶 电 泳
3、 进料的组成和物性
(1)、目的产物的浓度。高？低？ (2)、物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。 (3)、目的产物的定位。是胞内还是胞外？ (4)、菌种的种类和形态。 (5)、微生物的含量和发酵液的黏度。
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4、生产规模 5、危害性
(1)离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。 (2)目的产物本身的危害性；抗肿瘤代谢类药物，类固醇类抗 生素，激素类药物等。 (3)试剂危害。萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。 (4)微生物的危害。重组DNA工程菌不能任意排放。这一菌种 为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。
6
2、成品规格（或产品质量标准）
表 五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页） 指标名称 指标 含量（C37H49N7O9S） 97.0-103.0 比旋光度 -25˚ ~ -29˚ 吸收值比 A(280nm):A(288nm) = 1.12-1.22 氨基酸 各氨基酸之比为1 干燥失重，% 0.5
1、要掌握的产物物化性质，主要包括：
(1)溶解度及影响因素，包括温度、pH值和盐等； (2)分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义； (3)沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义； (4)极性大小； (5)分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等； (6)功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依 据； (7)免疫原性。设计亲和色谱； (8)稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等 (如青霉素低pH不稳定)； (9)分子的淌度及影响因素，包括pH值、离子强度和盐等； (10)等电点pI；
第五章 生物下游加工过程
1
主要内容：
下游加工过程的定义 下游加工过程的流程 下游加工过程的原则和考虑的因素 分离效率评价 地位
下游加工过程是生物工程的一个重要组成部分.
从微生物发酵液、动植物细胞培养液、酶反 应液等中将所需要的目标产物提取、浓缩、 纯化及成品化的过程称为下游加工过程
16
14
回收率(recovery)：
纯化因子(purification factor) 对于具有生物活性的蛋白质或酶，常常用 分离前后目标产物的比活 A [in U/mg]之比 表示目标产物的分离纯化程度
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五、发展趋向
操作集成化 方法集成化 大分子与小分子分离方法的相互渗透 亲和技术的推广使用和亲和配基的人工合成 优质亲和层析介质的开发 基因工程对下游过程的影响 发酵与提取相耦合
发酵液 预处理
细胞 破碎
初步 纯化
高度 纯化
成品 加工 9
三、下游加工过程的设计原则
1)分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。 A) 分离步骤越多，回收率越低； B)分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗 大，生产周期长
YT Yi
i
10
2)合理的分离步骤次序。 原则是：先低选择性，后高选择性；先高通 量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后 高成本。 3)符合产品规格要求； 不能A)引起新的化学污染；B)蛋白质的变性失活
(downstream processing) 它由一些化学工程的单元操作组成,但由于生物物 质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操 作在一般化学工业中应用较少。
3
在发酵产品的生产中，分离和精制过程所需 的费用占成本的很大部分。 对传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬 酸)，分离和精制部分占整个工厂投资费用 的60％， 对重组DNA生产蛋白质、精制的费用可占整 个生产费用的80％一90％。
4
二、生物下游加工的一般过程
生物加工过程的特点： ①采用温和的下游加工生产条件，以保证产物的 生物活性 ②应在尽可能低的温度和快速度进行操作，以避 免发酵产物染菌和酶对产物的降解。 ③必需对原料液进行高度浓缩； ④需要采用高效技术来分离目标产物； ⑤对终产品质量要求很高
5
纯化流程设计前应了解的信息
废液(Waste fluid)
意义：1）如mT >1，则目标产物得到富积； 2）如mT = mX，则目标产物未得到分离纯化。
13
分 离 因 子 (separative factor) ， 或 分 离 系 数 (separative coefficient)
意义：A、目标产物浓度，杂质浓度，则分离因 子大，分离效率； B、A = 1时，则未分离。故在分离为主要 目的时,A