第十六章：哺乳动物基因工程

码基因缺陷的受体细胞（hprt-）：不能在
含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶 核苷的培养基（HAT培养基）上生长，载体 上的标记基因hprt能与之遗传互补。
2.哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记：
3.常用的高等哺乳动物受体细胞 目前，用于医疗用品大规模生产的高 等哺乳动物受体细胞主要是：中国仓 鼠卵巢细胞。
间(h)
甘油刺激时 间(min)
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2.电击转化法（electroporation）
将 受 体 细 胞 悬 浮 于 含 有 待 转 化 DNA 的溶液中，在盛有上述悬浮液的电 击池两端施加短暂的脉冲电场，使 细胞膜产生细小的空洞并增加其通 透性，此时外源DNA片段便能不经 胞饮作用直接进入细胞质。
其优势如下：
①遗传背景清楚，生理代谢稳定。 ②与人的亲缘关系接近，外源蛋白修
饰准确。 ③基因转移和载体表达系统完善。
④耐受剪切力，便于大规模培养。
⑤被美国FDA确认为安全的基因工程受体 细胞。
第三节 转基因导入动物体内的方法 一、动物细胞物理转化法
优点：转基因不含任何病毒基因组片 段，对于基因治疗尤为安全。
⑤安全性能好：不合成分泌致病物 质，不致癌。
三、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 1.营养缺陷型哺乳动物受体细胞
①含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺
陷的受体细胞（tk-）：不能在含有次黄嘌
呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养 基（HAT培养基）上生长，载体上的标记基 因tk能与之遗传互补。
②含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编
B.用小型的注射针头，将脂质注射到 酒精水溶液中，并快速混匀。
②脂质转染法：以脂质体为媒介的外源 DNA导入受体的方法，叫做脂质转染法。
③第一种脂质转染法：将外源DNA与阳离子 型 的 脂 质 体 混 合 形 成 DNA- 脂 质 复 合 物 。 这种复合物可有效地被受体细胞捕获， 实现基因的高频率转移，故这种方法又 叫做DNA-脂质复合物转染法。在这个过 程中，DNA并不是被包装在脂质体的内部， 而是通过两者之间的静电引力作用结合 在一起的。
④第二种脂质体转染法又称脂质体载体法： 它是将外源DNA包装在脂质体的内部，然 后通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间 的融合作用，使外源DNA进入细胞质，尔 后再进入细胞核，实现基因的表达。
⑤脂质体载体法的优越性：
A.制备程序比较简单，可以通过多 聚碳酸脂滤膜消毒灭菌；
B.用它包装的DNA在4℃下可长期保 存不失活性，
②血清依赖性：细胞必须具有生长因 子才能生长。
③接触抑制性：细胞与细胞接触后， 生长便受到抑制。
④形态依赖性：细胞呈扁平状，并有 长纤维网状结构。
上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培 养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平 面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正 常细胞会改变某些特征而越过生理临界点， 继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞 系形成，此时的细胞成为细胞系。
二、高等哺乳动物受体细胞的条件 1.以高效表达外源基因的高等哺乳 动物受体细胞应具备下列条件：
①细胞系特征：丧失细胞接触抑制 性和锚地依赖性特征，便于大规 模培养。
②遗传稳定性：外源基因多次传代 后不至于丢失，易于长期保存。
③合适的标记：便于转化株的筛选 和保持。
④生长快且齐：分裂周期短，生长 均一，便于控制。
缺点：转基因进入细胞后往往多拷贝 随机整合在染色体上，导致受体细 胞基因灭活或转基因不表达。
1.磷酸钙共沉淀法 ①基本步骤
A.细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA 的能力。
B.将待转移的DNA加入氯化钙和磷酸盐， 生成DNA-磷酸钙沉淀，加入培养液中。
C.由于细胞的吞噬作用，DNA-磷酸钙沉 淀物进入细胞，DNA释出后先进入细 胞质、再进入细胞核，整合到受体细 胞的染色体上。
第十六章 哺乳动物基因工程
第一节 高等哺乳动物基因工程的基本概念
一．概念： 动物基因工程是利用DNA重组技术 对动物所进行的工程操作。
二．分为：
1.遗传学动物基因工程：外源基因能 够通过配子进行垂直传递并稳定的 遗传。
2.非遗传性动物基因工程：转基因仅 在当代表现，不能够遗传给子代。
高等哺乳动物的基因工程
高等哺乳动物转基因技术
高等哺乳动物细胞基因表达技术
转基因动物个体
动物工程细胞
哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型
人体基因治疗
蛋白质多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型
第二节 转基因的动物受体细胞 一、高等哺乳动物细胞的生长特性
1.正常的哺乳类动物细胞具有下 列四大生物学特征：
①锚地依赖性：细胞必须附在固体 上或固定的表面才能生长分裂。
二、动物病毒转染法
通过病毒感染的方式将外源基因 导入动物细胞内的转基因方法。 具有定向性好，实验重复性佳， 导入效率高等优点。缺点是载体 宿主范围有限。
4.DNA显微注射法 应用玻璃显微注射器，可以把重组 DNA直接注射到哺乳动物细胞的细胞 质或细胞核。
①真正的显微注射(true microinjection) 法，DNA是由注射针直接注入细胞。
②“穿刺”(pricking)导入法，DNA是 处在细胞周围培养基中，它通过穿 刺形成的小孔进入细胞的内部，或 是随穿刺的针头一道进入的。
②影响磷酸钙转染效率的因素：
A.DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量； B.共沉淀物与细胞接触的保温时间； C.甘油或DMSO等促进因子作用的持续
时间等。
磷酸钙转染的最适条件筛选
培养皿号 (10 cm)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pXGH5(ug)
pUC13(ug)
细胞与沉淀 物的保温时
影响因素： 脉冲的最大电压
脉冲持续的时间 与DNA浓度则无多大关系。
3.脂质体包埋法
脂质体(liposomes)是一种人造的脂 质小泡(lipid vesicles)，外周是脂 双层，内部是水腔。用它作载体可以 把外源DNA导入培养的哺乳动物细胞。
①脂质体的制备的两种方法：
A.将适宜的脂质悬浮在液体介质中， 然后迅速地振荡，使之形成大小相 当一致的脂质体；