成纤维细胞体外培养、冻存及复苏的实验研究

细胞冻存、复苏、传代、转染(超详细版)

细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。

（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。

细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。

试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。

（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。

细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。

(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。

(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。

(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。

(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。

(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。

细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至37℃。

打开离心机。

（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。

（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。

（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。

（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。

（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。

南阳牛成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

河南农业科学，０２４（）１５１８２１，１４：３ —３
ＪｕｎｌｏｎｎＡｇｉｕｔｒｌｃｅｃｓｏｒａｆＨｅａｒｌ纤维细胞的体外培养及生物学特性研究
楚秋霞安森亚施巧婷辛晓玲王二耀魏成斌徐照学，，，，，，
织作为试验材料，过组织块法培养分离南阳牛成纤维细胞，通并进行生物学特性分析。结果表明，含有１％ＦＳ的Ｄ５ＢＭＥＦ２培养基较适合原代牛成纤维细胞的体外培养。分析了细胞冻存前Ｍ／１
和复苏后的活率，别为９．和９．，异不显著；分５９０２差生长曲线表明细胞生长正常。南阳牛成纤
维细胞传至第６代时’ ，细胞核型正常。流式细胞仪检测结果显示，一ＧＧ。期的Ｆ４和Ｆ８代细胞占细胞总数的６．５和６．３，１代细胞占细胞总数的８．Ｏ。在Ｓ期，４代细胞占细胞总４３４５％Ｆ１１９Ｆ
ｔａｓｅｙｅｔｂｉｈｎｏｉｅｆｒｂａｔ，ａｅｎｃｌｕｉｇＮａｙｎｂｏｙｔｕｃｓｆｌｒｎｆｒｂｓａｌｉｇｂｖｎｉｏｌｓｓｂｓｄｏｕｔｒｎｎａｇｆｒｃｓｉｓｃｅｓｕｌｓｂｉｃｙ
ＣｕｔｒｎｏｏｉａｌｕｅａｄＢｉｌｇｃｌＣｈａａｔｒｓｉｓｏｒｃｅｉｔｃｆ

大鼠原代心肌成纤维细胞冻存与解冻

大鼠原代心肌成纤维细胞冻存与解冻桂林赛奥生物技术有限公司鼠原代心肌成纤维细胞（Primary cardiac fibroblasts）是一种源于新生S-D大鼠心脏组织的亚克隆原代成纤维细胞，保有成纤维细胞原有的多种生物学性质，包括弹性蛋白和AT1受体的表达以及少量肌球蛋白的表达，可增殖传代数次。

成品使用冻存管储存于-190℃液氮罐中。

一般，每个冻存管所含细胞数 >5 x 105 。

1、使用前应分步解冻，操作步骤如下：z预先将解冻培养基置于37℃ 水浴中加热；z将细胞冻存管从液氮罐中取出并迅速（数分钟内）将其置入37℃水浴中；z把解冻培养液加到培养瓶或培养皿内；z缓慢地（不得少于1分钟）把细胞接种到培养瓶或培养皿；z将已经接种细胞的培养瓶或培养皿置于二氧化碳培养箱内，不要过度振摇。

当细胞贴壁时（通常需要数小时），更换新鲜生长培养基并继续培养。

在细胞长满之前作次（传）代培养。

2、次代培养z将培养瓶或培养皿中的培养液吸弃；z用2 ml 的0.25% (w/v) Trypsin-0.53 mM EDTA溶液简单清洗细胞层；z加3 ml的Trypsin-EDTA溶液，置37℃二氧化碳培养箱中, 在倒置显微镜下观察细胞层脱落；z加入7.0 ml完全生长培养基，用吸液管轻轻抽吸细胞使细胞分散；z按照1:4～6的比例将细胞再次接种于新的培养瓶或培养皿中，置37℃二氧化碳培养箱中培养；z每2～3天更换一次新鲜培养基。

3、解冻培养液：17ml去离子水+3ml胎牛血清（FBS）混合而成4、生长培养基：Dulbecco’s改良任格氏培养基（DMEM），含10% FBS以及1000U/L 青霉素、1mg/L链霉素。

5、培养条件：95%空气；5%CO2；温度37.0℃。

6、细胞储存需要冷冻液，方法: 生长培养基添加DMSO，浓度为 7.5% (v/v) 。

细胞储存应分步进行，步骤：从 -20℃ 降到 -80℃ ( -80℃ 冰箱或液氮气) ，放置数小时，然后转入-190℃ 液氮(罐)中。

牛胎儿成纤维细胞的分离培养

ｆｔｌｂｏｉｉｏａｔｇｏｗｔｃｖｓｗｅｅｅａｖｎｅｆｂｒｂｌｓｓｒｈｕｒｅｒｎｏｍａ．Ｔｈｂｉｅｅａｉｒｌｓｓｉｓｓｃｅｓｕｌｙｓａｒ１ｅｏｖｎｆｔｌｆｂｏｂａｔｌｎｅｗａｕｃｓｆｌｅｔｂ—
ｌｈｄＴｈｏｉｅｆｔｌｉｒｂａｔａｅｓｂｕｒｄｓｖｒｌｉｓａｄｃｙｐｅｅｖｔｏ．ｉｅ．ｓｅｂｖｎｅａｂｏｌｓｓｃｎｂｕｃｈｕｅｅｅａｍｅｎｒｏｒｓｒａｉｎｆｔ
００）分离纯化的胎牛成纤维细胞的生长曲线都正常；功地建立了牛胎儿成纤维细胞系。该细胞可．５；成
经多次传代培养和冷冻保存。
关键词：牛胎儿；纤维细胞；离培养；冻保存成分冷
Ｉｏｌｔｏｎｌｕｅｏｖｉ量ｅａｂｏｌｓｓｓａｉｎａｄＣｕｔｒｆＢｏｎｅ，ｌＦｉｒｂａｔｔ
ｇｏｈｉｏｒｒｗｔｖｇｏｕｓ．Ｆｉｒｂａｓｓｗｉｈ０２５ｂｏｌｔｔ．ｔｙｉｉｅｔｏｎａｕｕｔｅｅｌｎｇｏｄｃｎｄｔｏＷｉｈｌｉｒｐｓｎｄｇｓｉｎｄｓｂｃｌｕｒｄｃｌｓｉｏｏｉｉｎ．ｔｉｄｑｕ
ｗｅｅｉｏａｅｙａｔｃｉｇｔｓｕｘｌｎｓｆｏｅｒｓｉｆａｂｖｎｅａ，ｎｃｌｔｄｗｉ～６ｄｙｉｒｂａｔｒｓｌｔｄｂｔａｈｎｉｓｅｅｐａｔｒｍａｋｎｏｏｉｅｆｔｌｉｏｕａｅｔ５ｈａｓｆｂｏｌｉｌＨｕｂｎｒｓａｃｎｒｆＨｅｌｎｊｎａｅｙｏｒｃｌｕａｃｅｃｓＨａｂｎ１０８）ＡｎｍａｓａｄｙＲｅｅｒｈＣｅｔｅｏｉｇｉｇＡｃｄｍｆＡｇｉｕｔｒｌｉｎｅ，ｒｉ５０６ｏａＳ

人皮肤成纤维细胞的体外分离_培养及鉴定

采用冷胰蛋白酶和胶原酶联合消化法培养皮肤 Fbs 是本室研究探索出的一种新方法。本研究通过对 50 例女性眼睑部位皮肤的 F bs 体外培养, 其成功率可达 100% 。表明这种培养 F bs 的方法是稳定可行的。
表 1 人皮肤成纤维细胞培养液中羟脯氨酸含量及型胶原含量 T ab 1 Contents of hy dr ox ypro line and collag en ty pe in 图 4 人皮肤成纤维细胞冻存前生长曲线 Fig 4 freezing T he gr ow th cur ve of human skin fibro blast s befor e cultur e fluid of human skin fibro blasts
5
数据采用 SP SS 11 5 统计软件
包进行处理。人皮肤 Fbs 生长曲线、羟脯氨酸含量及型胶原含量的测定结果均以 x s 表示, 组间比较采用单因素方差分析。 2 结 2 1 果细胞形态学观察及鉴定人皮肤 F bs 接种
24 h 后, 细胞逐渐呈放射状伸展, 中心随之扁平, 接种 3~ 5 d 细胞开始缓慢生长 , 约 7~ 9 d 汇合成片, 汇合生长的 Fbs 呈长梭形 , 排列方式为旋涡状 ( 图 1A, 见封三) 。大鼠皮肤 F bs 接种 4 h 后贴壁, 呈长梭形 , 生长迅速 , 随着细胞的增殖 , 2~ 3 d 即呈汇合状态, 细胞紧密排列 , 其排列方式为旋涡状、放射状或栅栏状 ( 图 1B, 见封三 ) 。对培养第 3 代的人皮肤 Fbs 细胞进行 H E 染色、光镜下观察, 见细胞呈多角形或长梭形, 核较大, 胞质较多, 胞浆着粉红色 , 胞核着蓝紫色 , 如图 2 ( 封三) 所示。S ABC 法对培养的人皮肤 Fbs 进行波形蛋白染色。结果胞浆呈现棕黄色颗粒状反应 , 胞核不着色 , 多于 98% 的细胞染色阳性。证明细胞表达波形蛋白 , 是 F bs, 结果如图 3 ( 封三) 所示。 2 2 人皮肤 F bs 活力检测及生长曲线测定本实验连续 3 次取对数生长期细胞重复做台盼蓝排斥实验, 在倒置显微镜下观察 , 显示极少数细胞被染成蓝色 , 绝大多数细胞拒染。3 次检查的活细胞率分别是 98% 、 100% 及 100% 。以 1 103 个细胞的密度接种 Fbs 到 96 孔板, 在一定时间内, 细胞数量随时间的增加而增殖 , 于第 5 天时长满, 生长状态良好。3 ~ 7 d 的细胞增殖与 0 d 相比显著增高 ( P < 0 01) 。其潜伏期、对数生长期、平台期分别为 0~ 1 、1~ 5 和 5~ 7 d, 生长曲线见图 4。

小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法

小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。

2. 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。

3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。

以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

二、具体操作1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。

3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。

5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。

6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。

一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法

一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。

2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。

3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。

4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。

5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。

6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。

7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。

8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。

9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。

10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。

11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。

12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。

13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。

14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。

15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。

人眼Tenon's囊成纤维细胞原代培养的研究

人眼Tenon's囊成纤维细胞原代培养的研究陈珺;李宁;廖荣丰【摘要】目的探讨体外培养原代人眼Tenon's囊成纤维细胞的方法及其生长特性,为抗纤维化研究提供靶细胞模型.方法取翼状胬肉及斜视手术患者的Tenon's囊组织,用组织块法培养原代成纤维细胞.用免疫荧光方法鉴定细胞.对细胞进行传代、冻存和复苏的观察.对复苏后的细胞行MTT法检测其活力并绘制生长曲线.结果入眼Tenon's囊成纤维细胞可以在体外用组织块方法培养出来,呈典型的长梭形.免疫荧光鉴定细胞波形蛋白染色阳性.细胞多次传代后依然生长迅速,3d即可长满瓶底.复苏后细胞2～6d处生长对数期,增殖能力良好.结论人眼Tenon's囊成纤维细胞体外生长状态良好,可以液氮冻存,复苏后细胞活力较强,可以用于抗纤维化增生的基础研究.【期刊名称】《临床眼科杂志》【年(卷),期】2016(024)001【总页数】4页(P1-4)【关键词】人Tenon囊;成纤维细胞;细胞培养技术【作者】陈珺;李宁;廖荣丰【作者单位】230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院眼科;230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院眼科;230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院眼科【正文语种】中文纤维增生性疾病在多个医学领域(包括眼部、皮肤、整形和肿瘤等)中尚属治疗难点，对其发生发展和机制还有待进一步研究[1，2]。

瘢痕化的形成是其共同的表现，瘢痕化的产生主要是与多种细胞因子的产生、细胞及细胞外基质活动有关的生物学过程[3-7]。

其中人眼Tenon's囊成纤维细胞(human Tenon's capsule fibroblasts,HTFs)的过度增殖是纤维瘢痕化的主要原因，所以探索简单快速地培养出大量HTFs，观察其生长特性，研究细胞经过数次传代、液氮冻存及复苏后的活力如何，为抗瘢痕化的研究提供理想细胞模型。

一、取材本实验已经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会审核批准，人眼Tenon's囊组织均取材于本院斜视及翼状胬肉手术患者，患者均签署知情同意书，无既往眼部手术史，术中打开结膜囊暴露Tenon's组织，取材约5 mm×5 mm大小并放入含DMEM培养液的无菌离心管中，装入无菌冰盒带回实验室。