实验十一细胞的冻存与复苏 ppt课件
实验十一、细胞的冻存与复苏
实验十一、细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。
该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。
本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。
实验步骤：1. 细胞的收集和分装首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。
然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。
注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。
2. 冷冻将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。
然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。
3. 冻存的解除和复苏在复苏前，需要进行以下步骤：① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。
② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。
然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。
注意事项：1. 冷冻剂的熟练使用DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。
然而，DMSO也具有一定的毒性。
因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。
2. 细胞处理的无菌性细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。
在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。
3. 冷冻剂和液氮的注意事项冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。
在操作过程中，需要戴上手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。
同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的泄漏。
总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。
如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。
细胞的冻存及复苏PPT课件
冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降
温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
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细胞冻存与复苏的关键因素
复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保护剂
冷冻保护剂：可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般 多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
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细胞冻存与复苏的关键因素
保存温度
冷冻保存温度：能长期保存细胞的超低温度，在 此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但 经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和 功能。 液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。
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冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
细胞冻存与复苏
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细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
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细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
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细胞的冻存及复苏PPT共18页
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细胞的冻存及复苏
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 1ห้องสมุดไป่ตู้、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
细胞的冻存及复苏
冷冻速率：慢冻
复苏速率：快融
冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降 温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
细胞冻存与复苏的关键因素
要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几 个问题：冷冻速率、复苏速率、冷冻保护剂，冷 冻保存温度。
细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
冷冻速率：降温的速度，直接关系到冷冻效果， 对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其 最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
细胞冻存与复苏ຫໍສະໝຸດ 细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
细胞的冻存和复苏 2.细胞复苏
在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保 存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。
细胞冻存与复苏的原理
• 为使细胞复苏时存活率最高 • 最佳的冻存条件： 尽可能地降低细胞内的晶体形
成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细 胞造成的损伤。 • A) 缓慢冷冻 • B) 用亲水的低温保护剂排除水分 • C)在尽可能低的温度保存细胞 • D)快速复苏
冷冻保存方法
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。
冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。
在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。
（二）方法1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。
给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。
2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。
3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。
4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。
5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。
6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。
7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。
8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。
（三）注意事项1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。
2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏一.实验原理体外培养的细胞随着传代次数的增加，在体外环境中生存时间的增长，其各种生物特性都将逐渐发生变化，且细胞的传代培养过程中，培养器具、培养液等都需大量的耗费，因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冻存通常指将细胞冷冻储存在-196℃的液氮中，理论上可以储存无限长的时间。
如果不加保护剂直接对细胞进行冷冻，会导致细胞内外的水份迅速形成冰晶，并对细胞的结构造成损害。
目前冻存细胞时多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，缓慢冷冻时可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成而造成的细胞损伤，且不会对细胞造成毒性。
细胞的复苏是指将冻存的细胞从液氮中取出融解，使其活力恢复的过程。
细胞复苏应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
二.试剂器材1.完全培养基2.PBS3.DMSO4.0.25%胰酶(贴壁细胞需要)5.0.4%台盼蓝溶液(取台盼蓝0.4g，溶于100ml生理盐水或PBS中，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装于1.5ml无菌离心管中，室温保存备用)6.冻存培养液(取完全培养基9.0ml，逐滴加入DMSO 1.0ml)7.细胞培养瓶8.15ml离心管9.冻存管10. 水浴锅其他器材：移液器、移液器吸头(10μl、100μl、1ml)、温度计、镊子、血球计数板、计数器、废液缸、离心管架、涡旋振荡器等。
三.操作步骤细胞冻存冷冻前24-48hr更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期；配制含10%DMSO、10%小牛血清的冻存培养液置于4℃下待用；贴壁细胞：用胰蛋白酶把贴壁生长的细胞消化下来，制备成单细胞悬液，200-400g离心5min收集细胞；悬浮细胞：直接将细胞移至离心管中，200-400g离心5min收集细胞；弃去上清，用冻存液混悬起沉淀细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率；加冻存液调整细胞浓度至(1-10)×106/ml；将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5 ml，标明细胞的名称、冻存时间及操作者；将上述冻存管在4℃下放置30min；然后移入-20℃冰箱30min；置于-80℃冰箱过夜；再置于液氮罐中长期保存。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
细胞复苏学习幻灯
冻存细胞解冻学习幻灯
张永华 北京永泰免疫应用科技有限公司
冻存细胞解冻的原则
在实际操作中，冻存细胞要进行复苏， 在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再 培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。 培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。 以保证细胞外结晶快速融化， 以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速 融化水分渗入细胞内， 融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶 损胞冻存管从加有液氮的保温桶中用镊 子夹牢，快速在37度水浴锅中摆动，使冻 子夹牢，快速在37度水浴锅中摆动，使冻 存液迅速解冻融化。注意在这过程中尽量 使冻存管盖位于水面上。 待冻存管中大部分内容物已呈液态时，将 冻存管表面消毒后移入生物安全柜。
注意事项 在细胞复苏操作时， 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞 速度要快，可不时摇动冻存管， 速度要快，可不时摇动冻存管，使之尽快 通过最易受损的温度段（ ）。这 通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这 样复苏的冻存细胞存活率高， 样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态 良好。 良好。 从液氮罐中取出冻存管， 从液氮罐中取出冻存管，有时因冻存管未 封严，浸入了液氮， 封严，浸入了液氮，取出后因冻存管内液 氮迅速气化而发生爆炸， 氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护 眼睛和手套。 眼睛和手套。
细胞培养基本方法复苏、换液、传代、冻存课件 (一)
细胞培养基本方法复苏、换液、传代、冻存课件 (一)近年来，细胞培养技术在生物研究中得到了广泛的应用，但在应用的过程中，经常遇到细胞复苏、换液、传代、冻存等问题。
本文将对这些问题进行讲解。
一、细胞复苏细胞冻存是广泛应用的细胞存储方法。
由于在冻存过程中会损伤细胞，因此冻存后的细胞需要进行复苏才能够继续进行培养。
复苏的方法如下：1、取出细胞管，将管子快速放入37℃的预热水中，快速震动5秒钟，过度加热有危险，只需使水恒温为37℃即可。
2、马上将管子离水中，管口向外，用无菌的吸管粗略地抽取培养液，然后再将吸管插入细胞培养管管口，尽量避免空气进入细胞培养管。
3、使细胞含量达到有效水平（此种方法需配合不同种类细胞需要的培养基和生长条件）二、换液为了保证细胞的健康和正常生长，需要周期性地进行培养液的更换。
换液的方法如下：1、用无菌吸管将旧培养液吸出。
2、向细胞培养管中加入新的培养液。
3、培养之前搅拌均匀。
4、用生物安全柜消毒吸管和细胞培养箱户口。
三、传代传代的目的是使细胞继续生长和培养，同时避免暴增和变异。
传代的方法如下：1、用1:2、1:3、1:4等系数调节种子层数。
每次移植液可以不变，也可以加1倍因子。
2、对于一些细胞，如病毒感染易变异和新生成的细胞支原体感染易暴增、细胞周期等，直接移植的效果更佳。
3、传代前，检查培养基是否清晰，底物和细胞是否良好。
4、传代时需要更换新的培养基。
四、冻存为了保存优质的细胞株和把样本留在未来的使用中，冻存是非常重要的。
冻存的方法如下：1、将细胞悬液和10%含有环甲基丙环戊酮（DMSO）的培养基混合（1:1）。
2、转移冷冻管至冰缸中，迅速将前端放入-80°C的冰柜中小心，冷却30-60分钟后，将其转移到液氮罐中。
3、在恒温下用不同培养基和DMSO的比例来冻存不同种类的细胞，确保细胞存活和培养后表型的一致性。
总之，对于细胞培养技术中的基本方法，我们需要认真学习和实践。
只有熟练掌握这些基本技能，才能够更好地发挥细胞培养技术的应用价值。
冷冻和复苏
青 衣
冷存主要材料
（1）仪器设备：普通冰箱、-30 ℃低温冰箱和-70 ℃ ～-80 ℃超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程 控降温仪等； （2）冻存管：容量为 1ml 或 1.5ml； （3）冷冻保护液：一般是以 9 份小牛血清或细胞培养液与 1 份 DMSO（二甲基亚砜） 混合而成。现配现用，或配 制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水 浴溶解； （4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。 青
冻存管 4~8℃ 约 40min -10~-20℃
普通冷藏室
约45min
普通冰箱
移入 液氮
-70~-80℃
-30℃
超低温冰箱
过夜
低温冰箱
约30min
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发 干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。 青 衣
3· 记录 记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中 降温的情况、冻存位置以及操作人员
青 衣
对照试验
在冷冻细胞被移入到液氮罐中一段时间后，取出一管细
胞复苏并进行培养以检测存活率。
青 衣
实验要点及说明：
1．严格遵守液氮操作规则(即戴上合适的手套和护目镜)，液态氮对眼 睛极为有害； 2．对一瓶细胞培养液要尽可能多分装几个冷冻管； 3．延长暴露在DMSO中的时间对细胞有害，因此冷冻和解冻操作要 尽可能快； 4．细胞可以暂时稳定保存在-80 ℃达数月；
衣
谢谢
青 衣
细胞冷冻和复苏
青 衣
原理
在低于-70 ℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反 应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材 料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老 死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时， 其内部的生化反应可恢复正常。
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• 3. 低速离心，1000rpm，10分钟。 • 4. 去上清，加新鲜培养液3ml。 • 5. 将刚复苏的细胞转移至培养瓶中，C02培养箱，
37 ℃培养。
复苏要点
• 快速解冻
– 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水 浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全 部融化（不要超过3 分钟）
实验十一、细胞的冻存与复苏
一、实验目的
1.初步掌握冻存与复苏的原理及其操作过程 2. 继续强化细胞无菌操作理念
二、实验材料与用品
（一）材料：Hela细胞
（二）试剂 培养液：1640培养液+15%小牛血清；胰蛋白酶消 化液：0.25%；冻存液、液氮
三、实验原理
• 细胞冻存的原理：当细胞冷到零度以下，可以产 生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓 度升高，并在细胞内形成冰晶。
–细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通 过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长 培养液的培养瓶。
四、实验步骤
一、细胞冻存方法
• 1.预先配制冻存液： 含10-30%血清培养基，10% DMSO。 • 2.取对数生长期细胞，胰酶消化后，加全培养基终止消化，
1000rpm离心收集细胞，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成 细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml) • 3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷 冻日期。 • 4.冷冻过程要缓慢。4℃ 30－60 分钟→-20℃ 30 分钟 →80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存
透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程， 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少 胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 • 常用细胞冷冻保存液 10％DMSO ＋ 20％血清＋基础培养液 10％甘油＋ 20％血清＋基础培养液
细胞复苏原理及要点
–当细胞冷到-5至零度时，可以产生以下变化：细胞 器脱水，在细胞内形成冰晶，对细胞器有损伤，复 苏时应尽快通过该温度。
7、应在无菌条件下操作，注意操作要领，避免污染细胞。
注意事项
1、操作前，提前将操作间和超净工作台内紫外灯打开，消毒杀 菌30 分钟。
2、进操作间前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新 洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
3、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行。 4存复苏时，操作要带手套，防止冻伤。
• 冷冻保存要点
• DMSO液用培养液配好冰上预冷，避免因临时配制产热 而伤害细胞。
• 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微 生物污染。细胞浓度控制在：1×106-5×106/ml。
细胞保存条件 液氮罐
二、细胞复苏方法
• 1.从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃(或者 42 ℃)水浴中，使其融化（1分钟左右）。
• 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致 产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成 细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融， 目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
低温保护剂的应用的原理
1、在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效率 2、常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速