猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用

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猪轮状病毒胶体金检测试纸条的研制及应用

中国畜牧兽医 2024,51(3):1223-1231C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 猪轮状病毒胶体金检测试纸条的研制及应用李妍花1,周兵强1,康笃利1,郝丽影1,汪志艳1,赵少若1,黄甜1,庞杏豪1,刘俊阳1,楚园园1,张云静2,高晓静2,邓均华1,田克恭1,2(1.洛阳普泰生物技术有限公司,洛阳471000;2.国家兽用药品工程技术研究中心,洛阳471000)摘要:ʌ目的ɔ利用2株猪轮状病毒(P o r c i n e r o t a v i r u s ,P o R V )单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条,用于P o R V 的临床快速检测㊂ʌ方法ɔ制备40n m 粒径的胶体金溶液标记单克隆抗体4G 5,将单克隆抗体5G 4和羊抗鼠I g G 分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测线和质控线㊂通过优化胶体金溶液最适p H ㊁标记抗体和检测抗体的最佳使用量,制备P o R V 胶体金检测试纸条;对试纸条的灵敏度㊁敏感性㊁特异性㊁重复性和稳定性进行评价㊂通过检测50份猪粪便样品,计算试纸条与R T -P C R 方法的符合率,最后采用试纸条进行1249份临床样品的测定㊂ʌ结果ɔ经优化后试纸条的最佳参数如下:胶体金溶液最佳p H 为8.0,标记抗体4G 5和检测抗体5G 4最佳使用量分别为14.4μg /m L 和1m g /m L ㊂试纸条能检测出1ʒ2000稀释的P o R V O S U 株(G 5型)病毒液,灵敏度为104.5T C I D 50/m L ,且检测P o R V G 9㊁G 3和G 4型毒株均为阳性㊂检测猪传染性胃肠炎病毒(T r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i sv i r u s,T G E V )㊁猪流行性腹泻病毒(P o r c i n ee pi d e m i cd i a r r h e av i r u s ,P E D V )㊁猪δ冠状病毒(P o r c i n ed e l t a c o r o n a v i r u s ,P D C o V )㊁猪伪狂犬病病毒(P o r c i n e p s e u d o r a b i e s v i r u s ,P R V )和猪圆环病毒2型(P o r c i n e c i r c o v i r u s t y p e2,P C V 2)均为阴性㊂批内和批间重复性㊁稳定性良好㊂检测50份猪粪便样品,与R T -P C R 方法的阳性符合率为97.5%(39/40),阴性符合率为100%(10/10),总体符合率为98%(49/50)㊂检测2022年在河南㊁山西省猪场收集的临床样品1249份,阳性检出率为5.2%㊂ʌ结论ɔ本研究制备的P o R V 胶体金检测试纸条具有良好的敏感性㊁特异性和重复性等优点,与R T -P C R 方法的符合率较高,可用于规模化猪场P o R V 的快速检测㊂关键词:猪轮状病毒(P o R V );胶体金检测试纸条;快速检测中图分类号:S 852.65+9.4文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.03.034 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-31基金项目:2020年度郑洛新国家自主创新示范区创新引领型产业集群专项猪伪狂犬病㊁猪圆环和猪肺炎支原体基因工程疫苗的研发与产业化 (201200211200)联系方式:李妍花,E -m a i l :l i .y a n h u a @s s l a b .c o m.c n ;周兵强,E -m a i l :z h o u .b i n g q i a n g @s s l a b .c o m.c n ;康笃利,E -m a i l :k a n g.d u l i @s s l a b .c o m.c n ㊂李妍花㊁周兵强和康笃利对本文具有同等贡献,并列为第一作者㊂通信作者邓均华,E -m a i l :d e n g b e t t e r 88@163.c o m ;田克恭,E -m a i l :v e t v a c @126.c o mD e v e l o p m e n t a n dA p pl i c a t i o no fC o l l o i d a lG o l dT e s t S t r i p A ga i n s t P o r c i n eR o t a v i r u s L IY a n h u a 1,Z H O U B i n g q i a n g 1,K A N G D u l i 1,H A OL i y i n g 1,WA N GZ h i ya n 1,Z H A OS h a o r u o 1,HU A N G T i a n 1,P A N G X i n g h a o 1,L I UJ u n y a n g 1,C HU Y u a n yu a n 1,Z HA N G Y u n j i n g 2,G A O X i a o j i n g 2,D E N GJ u n h u a 1,T I A N K e g o n g1,2(1.L u o y a n g P u t a iB i o t e c h n o l o g y C o .,L t d .,L u o y a n g 471000,C h i n a ;2.N a t i o n a l R e s e a r c h C e n t e r f o rV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,L u o y a n g 471000,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b je c t i v e ɔT w os t r a i n so fm o n o c l o n a l a n t i b o d i e so fP o r c i n er o t a v i r u s (P o R V )w e r e u s e d t o e s t a b l i s hP o R Vc o l l o i d a l g o l d t e s t s t r i pf o r r a pi d d e t e c t i o n o f P o R V.ʌM e t h o d ɔT h e 40n m c o l l o i d a l g o l d p a r t i c l e sw e r e u s e d t o l a b e l t h em o n o c l o n a l a n t i b o d y 4G 5.T h em o n o c l o n a l a n t i b o d y5G 4a n ds h e e p a n t i -m o u s eI gG w e r ec o a t e do nt h es u r f a c eo fn i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n ea st h e中国畜牧兽医51卷d e t e c t i o n l i n e a n dt h ec o n t r o l l i n e,r e s p e c t i v e l y.T h ec o l l o i d a l g o l dt e s t s t r i p w a se s t a b l i s h e db y o p t i m i z i n g t h eo p t i m a l p H o fc o l l o i d a l g o l ds o l u t i o n,t h eo p t i m a lu s a g ea m o u n to ft h el a b e l e d a n t i b o d y a n d t h ed e t e c t i o na n t i b o d y.T h es e n s i t i v i t y,s p e c i f i c i t y,r e p e a t a b i l i t y a n ds t a b i l i t y o f t h e s t r i p w e r e a s s e s s e d.T h e c o i n c i d e n c e r a t e o f t h e s t r i p a n dR T-P C R w a s c a l c u l a t e db y d e t e c t i n g50 p i g f e c a l s a m p l e s,a n d t h e nt h es t r i p w a s p u t t oc l i n i c a l u s eb y d e t e c t i n g1249c l i n i c a l s a m p l e s.ʌR e s u l tɔT h eo p t i m a l p a r a m e t e r so f t h e t e s t s t r i p w e r ea s f o l l o w s:T h eo p t i m a l p H o f c o l l o i d a l g o l d s o l u t i o nw a s8.0,t h e o p t i m a l u s a g e a m o u n t s o f l a b e l e d a n t i b o d y4G5a n dd e t e c t i o n a n t i b o d y 5G4w e r e14.4μg/m La n d1m g/m L,r e s p e c t i v e l y.T h e s t r i p c o u l dd e t e c t a1ʒ2000d i l u t i o no f P o R V O S Us t r a i n(g e n o t y p eG5),t h e s e n s i t i v i t y w a s104.5T C I D50/m L,a n d t h ed e t e c t i o nr e s u l t s o fP o R V G9,G3a n d G4s t r a i n s w e r e a l l p o s i t i v e.A n d n o c r o s s r e a c t i o n o c c u r e d w i t h T r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i sv i r u s(T G E V),P o r c i n ee p i d e m i cd i a r r h e av i r u s(P E D V),P o r c i n e d e l t a c o r o n a v i r u s(P D C o V),P o r c i n e p s e u d o r a b i e sv i r u s(P R V)a n d P o r c i n ec i r c o v i r u st y p e2 (P C V2).T h e a s s a y r e s u l t s s h o w e dt h a t t h e s t r i p h a d g o o dr e p e a t a b i l i t y i na n db e t w e e nb a t c h e s a n d s t a b i l i t y.50p i g f e c a l s a m p l e sw e r e d e t e c t e d b y t h e s t r i p a n dR T-P C R,t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e p o s i t i v e c o i n c i d e n c e r a t ew a s97.5%(39/40),t h en e g a t i v ec o i n c i d e n c e r a t ew a s100%(10/10),a n dt h eo v e r a l lc o i n c i d e n c er a t e w a s98%(49/50).1249c l i n i c a ls a m p l e s w h i c h w e r ec o l l e c t ed f r o m p i g f a r m s i nHe n a na n dS h a n x i p r o v i n c e s i n2022w e r ed e t e c t e db y t h e t e s t s t r i p, a n d t h e p o s i t i v e r a t e of P o R V w a s5.2%.ʌC o n c l u s i o nɔT h e c o l l o i d a lg o l ds t r i p d e v e l o p e d i n thi s s t u d y h a d g o o ds e n s i t i v i t y,s p e c i f i c i t y a n dr e p e a t a b i l i t y,a n dh i g hc o i n c i d e n c er a t ew i t h R T-P C R m e t h o d,a n d c o u l db eu s e d f o rP o R Vr a p i dd e t e c t i o n i n i n d u s t r i a l i z e d p i g f a r m.K e y w o r d s:P o r c i n e r o t a v i r u s(P o R V);c o l l o i d a l g o l d t e s t s t r i p;r a p i dd e t e c t i o n轮状病毒(P o t a v i r u s,R V)为双链R N A (d s R N A)病毒,属于呼肠病毒科(R e o v i r i d a e)轮状病毒属(R o t a v i r u s)㊂R V主要根据病毒粒子表面的3种抗原来分型,分别是血凝素抗原V P4㊁群抗原V P6和中和抗原V P7[1]㊂根据群抗原V P6,R V可分为12个群(R V A~R V L),其中R V A㊁R V B㊁R V C㊁R V E和R V H可以感染猪,在世界范围内主要以A群流行为主㊂其主要通过粪口途径传播,经口腔进入胃㊁小肠并在消化道内增殖[2]㊂猪轮状病毒(P o r c i n e r o t a v i r u s,P o R V)多感染7~41日龄的仔猪,其中2~3周龄的仔猪发病率最高,死亡率7%~20%[3]㊂仔猪感染后有2~4d潜伏期,继而出现食欲减退㊁腹泻㊁呕吐等症状,粪便多为黄绿色或灰白色水样㊁半固体或乳清状,伴有腥臭味㊂腹泻严重者出现大量脱水㊁电解质功能紊乱等现象,最终导致死亡[4]㊂徐丽华等[5]对2011 2017年浙江省不同地区的猪病毒性腹泻病进行调查,进行猪传染性胃肠炎病毒(T r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i s v i r u s, T G E V)㊁猪流行性腹泻病毒(P o r c i n e e p i d e m i c d i a r r h e av i r u s,P E D V)㊁P o R V和猪δ冠状病毒(P o r c i n ed e l t a c o r o n a v i r u s,P D C o V)4种病毒核酸检测,结果显示,猪场存在4种病毒病的流行,并且存在病毒的双重和三重混合感染,其中P E D V和P o R V两种病毒感染率高且混合感染严重㊂目前针对P o R V感染的治疗尚无特效药,临床上对该病的防控主要以疫苗为主,中国普遍使用中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的T G E V㊁P E D V和P o R V(G5型)三联活疫苗㊂但P o R V基因群众多,基因型复杂,基因之间也易发生重配,导致疫苗的防控作用受到限制㊂临床上主要引起腹泻的P o R V㊁T G E V㊁P E D V㊁P D C o V4种病毒感染临床症状相似,无疑增加了临床上的诊断难度㊂因此亟需开发高效㊁可靠的临床诊断方法,用于P o R V感染的综合防控㊂目前P o R V感染常用的诊断和鉴定方法主要为电镜观察法(E M)㊁P C R㊁实时荧光定量P C R㊁荧光免疫法(I F A)等[6]㊂上述技术虽然分析较为准确,但需要昂贵㊁精密的仪器,配备专业的技术人员,不适用于基层及养殖现场的快速检测,降低了检测的时效性㊂针对此问题,近年来很多学者对P o R V 的快速免疫分析检测技术进行研究,如孟柳等[7]建立了P o R V血清抗体检测间接E L I S A法,可用于P o R V的病原学检测;R o d k等[8]建立竞争阻断E L I S A(C B-E L I S A)方法检测194份仔猪粪便,42213期李妍花等:猪轮状病毒胶体金检测试纸条的研制及应用P o R V检出率为22.2%;文海燕等[9]基于T r i s辅助法制备胶体金颗粒,建立P o R V胶体金免疫层析方法,检测50份临床样品,与R T-P C R符合率为100%,但未进一步进行P o R V不同基因型及大量临床样本的检测㊂胶体金免疫层析作为一项成熟的免疫诊断技术,操作简单,耗时短,具有不可替代的优势㊂本研究旨在利用2株P o R V单克隆抗体开发胶体金检测试纸条,能够检测P o R V不同基因型,为P o R V的现场快速诊断提供有效的方法㊂1材料与方法1.1抗体、毒株和临床样品单克隆抗体4G5和5G4均由洛阳普泰生物技术有限公司制备㊁鉴定并保存;羊抗鼠I g G购自洛阳佰盛生物技术有限公司㊂P o R V O S U株(G5型)㊁P o R VF J株(G9型)㊁P o R V H u N Y Y-5株(G9型)㊁P o R V J X J A-9株(G3型)㊁P o R V J S S Q-3株(G4型)㊁T G E V㊁P E D V㊁P D C o V㊁猪伪狂犬病病毒(P o r c i n e p s e u d o r a b i e s v i r u s,P R V)和猪圆环病毒2型(P o r c i n e c i r c o v i r u s t y p e2,P C V2)病毒液均由国家兽用药品工程技术研究中心提供㊂猪肛拭子㊁粪便㊁肠内容物等临床样本均由洛阳普泰生物技术有限公司收集㊁鉴定和保存㊂1.2主要试剂和仪器氯金酸㊁柠檬酸三钠和B S A均购自S i g m a公司;硝酸纤维素(N C)膜购自M i l l i p o r e公司;玻璃纤维素膜(制备金标垫和样品垫)㊁吸水纸和P V C底板均购自上海金标生物科技有限公司;核酸提取试剂盒(磁珠法)由洛阳普泰生物技术有限公司提供; P o R V通用R T-P C R试剂盒购自博尔森生物科技有限公司㊂微孔板分光光度计(B i o T e kE p o c h2)购自美国伯腾仪器有限公司;数控裁条机(C T S300)㊁X Y Z三维化膜喷金仪(HM3030)均购自上海金标生物科技有限公司;三维喷点系统(X Y Z3060)购自百道贸易(上海)有限公司㊂1.3胶体金检测试纸条的制备1.3.1胶体金溶液的制备及选择采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,向锥形瓶中加入200m L超纯水和400μL10%氯金酸溶液,300ħ㊁300r/m i n加热搅拌至沸腾后加入适量1%柠檬酸三钠溶液,可观察到溶液由微黄迅速变为无色㊁灰色,最后稳定为透亮的红色㊂持续沸腾10m i n后停止加热,自然冷却至室温后加超纯水定容至原体积,即为制备好的胶体金溶液㊂按照此方法,依据不同的1%柠檬酸三钠添加量(分别为8和4m L)分别制备两种胶体金溶液,观察胶体金溶液的颜色,并用微孔板分光光度计在400~700n m扫描并记录其最大吸收峰对应波长㊂根据氯金酸和柠檬酸三钠的比例与金颗粒大小的函数关系[10]可知,烧制的两种胶体金溶液粒径分别约为20和40n m㊂用两种胶体金溶液分别制备胶体金检测试纸条,测定梯度稀释的P o R VO S U株(G5型)病毒液,T G E V㊁P E D V㊁P D C o V病毒液和P o R V阴性肛拭子样品,观察检测结果㊂1.3.2标记条件确定用0.2m o l/L K2C O3或0.1m o l/L H C l调整胶体金溶液的p H为6.5㊁7.0㊁7.5㊁8.0㊁8.5和9.0,各取1m L分别加入金标单克隆抗体4G5至终浓度为3㊁6㊁12㊁24和48μg/m L㊂混匀后室温静置反应20m i n,加入2m o l/LN a C l溶液50μL混匀,室温静置30m i n,观察溶液颜色变化㊂选择溶液颜色未发生变化的最低抗体加入量,在此基础上增加20%为最适标记抗体量;选择溶液颜色未发生变化的最低p H为胶体金溶液标记的最适p H㊂1.3.3金标抗体的制备取p H8.0的胶体金溶液,按照1.3.2确定的标记条件进行标记,加入单克隆抗体后室温搅拌反应30m i n;加入10%的B S A 至终浓度为1%,室温搅拌封闭30m i n;4ħ㊁10000r/m i n离心10m i n,弃上清,复溶液复溶至原体积的20%制备金标抗体,4ħ保存备用㊂1.3.4检测抗体浓度确定将羊抗鼠I g G稀释至1.5m g/m L,将单克隆抗体5G4稀释至0.5㊁1.0和2.0m g/m L,分别包被于硝酸纤维素膜上作为质控线(C线)和检测线(T线),制备胶体金检测试纸条㊂检测稀释后的P o R V O S U株(G5型)病毒液和P o R V阴性肛拭子样品,确定检测抗体最佳工作浓度㊂1.3.5试纸条的组装将吸水纸㊁硝酸纤维素膜㊁金标垫和样品垫从上往下依次粘贴于P V C底板上,切条机裁切成每条4m m的宽度,装入卡壳内,组装好后密封㊁干燥㊁常温保存㊂1.4胶体金检测试纸条的评价1.4.1试纸条的检测和结果判定用棉拭子蘸取猪粪便㊁肠内容物或采集肛拭子于1m L样品稀释液中混匀,静置后取100μL上清加入检测孔, 10m i n后肉眼观察质控线(C线)㊁检测线(T线)位置显色㊂质控线㊁检测线均显色,判为阳性;仅质控线显色,判为阴性;质控线不显色,判为无效结果㊂1.4.2灵敏度测定取P o R V O S U株(G5型)病5221中国畜牧兽医51卷毒液(107.8T C I D50/m L)用样品稀释液进行梯度稀释,分别用试纸条进行检测,确定试纸条的灵敏度㊂1.4.3敏感性评价用试纸条检测P o R V F J株(G9型)㊁P o R V H u N Y Y-5株(G9型)㊁P o R V J X J A-9株(G3型)和P o R VJ S S Q-3株(G4型)病毒液,观察显色结果,分析试纸条的敏感性㊂1.4.4 特异性评价用试纸条检测T G E V㊁P E D V㊁P D C o V㊁P R V和P C V2病毒液,观察显色结果,分析试纸条的特异性㊂1.4.5重复性评价制备3批试纸条,分别测定中强阳浓度的P o R V O S U株(G5型)病毒液㊁T G E V㊁P E D V㊁P D C o V病毒液和P o R V阴性肛拭子样品,观察显色结果,分析试纸条的批内批间重复性㊂1.4.6热稳定性评价将试纸条在37ħ分别放置7㊁14㊁21㊁28和35d,取出后连同常温(2~30ħ)保存的同批次试纸条进行灵敏度测定和P o R V阴性肛拭子样品检测,观察显色结果,分析试纸条的热稳定性㊂1.4.7试纸条与R T-P C R方法符合率评价用试纸条和R T-P C R方法(按照商品化试剂盒操作说明书完成)同时检测50份猪粪便样品,计算两种方法的符合率㊂1.5试纸条的临床应用2022年7月-2022年8月,收集来自河南安阳㊁驻马店㊁濮阳㊁南阳及山西太原㊁大同等地区,共24个猪场的猪粪便㊁肛拭子和肠内容物样品共1249份,用试纸条进行检测㊂2结果2.1胶体金检测试纸条的制备2.1.1 胶体金溶液的制备及选择肉眼观察20n m粒径的胶体金溶液为透亮橙红色,40n m粒径的胶体金溶液为透亮酒红色(图1);微孔板分光光度计扫描可知,20和40n m粒径的胶体金溶液最大吸收峰对应波长分别为520和523n m㊂用不同粒径的胶体金溶液制备的试纸条,检测T G E V㊁P E D V㊁P D C o V病毒液及P o R V阴性肛拭子样品,结果均为阴性(图2);20n m胶体金制备的试纸条检测1ʒ250㊁1ʒ500稀释的P o R V O S U(G5型)病毒液,结果均为阳性,1ʒ1000为阴性,且整体显色较浅;40n m胶体金制备的试纸条检测1ʒ250㊁1ʒ500和1ʒ1000稀释的P o R V O S U(G5型)病毒液,结果均为阳性,且显色较深㊂因此,选择40n m粒径的胶体金溶液进行试纸条的制备㊂图120和40n m胶体金溶液F i g.120a n d40n mc o l l o i d a l g o l d s o l u t i on+,阳性;ʃ,弱阳;-,阴性㊂下同+,P o s i t i v e;ʃ,W e a k l y p o s i t i v e;-,N e g a t i v e.T h e s a m e a s b e l o w 图220和40n m胶体金溶液制备试纸条对比F i g.2C o m p a r i s o n o fs t r i p s p r e p a r e d b y20a n d40n mc o l l o id a l g o l d s o l u t i o n2.1.2标记条件确定如表1所示,为不同条件对应胶体金溶液的颜色变化㊂本试验条件下,金标单克隆抗体4G5终浓度为12μg/m L以下时不足以稳定胶体金,出现颜色变蓝的现象;因此最低抗体用量为12μg/m L,在此基础上增加20%,即最佳抗体标记量为14.4μg/m L;配对最适胶体金溶液p H为8.0~9.0,因此胶体金溶液最适p H为8.0㊂2.1.3检测抗体浓度确定由表2可知,T线包被单克隆抗体5G4浓度为0.5m g/m L时,测定中强阳浓度的P o R V病毒液显色较浅;浓度为1m g/m L时,显色较深,且背景干净;浓度为2m g/m L时背景较红,临床测样时存在干扰T线判读的风险;因此确定单克隆抗体5G4的最佳工作浓度为1m g/m L㊂62213期李妍花等:猪轮状病毒胶体金检测试纸条的研制及应用表1 胶体金溶液最佳抗体标记量(4G 5)和最适p H 的确定T a b l e 1 D e t e r m i n a t i o no f t h e o p t i m a l a n t i b o d y l a b e l i n g a m o u n t (4G 5)a n do p t i m a l p Hf o r c o l l o i d a l g o l d s o l u t i o n 抗体浓度C o n c e n t r a t i o no f a n t i b o d y /(μg /m L )pH 6.57.07.58.08.59.03变蓝变蓝变蓝变蓝变蓝变蓝6变蓝变蓝变蓝变蓝变蓝变蓝12变蓝变蓝变紫酒红色酒红色酒红色24变蓝变紫酒红色酒红色酒红色酒红色48变紫变紫酒红色酒红色酒红色酒红色表2 检测抗体浓度的确定T a b l e 2 D e t e r m i n a t i o no f c o n c e n t r a t i o no f t h e d e t e c t i o na n t i b o d y T 线抗体浓度A n t i b o d y c o n c e n t r a t i o no f d e t e c t i o n l i n e /(m g/m L )P o R V 阴性肛拭子N e ga t i v e a n a l s w ab 背景B a c k gr o u n d 0.5ʃ-干净1.0+-干净2.0+-较红2.2 胶体金检测试纸条的评价2.2.1 灵敏度测定试纸条检测1ʒ250㊁1ʒ500㊁1ʒ1000和1ʒ2000稀释的P o R V O S U株(G 5型)病毒液(107.8T C I D 50/m L ),结果均为阳性,1ʒ4000稀释结果为阴性(图3),因此试纸条检测P o R V O S U 株(G 5型)的灵敏度为104.5T C I D 50/m L㊂图3 试纸条灵敏度检测结果F i g .3 T h e s e n s i t i v i t y r e s u l t s o f t e s t s t r i ps 2.2.2 敏感性评价用试纸条检测P o R V F J 株(G 9型)㊁P o R V H u N Y Y -5株(G 9型)㊁P o R VJ X J A -9株(G 3型)和P o R VJ S S Q -3株(G 4型)病毒液,结果均为阳性(图4),表明试纸条的敏感性良好㊂2.2.3 特异性评价用试纸条检测T G E V ㊁P E D V ㊁P D C o V ㊁P R V 和P C V 2病毒液,结果均为阴性(图5),表明试纸条特异性良好㊂A ,P o R VF J 株(G 9型);B ,P o R V H u N Y Y -5株(G 9型);C ,P o R VJ X J A -9株(G 3型);D ,P o R VJ S S Q -3株(G 4型)A ,P o R VF J s t r a i n (G 9g e n o t y pe );B ,P o R V H u N Y Y -5s t r a i n (G 9g e n o t y p e );C ,P o R V J X J A -9s t r a i n (G 3g e n o t y p e );D ,P o R VJ S S Q -3s t r a i n (G 4g e n o t y pe )图4 试纸条检测P o R V 不同基因型毒株的结果F i g .4 T h ed e t e c t i o nr e s u l t so fd i f f e r e n t g e n o t y p i c s t r a i n so f P o R Vb y t e s t s t r i ps 2.2.4 重复性评价用3批试纸条检测相同稀释度的P o R V O S U 株(G 5型)病毒液,结果均为阳性,且批内和批间T 线显色强度差异不大(图6);测定T G E V ㊁P E D V ㊁P D C o V 病毒液和P o R V 阴性肛拭子样品,结果均为阴性㊂表明试纸条批内批间重复性良好㊂2.2.5 热稳定性评价测定结果表明,试纸条在37ħ放置0~35d ,灵敏度不变,且P o R V 阴性肛拭子样品测定结果均为阴性,表明试纸条热稳定性良好㊂7221中国畜牧兽医51卷图5 试纸条特异性检测结果F i g .5 T h e s p e c i f i c i t y r e s u l t s o f t e s t s t r i ps 图6 试纸条重复性检测结果F i g .6 T h e r e p e a t a b i l i t y r e s u l t s o f t e s t s t r i ps 2.2.6 试纸条与R T -P C R 方法符合率评价检测50份猪粪便样品,试纸条检出阳性39份㊁阴性11份;R T -P C R 检出阳性40份㊁阴性10份(表3)㊂两种方法的差异在1份R T -P C R 测定条带较弱的样品,试纸条检测结果为阴性㊂试纸条与R T -P C R 方法的阳性符合率为97.5%(39/40),阴性符合率为100%(10/10),总符合率为98%(49/50)㊂表3 试纸条与R T -P C R 方法的比对结果T a b l e3 C o m p a r i s o nr e s u l t so ft h et e s ts t r i p a n d R T -P C R m e t h o d 试纸条结果S t r i p r e s u l t s R T -P C R 结果R T -P C Rr e s u l t s 阳性P o s i t i v e 阴性N e g a t i v e 合计T o t a l 阳性P o s i t i v e 39039阴性N e ga t i v e 11011合计T o t a l 4010502.3 试纸条的临床应用试纸条检测24个猪场收集的猪粪便㊁肛拭子和肠内容物样品共1249份,检出P o R V 阳性65份,检出率为5.2%,说明猪场内存在一定程度的P o R V 感染情况㊂3 讨论R V 分类工作小组根据病毒表面的V P 7和V P 4蛋白将R V A 分为不同的G 基因型和P 基因型,目前在人和动物的R V A 中已经发现有42个G 基因型和58个P 基因型[11]㊂P o R V 是引起仔猪和成年猪腹泻的常见病原之一,主要流行的G 基因型有G 3㊁G 4㊁G 5㊁G 9和G 11及配对的P 基因型通常为P [6]㊁P [7]㊁P [13]㊁P [19]和P [23],而G 1㊁G 2㊁G 6㊁G 8㊁G 10㊁G 12和G 26基因型及配对的P [5]㊁P [8]㊁P [11]㊁P [14]㊁P [26]㊁P [27]㊁P [32]和P [34]偶有发现[12]㊂P a p p 等[13]对1976-2011年间全球发表的55篇原创文章中的1672份A 群P o R V 阳性样品进行分析,在所有G 基因型中,G 5为全球主要流行基因型,占比45.8%,其次为G 3和G 4,分别占11.2%和9.6%㊂近年来,G 9型P o R V 的检出率呈现上升趋势㊂X u e 等[14]对2013-2014年在山东地区收集的226份仔猪腹泻粪便样品进行检测,P o R V 阳性率为28.76%,对其中5份阳性样品进行测序分析,结果显示均为P o R V A 群,V P 7基因型为G 3㊁G 5和G 9型,其中G 5和G 9为主要的基因型㊂周群等[15]对2017-2019年间四川14个地区40多个猪场的300多份仔猪腹泻样品进行分析,检出98份A 群P o R V 阳性样品,其中G 9基因型占41%,G 5㊁G 4和G 3分别占28.2%㊁23%和2.7%㊂P o R V 流行基因型的复杂性给诊断方法带来了挑战,越来越多学者进行P o R V 不同基因型的检测研究㊂黄小波等[16]建立双抗体夹心E L I S A 法,实现了对P o R V O S U (G 5型)毒株的检测;崔晓辰[17]建立了胶体金免疫层析法,能检测P o R V O S U 株(G 5型)和P o R VJ S 株(G 9型)㊂但临床上P o R V 基因型较为复杂,这两种方法都可能会造成漏检㊂本研究使用的一对单克隆抗体制备的胶体金检测试纸条,检测P o R V O S U 株(G 5型)灵敏度为104.5T C I D 50/m L ,针对P o R V 其他不同基因型毒株如P o R V F J 株(G 9型)㊁P o R V H u N Y Y -5株(G 9型)㊁P o R VJ X J A -9株(G 3型)和P o R VJ S S Q -3株(G 4型)均可82213期李妍花等:猪轮状病毒胶体金检测试纸条的研制及应用检出,在针对P o R V复杂基因型的检测上具有一定的优势㊂并且本研究对胶体金颗粒的粒径进行了筛选,一定程度上提高检测灵敏度,都有助于降低临床上的漏检率㊂本研究使用的胶体金免疫层析法的显色原理是依靠胶体金颗粒聚集于检测线位置上出现颜色信号,粒径较大的胶体金颗粒可以在一定程度加深显色,但是颗粒过大时又会出现空间位阻现象,从而降低检测灵敏度㊂一般当标记的蛋白为较小的抗原时,会采用粒径较小的胶体金[18],但在实际应用中需根据试验结果进行选择㊂谢艳君[19]利用不同量的柠檬酸钠烧制16.70㊁27.24和32.14n m的胶体金颗粒制备试纸条,试验结果表明粒径较大的胶体金显色比小粒径深,通过更低的检测线包被抗原量即能达到与小粒径相同的检测效果,即32.14n m 胶体金颗粒制备试纸条包被的抗原浓度最低㊂C h i o 等[20]利用侧流免疫层析法(L F A)优化双结合垫的胶体金粒径,第一和第二结合垫分别使用10㊁20n m 以及10㊁20㊁40和60n m的胶体金颗粒;结果表明第一结合垫10或20n m,第二结合垫的胶体金颗粒均为40n m时显色最深㊁灵敏度最佳㊂本研究还发现,胶体金粒径40n m以下随着粒径增大,显色加深,空间位阻减小,胶体金溶液稳定性更好,40n m 为最佳条件㊂以上均与本研究结果一致,即40n m 金颗粒制备胶体金试纸条灵敏度更好,且与T G E V㊁P E D V㊁P D C o V㊁P R V和P C V2无交叉反应,特异性较好㊂刘兆磊等[21]选择10n m的金颗粒制备胶体金试纸条检测A群P o R VJ L94株,最低限为1ʒ32稀释(T C I D50是10-6.25/0.1m L),灵敏度不及本研究制备的试纸条,可能是由金颗粒或者毒株的差异引起的㊂在此基础上,本研究利用40n m胶体金颗粒制备的试纸条进行了P o R V的临床诊断应用㊂胶体金层析技术检测P o R V虽然已经有部分论文发表,但是测定的临床样本量都较少㊂崔晓辰[17]制备胶体金试纸条对中国部分省市送检的37份仔猪腹泻粪便病料进行P o R V测定并与韩国试纸条进行比对,符合率为91.7%;严昊等[22]对临床收集的107份猪粪便样品利用制备的胶体金免疫层析试纸条与常规R T-P C R同时进行P o R V测定,总符合率为100%;本研究利用制备的胶体金试纸条测定50份猪粪便样品,同时与R T-P C R进行对比,阳性符合率为97.5%(39/40),阴性符合率为100%(10/10),总符合率为98%(49/50),符合率较高㊂并且本研究对制备的胶体金试纸条进行了进一步的临床评价,检测2022年7月-2022年8月在河南和山西省猪场收集的1249份猪粪便㊁肛拭子和肠内容物样品,阳性率为5.2%㊂1981年中国首次报道从发病猪粪便中分离到P o R V[23],随后该病毒在全国范围内流行㊂有研究统计该病毒在腹泻样品中的阳性率为3.8%~68.4%,在无腹泻症状猪群的阳性率为0~31.7%[24]㊂徐丽华等[5]对2011-2017年浙江省猪病毒性腹泻病进行调研,R T-P C R 结果显示,P o R V的阳性率为17.67%㊂朱子健等[25]利用巢式R T-P C R方法对2015 2016年间东北地区88个猪场的粪便样品进行检测,P o R V的阳性率为25.76%㊂本研究的P o R V阳性检出率略低,分析原因,一方面由于收样季节集中在夏季,而P o R V的流行呈现季节性,一般在晚秋㊁冬季㊁早春等天气寒冷㊁潮湿时易暴发,其他季节为偶发或零星散发[26];另一方面因为胶体金免疫层析法具有快检的优势,但敏感性不及核酸检测法㊂4结论本研究利用2株P o R V单克隆抗体研制P o R V 胶体金检测试纸条,可用于P o R V G5㊁G9㊁G3㊁G4型毒株的检测,结合胶体金检测试纸条简便快速㊁准确高效的优势,适用于该病毒的临床快速检测,为猪腹泻类疫病整体解决方案的制定提供了有效的方法㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] V A N C O T TJ 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猪瘟胶体金快速诊断试纸条的研制

ｔｇａｈｓａ（Ｃ）ｓｄｖｌｐｄｂｓｎｈｅｕｉｇｍｅｈｄｏｉｒｃａｉｏｉｍｒｐｒｏｌｉａｏｒｐｙａｓｙＧＩＡｗａｅｅｏｅｙｕｉｇｔｅｒｄｃｎｔｏｆｃｔｉｃｄｓｄｕｐｅａｅｃｌｄｌｏｐｒｉｌｓｎｕｉｃｔｎｈｏｌｉａｏｄｐｒｉｌｓｗｉｈｔｅＣＳａｔｂｄ．ＴｈｏｄａｔＣＳＶｒａｔｅ，ａｄｐｔｆａｉｇｔｅｃｌｄｌｇｌａｔｅｔｈＦｎｉｏｙｃｉｏｃｅｇｌ－ｎｉＦｗｅｅ — ｗｒｐｅｎｏｇａｓｉｅｅｂａｃ，ａｄｔｅｐｒｆｅＦａｔｂｄｎｏｔａｔ～ａａｔｂｄｒａｐｄｏｔｌｓｆｒｍｍｒｎｅｂｎｈｕｉｄＣＳｎｉｏｙａｄｇａ— ｎｉｒｔｎｉｏｙｗｅｅｉｗｒｐｅｎｎｔｏｅｌｌｓｍｂａｅｔｒｐｒｉｆｒＣＦｄａｎｓｓ７ａｐｅｒｅｅｔｄｆｒａｐｄｏｉｒｃｌｏｅｍｅｒｎｏｐｅａｅａｋｔｏＳｉｇｏｉ．０ｓｍｌｓｗｅｅｄｔｃｅｏｕＣＳＦＶｙｔｅｒｐｄｄａｎｓｓｓｒｐ，ｏｉｈ２ｏｉｖａｅｒｅｅｔｄａｄｖｒｓｉｌｔｎａｄｉｅｔｉｂｈａｉｉｇｏｉｔｉｆｗｈｃ６ｐｓｔｅｃｓｓｗｅｅｄｔｃｅｎｉｕｏａｉｎｎｉ — ｉｓｏｄｆ
症病毒进行检测，无交叉反应．关键词：猪瘟；抗体；体金；胶试纸条；硝酸纤维素膜

瘦肉精(盐酸克伦特罗)快速检测卡

猪瘟抗体快速检测试剂盒——（胶体金法）使用说明书一、原理：本试纸采用酶联免疫原理和胶体金层析技术制成快速检测猪血清中的猪瘟抗体。

将猪瘟抗原包被在硝酸纤维素膜的检测线（T）上，兔抗猪瘟抗体包被在硝酸纤维素膜的质控线（C）上，用胶体金标记的猪瘟抗原干燥后置于玻璃纤维素膜下端。

当血清加入加样孔内，由于层析的原理，血清开始沿纸条移动，当遇上干燥的金标抗原，将其溶解，并带着金标抗原继续往上移动，至硝酸纤维素膜的检测线。

如果样品中有猪瘟抗体存在时，会与玻璃纤维素上的金标猪瘟抗原和包被在检测线上的猪瘟抗原，在检测上形成一个夹心的免疫复合物，呈一条紫红色线。

样品中的抗体越高，色线颜色越深，判定为阳性。

如果样品中没有猪瘟抗体，检测线（T）线上没有色带出现，判定为阴性。

样品和金标抗原继续往上移至质控线时，此处的兔抗猪瘟抗体将会同金标猪瘟抗原结合，在质控线（C）上形成一条紫红色线，证明本试纸有效。

整个试验仅需20分钟。

操作简便、快速、准确、灵敏度高，直观、结果容易判定。

二．产品组成：1、检测卡(1个)：由一特制的塑料检测卡将猪瘟抗体检测试纸条夹于卡内，卡面上设有加样孔和观察孔。

加样孔作为加入待检血清，观察孔内为试剂检测线（T），试剂质控线（C）。

一个检测试剂卡用一个铝箔袋包装，内装干燥剂。

2、吸样管1个；3、5份塑料手套；4、使用说明书一份。

三．操作方法：1．用1.5ml样品管，采血0.5~1ml待检测血清自然析出或用离心机离心10分钟左右，使血清析出。

2．将检测卡平置于桌面上，用吸样管吸取被检血清，在检测卡的椭圆形加样孔内加入2滴约80~100ul。

在室温下反应20分钟判定结果。

（检测卡如在4℃保存，必须恢复至室温后方可进行检测）四．结果判断：1．阳性：在检测线（T）处，质控线（C）处，各出现一条紫红色条带，判定为阳性；检测线（T）处条带色泽的深浅，依检测样品中猪瘟抗体效价的高低而变化，效价越高色带越深，反之越浅。

免疫层析快速诊断试纸条在猪病诊断上的应用

特异性强。并可在１ｉ以内很直观５ｒｎａ
标记技术（ｍｎ —ｏｄｌｅｉｃ．ｉｕｅｇｌａｌｎｔｈｍｂｌｇｅ
ｎｑｅ。自１７年Ｆｕ与Ｔｙｏ￣￣胶ｉｕ）９１ａｌｋａｌＪｒｒ
地判断出待测物的有无，大大提高了
景。现就该技术的原理、法、用和方应
发展前景做一简要综述。
１免疫层析快速诊断试纸条的基本原理免疫层析快速诊断试纸条是利用
泛的应用，尤其是在医学临床检验中
收稿日期：０Ｏ０一４２ｌ一５Ｏ基金资助：山东省科技攻关项目“ 四种重猪大疫病快速诊断技术研究” 课题号，
１ｉａｇｌｔｈｉｕ。Ｃ就是免疫金ｏｌｏｃｎｑｅＩＧ）ｄｄｅ
的应用，早孕、如乙肝、生虫、病和寄性
深，品中的被检测蛋白水平越高。样３免疫层析快速诊断试纸条在
病毒细菌病的检测。方法操作简单、该
体金标记技术以来．胶体金被引入免
疫化学中，为继荧光标记、标记和成酶放射性免疫标记之后的一种新型的免疫标记技术。免疫胶体金标记技术主
面的应用起步较晚，最近几年才有报道。免疫胶体金层析技术现已成为当．今最快速、敏感的免疫学检测技术之

基于p54的非洲猪瘟抗体胶体金检测方法建立

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：为了建立一种能快速检测非洲猪瘟的免疫胶体金方法，本实验根据非洲猪瘟病毒（ASFV ）的p54基因的成熟肽序列，设计了有终止子（p54）和无终止子（p54-his ）的基因片段，并分别在pET30a 载体中进行表达；将纯化后p54或p54-his 免疫ASFV 抗体阴性猪，制备相应多克隆抗体，4次免疫后用p54-his 或p54检测多克隆抗体效价；根据胶体金免疫层析原理，用金颗粒标记纯化的p54抗原作为金标垫，SPA 为检测线、p54多克隆抗体为质控线，优化条件，制作胶体金免疫层析试纸；最终用p54-his 的多克隆抗体检验试纸条的检测可行性。

结果显示，p54和p54-his 均能在pET30a 表达系统中可溶性表达，免疫猪后可产生特异性抗体，效价达10-6；以0.3 mg/mL p54抗原作金标垫、1 mg/mL SPA 为捕捉抗原、0.5 mg/mL p54多克隆抗体为质控线制作的试纸条能有效检出p54-his 抗体阳性血清。

表明建立的胶体金试纸条能作为非洲猪瘟抗体的快速检测方法进一步推广应用。

关键词：非洲猪瘟；p54；胶体金；原核表达中图分类号：S852.651文献标志码：A文章编号：1674-6422（2021）06-0050-05Development of P54 Based Colloidal Gold Detection Method for Detection ofAfrican Swine Fever Antibodies收稿日期：2021-09-05基金项目：2019“青蓝工程”中青年学术带头人资助项目（00000219011）；2019江苏省教育厅重大项目及校级配套支持项目（19KJA520008，NSFZP202103）作者简介：戴建华，男，副教授，主要从事动物传染病与生物制药研究通信作者：基于p54的非洲猪瘟抗体胶体金检测方法建立戴建华，王豪伟，张紫菡（江苏农牧科技职业学院，泰州225300）2021,29(6): 50-54DAI Jianhua, WANG Haowei, ZHANG Zihan(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China)Abstract: In order to develop a colloidal gold method for rapid detection of African swine fever virus (ASFV), peptide fragments with terminator (p54) or without terminator (p54-his) were designed according to the published p54 gene sequence and expressed in pET30a vector in the prokaryotic expression. The puriﬁ ed p54 or p54-his was used to immunize pigs without ASFV antibodies. After 4 times of immunization, p54-his or p54 was used to respectively detect the titers of polyclonal antibodies. According to the principle of colloidal gold immunochromatography, the puriﬁ ed p54 antigen labeled with gold particles was set as the gold standard pad and SPA as the detection line while anti-p54 polyclonal antibodies was set as the quality control line. The conditions were optimized to prepare colloidal gold strips. Finally, serum samples with anti-p54-his polyclonal antibodies were used to check the feasibility of the strips. The results showed that both p54 and p54-his were expressed in pET30a in soluble form and induced speciﬁ c antibodies with titers of 10-6. The optimized reaction conditions included gold strips with 0.3 mg/mL p54 as gold standard pad, 1 mg/mL SPA as capture antigen and 0.5 mg/mL anti-p54 polyclonal antibody as quality control line. The results showed that the colloidal gold test strips could be applied as a rapid detection method for antibody detection of African swine fever.Key words: African swine fever; p54; colloidal gold; prokaryotic expression· 51 ·第29卷第6期戴建华等：基于p54的非洲猪瘟抗体胶体金检测方法建立非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病，对全世界养殖业造成了严重威胁[1-2]。

猪瘟抗体检测试纸研发及制备工艺的优化

的工艺参数，使试纸的准确性、灵敏度及稳定性满足批量生产要求。该试纸在室温干燥条件下可稳定保存
1 a 以上，为实现猪瘟抗体检测试纸的商业化及广泛应用奠定基础。
关键词猪瘟 ; 抗体 ; 试纸；优化
法之一。同样，免疫层析技术也被应用于猪瘟抗
体检测中，
体试纸相继被报道 [56]，但
在实际
，
体试纸产品的应用并
普遍，究其原因，
体试纸的准
确性及稳定性备受质疑，在基层使用
常常
出现假信号及试纸失效等问题，严重制约该方法
体
定基
收稿曰期：2018-08-12 修回曰期：2018-11-07 基金项目：国家重点研发重点专项（2016YFD0500707) 。第一作者：孙亚宁，女，博士，研究方向为学。E-mail: happylsht@ 163. com 通信作者：张改平，男，研究员，研究方向为动物学。E-mail: zhanggaip@ 126. com
多国家已成功实现猪瘟净化，
仍：
重危害养猪业的重大传之一，存在不间断流
行[3] 。监
体能准确掌握猪群的
体
水“ ，对疫苗免疫效果作出评价，因此，建立一种
快速简单的方法在
意义重大。猪
体技术包括
和试验、酶

应用免疫金标试纸开展种猪群猪瘟净化

福建畜牧兽医第34卷第1期2012年猪瘟是一种急性、烈性、毁灭性、病毒性传染病。

近年来随着免疫抑制性病毒病的流行，尤其是圆环病毒、蓝耳病毒对猪群造成很大的威胁，病毒抑制了猪机体的免疫器官功能，造成猪只注射了猪瘟疫苗产生不了对应性的免疫抗体，造成猪瘟的暴发和流行。

从最近厦门地区许多猪场求诊的病例分析，大多数猪群都因感染了圆环病毒、蓝耳病毒，也最终暴发猪瘟死亡，损失严重。

但是，如果猪群有较高水平的猪瘟抗体，即便感染了蓝耳病毒、圆环病毒，其死亡率也会大大降低。

建立无猪瘟病毒猪场，首先应加强猪场的隔离消毒，防止猪瘟病毒传入，更要重视本场内猪瘟净化，以消灭内源性病毒。

当前有许多种猪携带猪瘟病毒，本身不发病，虽然经过猪瘟疫苗的多次免疫，但体内却不产生猪瘟抗体或抗体水平很低，但产下的小猪往往带有很强的猪瘟病毒，在猪场引起垂直传播和水平传播。

因此，对种猪场和自繁自养猪场种猪群的猪瘟净化尤为重要。

如果种猪群能保持较高水平的猪瘟免疫抗体，就能有效地保证猪群不发生猪瘟，因此，开展猪瘟免疫抗体监测尤其重要。

1免疫金标试纸检测猪瘟抗体应用酶联免疫原理和胶体金层析技术制成快速检测猪瘟抗体的免疫金标试纸，试纸由加样区、检测区和吸水区三个部分组成。

将猪瘟抗原和免疫猪瘟抗体分别包被在检测区的检测线（T）和对照线（C）上，并在加样区包被胶体金标记的猪瘟抗原，组成免疫金标试纸。

2操作方法和判定标准2.1采血取血清对公猪、后备母猪都必需耳静脉采血分离血清，编号冷藏；对经产母猪可以耳静脉采血或母猪分娩时取仔猪脐带血分离血清编号冷藏再进行抗体检测。

2.2操作方法对采集的血清按照已发布的福建省地方标准（猪瘟抗体金标试纸检测方法DB35/ 916-2009）操作。

具体操作是：撕开铝箔袋，将检测卡平放于桌面上，在检测卡的圆形加样孔（S)内加入100uL待检样品（血液或血清)，室温下静置15min 后判定结果。

2.3判定标准无效：在对照线（C）都不出现紫色带，判定试验无效。

用猪瘟免疫金标试纸条诊断非典型猪瘟

用猪瘟免疫金标试纸条诊断非典型猪瘟
林伯全
【期刊名称】《福建畜牧兽医》
【年(卷),期】2002(024)0z1
【摘要】目前以非典型、低龄化和散发性为特点的非典型猪瘟在我省各地常发生,对猪瘟抗体检测的方法中,如Dot-ELISA法及间接血凝法等,其特异性和敏感度上具有许多优点,但检测的时间至少需要4h,有的还受到实验室条件的限制.本文应用猪瘟免疫金标试纸条(由福建省畜牧兽医总站动物疫病诊断中心提供),能在(10～15)min出现检测结果.通过对猪瘟免疫抗体的状态的了解,结合流行病学和临床特点,有助于对非典型猪瘟的快速诊断.……
【总页数】1页(P28)
【作者】林伯全
【作者单位】福建省农业干部学校,350007
【正文语种】中文
【中图分类】S8
【相关文献】
1.用于检测猪瘟抗体的免疫金标试纸条的研制与应用研究 [J], 黄印尧;张长弓;方莹;金颜辉
2.应用猪瘟抗体免疫金标试纸检测猪瘟抗体的比较试验和改进试验 [J], 周铁忠;张利勃;刘丽影;曹丽;李晓卫;张东野;李永深;赵颖;李晓娥;郝运河;谷波
3.猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用 [J], 付连军;姜成;李沐森
4.非洲猪瘟病毒胶体金免疫层析试纸条的研制 [J], 邬旭龙;刘波;王印;张鹏飞;江地科;肖璐
5.猪瘟抗体免疫金标试纸条在预防猪瘟中的应用 [J], 冯太兰;秦定益;李文良
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光度计测定提纯抗体的浓度并调整至１／Ｌｍｇｍ。用
双向琼脂扩散法测其效价，冷冻保存。
１８
ＪｕｎｌｆＡｎｍａｃｅｃｎｔｒａｙＭｅｉｉｅｏｒａｉｌＳｉｎｅａｄＶｅｅｉｒｄｃｎｏｎ
Ｖｏ．０１３
Ｎｏ３．
２１０１
２２胶体金溶液的制备．
２３３胶体金与蛋白质的结合．．按上述方法确定两种试剂的最适用量比例后，
取００．１％氯金酸水溶液１０ｍＬ０，加热至沸，搅动下准确加入１柠檬酸三钠水溶液０７ｍ，％．Ｌ金黄色氯金酸水溶液在２ｍｎ内变为紫红色，续煮ｉ继沸１ｉ，却后以蒸馏水恢复到原体积，５ｍｎ冷如此制备的金溶胶其直径在１ｍ左右。５ｎ
ａｉｈｏｄｒｐｒｔｎｏｏｌｉａｏｄ，ｔｈｏｅ１ｍｏｌｉａｏｄｌｂｌｇｏｂｉａｔｓｉｅｆｖｒｖｒｓａｔｏｉｓｓｅｌｃｄｃｌｒｅｐｅａａｉｆｌｄｌｇｌｏｃｏｓ５ｎｃｌｄｇｌｅｉｆｒｂｔｎｉｗｎｅｅｉｎｉｄｅ，ａｓｍｂｙｉｏｃｏｏｌａｎａ — ｕｂｉｍｍｕｏｈｏｔｇａｈｃｄｐｔｋ，ｗｉｈｗａｓｄｔｅｅｔｓｓｉｉｕｆｃａｓｃｌｓｉｅｆｖｒｖｒｓｂｅｔｓｒ．Ｔｅｒｓｌｈｗｅｎｃｒｍａｏｒｐｉｉｓｉｃｈｃｓｕｅｏｄｔｃｕｐｃｏｓｏｌｓｉａｗｎｅｅｉｙｔｓｔｐｕｉｈｅｕｔｓｏｄｓ
畜牧兽医杂志
第３０卷
第３期
２１０１年
１７
猪瘟快速诊断金标试纸条的研制及应用
付连军，姜成，沐森李
（吉林农业科技学院动物医学学院，３１１１２０）
摘要：用胶体金免疫层析技术，运建立一种操作简单、异性好、特灵敏度高，适合临床诊断的检测
瘟病５２０００－５［作者简介］付连军（９８）男，１６．，吉林省人，硕士，兽医师，主要从事ｆ临床诊断工作。
的血清用辛酸一硫酸铵盐析法提纯，用紫外分光采
剂均为国产分析纯化学试剂。
１６种传染病之一，被我国动物卫生法规列为一类传
染病。从发现猪瘟起，养猪国家都致力于消灭猪各瘟并取得了显著成效。猪瘟的常规实验室诊断方法有很多种，是这些诊断方法不同程度地存在费时、但
２方法
２１兔抗猪瘟抗体（．一抗）制备、的纯化及检测采用猪瘟兔化弱毒疫苗免疫家兔（０只３次）１
病毒多抗，制备胶体金免疫层析试纸条，以期寻找出
一
种费用低、敏度高、度快、用便捷的检测猪灵速使
ｏａｓｃｌＳｎｅＦｅｅｒｆＣｌｓｉａｗｉｖｒＶｉｕｓ
Ｆｉ－ｎＪＮｈｎＬ —ｅＵＬａｊ，ＩＧＣｅｇ，ＩＭｕｓｎｎｕＡ
（ｏｌｅｏｅｒａｙＭｅｉｉ，ｉｎＡｒｕｔｒｌｃｎｅａｄＴｃｎｌｙＣｌｇ，ｈｎｃｕｉｎ１２０，Ｃｉ）ＣｌｇＶｔｉｒｄｃｅＪｌｇｉｌａｉｃｎｅｈｏｇｏｅｅＣａｇｈｎＪｌ３１１ｈｎｅｆｅｎｎｉｃｕＳｅｏｌｉａ
ｔｏａｅｈｅｕｔｈｗｄｔａｈｓｍｅｈｄｃｎｄｔｃｗｉｅｆｖｒｖｒｓｎａｅｃｒｉｄｏｔｏｐｏｔｈｓｇ．ｏｃｍｐｒ，ｔｅｒｓｌｓｏｅｈｔｉｓｔｔｏａｅｅｔｓｎｅｅｉ，ａｄｃｎｂａｒｕｒｍｏｅｔｅｕａｅｕｅｔＫｅｒｓ：ｃｌｉａｏｄ；ｉｙｗｏｄｏｌｄｌｇｌｏｍｍｕｏｈｏｔｇａｈｃｔｓ；ｃａｓｃｌｗｎｅｅｉｓｎｃｒｍａｏｒｐｉｅｔｌｓｉａｉｅｆｖｒｖｒｓｕ
费用高、操作复杂、需要特殊仪器和试验结果不能长
期保存等缺点。因此均无法进行推广。而免疫胶体
金技术是２世纪８００年代继荧光标记、放射性同位
素标记和酶标记三大标记技术后发展起来的固相标
记免疫测定技术。本研究采用胶体金标记兔抗猪瘟
至９０．。
离心４ｉ，０ｍｎ弃去上清液，得到的胶体金蛋白质结将
合物放入ｐ８２的ＴＳ液中，Ｈ．Ｂ溶即为包被了蛋白质的金溶胶，即金标兔抗猪瘟抗体，￣也４Ｃ保存。
２４试纸条的装配．
２３２胶体金与待标记蛋白质用量比例的确定．．
混合均匀。２３２３放置５ｍｎ后，．．．ｉ在上述各管内加入０１ｍ．Ｌ
用００ＬＬ，Ｈ．．５ｍｏ／ｐ８５的ＴＳ稀释胶体金标记Ｂ
抗体，分混匀后，吸水纤维浸入胶体金标记抗体充将
猪瘟病毒的方法。本文通过采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金，择１ｍ胶体金标记兔抗选５ｎ
猪瘟病毒抗体，装免疫层析试纸条。用试纸条对猪瘟可疑病料进行检测，果显示，组结用试纸条检
测猪瘟病毒，５ｉ右即可显示结果，与荧光抗体检测方法加以比较，果表明用此种方法可１ｍｎ左并结以检测猪瘟病，并且可以进行推广使用。
２３４胶体金标记蛋白的纯化．．
将胶体金标记抗体先用１５０ｒｍｉ速离心０／ｎ低２ｎ弃去沉淀，０ｍｉ，再将上清液以４，５００ｒｍｎ ℃ １０／ｉ
２３１１将兔抗猪瘟抗体蛋白质溶液以３００ｒ．．．０／ｍｉ，心２ｎ去除多余的盐离子及杂质。ｎ离０ｍｉ，２３１２用０１ｍｏ，Ｏ调节胶体金的ｐ值．．．．ｌＫＣ／ＬＨ
２３胶体金标记抗体的制备．２３１待标蛋白质和胶体金溶液的预处理．．
分别取所需量的胶体金和相应量的猪ＩＧ，搅拌ｇ在下将金溶胶液和抗体蛋白混合，０ｉ再加５％１ｍｎ后
ＢＡ使其最终浓度为１，止抗体蛋白和胶体金Ｓ％防聚合和沉淀。
关键词：体金；疫层析；瘟病毒胶免猪
［中图分类号］￥５．５［８２６１文献标识码］Ａ［文章编号］１０ —７４２１）３０１－３０４６０（０１０－０７０ＤｅｅｏｍｅｔａｄＡｐｉａｉｎｆＣｏｌｉｌＧｏｄＳｒｐｏｐｉａｎｓｓｖｌｐｎｎｐｌｔｏｏｌｏｄａｌｔｉｆｒＲａｄＤｉｇｏｉｃ
２３２１根据待标记蛋白质的要求，．．．调节胶体金溶液至ｐ９０后，装１Ｈ．分Ｏ管，每管１ｍ。Ｌ２３２．．．２将猪瘟ＩＧ用００５ｍＬＬｐ．ｇ．０ｏ／，Ｈ９０的硼酸盐缓冲液做系列稀释成１０～８ｇ０／ｍＬ分别，取１ｍＬ加入１管金溶胶内，照管加１ｍ对Ｌ稀释液，
ＡｂｔａｔＣｏｌｉａｏｄｉｓｒｃ：ｌｏｄｌｇｌｍｍｕｎｃｒｍａｏｒｐｉｅｈｏｏｙｗａｅｏｅｔｂｌｈａｓｍｐｅ，ｇｏｐｃｆｃｔｏｈｏｔｇａｈｃｔｃｎｌｇｓｕｓｄｔｓａｉｉｌｓｏｄｓｅｉｉｉｙ，ｈｉｈｓｎｉｖｔｎｄｇｅｓｔｉａｉｙｓｉａｌｅｅｔｏｅｈｄｏｌｎｃｌｄｉｇｏｉｌｓｉａｗｉｅｅｉｕｓＩｈｓｐａｅ，ｔｏｇｈｓｆｓｄｕｃｔａｅｔｅｔｒｈｕｔｂｅｄｔｃｉｎｍｔｏｆｃｉｉａａｎｓｓｃａｓｃｌｓｎｅｆｖｒｖｒ．ｎｔｉｐｒｈｒｕｈｔｅｕｅｏｏｉｍｉｒｔｏｒｓｏｅｔｅ
ｔａｐｓｉｋｔｓｉｔｌｓｉｌｓｎｅｅｉｕｓ，１ｎｏｏｔｉｐａｈｅｕｔｎｔｕｒｓｅｔａｔｂｄｙｄｔｃｉｎｍｅｈｄｓｈｔｄｉｔｃｅｔｎｇｗｉｈｃａｓｃａｗｉｅｆｖｒｖｒ５ｍｉｒｓｏｄｓｌｙｔｅｒｓｌｓａｄｗｉｈｆｏｅｃｎｎｉｏｅｅｔｏｔｏｌ