幽门螺杆菌IgG抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制
免疫胶体金试纸条的开发及应用
（2）提取
----称取1.0±0.05g均质物，加入1ml去离子水，加入 100μl提取剂1，加入100μl提取剂2，再加入4ml乙腈，涡 动2min，再加入4g无水硫酸钠，立即拧紧盖子，倒置轻 轻敲打，上下振荡1min，3000g以上，室温离心5min；
免疫胶体金试纸条的 开发及应用
目录：
1. 免疫胶体金试纸条原理及开发流程 2. 免疫胶体金试纸条的应用 3. 胶体金读数仪的发展及应用
一、免疫胶体金试纸条原理及开发流程
• 简单/现场/快速
特点
1.打开包装取出试纸条
2.滴加样品
3.结果判读（3-10min）
1、试纸条结构图
样品垫
胶体金垫
控制线（C线）
二、免疫胶体金试纸条的应用
应用领域 • 人医方面
如早孕检测，急性心肌梗塞的诊断……
• 非法添加物检测
如尿液中“瘦肉精”检测……
• 抗生素残留检测：
如牛奶中β-内酰胺类药物检测……
• 毒素类检测
如饲料中黄曲霉毒素检测……
• 毒品检测
如吗啡、病毒等检测
1. 以尿液中检测莱克多巴胺残留为例
1) 尿液的收集
----取1ml上清液至10ml新聚苯乙烯离心管中，加入100μl 孔雀石绿氧化剂（现加现配）。涡动5s，于50~60℃水浴 氮气或空气流下吹干； ----加入0.5ml样品稀释液涡动溶解2min，取70l用于分析。
2) 检测步骤
（1）从原包装中取出试剂桶，打开后取出所需数目的微孔试剂和 试纸条，并做好标记。 （2）用微量移液器吸取70l待检水产样本溶液于微孔中，缓慢抽 吸且充分与微孔中试剂混匀。 （3）室温孵育5min后，将标记好的试纸条插入微孔中——印有 “MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中。 （4）室温孵育5-10min后，取出试纸条并根据示意图判定结果， 其他时间判定无效。
实验一 免疫层析快速诊断技术(医学免疫学)
人类医学 各 级 医 院 , 血 传染病（乙肝五项,HIV, SARS等）
站,CDC,防疫站,诊 标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋
断中心；家庭自检；白等）
商检系统；边检口 岸；公安系统.
女性妊娠
HCG(早孕)
毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）
农牧业
畜牧兽医站, 商检 传染病（禽流感,链球菌等） 系统,边检口岸,农 病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等） 牧类院系和研究所
阳性 阳性
阴性
临床意义：
1、孕妇妊娠1周后，尿中可出现较多HCG，均可 呈阳性（+）反应，达到妊娠早期诊断的目的
2、绒毛膜上皮癌、水泡状胎块和睾丸畸胎瘤患者 的尿中HCG可明显增高，故也可呈阳性（+）反应， 但结合临床可予以鉴别。
注意事项
1. 强阳性尿液中 HCG 含量较多 , 因此质控线可能不出现 或极浅淡 , 而仅在反应区显示淡紫色条带。 2. 应避免试纸条一端插入尿液过深或过浅 , 插入时间过长 或过短也会影响试验结果。
胶体金（Colloidal gold）是氯金酸（HAuCl4） 的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合
成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为
一种稳定的胶体状态。
胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带 负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电 吸引而形成牢固结合。
胶 体 金 标 记 技 术 （ Immunogold labeling technique） 是 以 胶 体 金 作 为 示 踪 标 记 物 应 用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。
实验一
胶体金试纸条检测技术
胶体金试纸条检测技术
【实验目的】
掌握双抗体夹心法测定尿 HCG 的原理、操作方法及结果判定方法。
幽门螺杆菌抗体检查标准操作规程
幽门螺杆菌抗体检测试剂盒(胶体金法)标准操作规程1.产品名称:幽门螺杆菌抗体检测试剂盒(胶体金法)2.包装规格:24人份/盒 48人份/盒3.预期用途:用于检测试验血清中的幽门螺杆菌抗体(IgM/IgG)4.检验原理:用幽门螺杆菌抗原固相硝酸纤维素膜，应用渗滤式间接法原理，检测血清中幽门螺杆菌抗体。
5.主要组成成份:反应板 24份或48份试剂Ⅰ 1瓶 0.02mol/L PH 7.4 PBS试剂Ⅱ 1瓶胶体金标记物6.储存条件及有效期:产品应储存在2℃～8℃条件中，不能冷冻；有效期24个月。
7.样本要求:血清样品不能溶血，应为新鲜血清或2℃～8℃条件保存不超过一周。
高脂血症血清不能使用。
8.检验方法:滴入二滴试剂Ⅰ于反应板中央孔中，待完全渗入；滴入100μl血清于反应板孔中，待完全渗入；滴加三滴试剂Ⅱ于反应板孔中，待完全渗入；渗入三滴试剂Ⅰ于反应板孔中，待完全渗入。
9.结果解释:阳性：反应板孔中C端出现红色圆斑，T端出现红色圆斑，为幽门螺杆菌抗体阳性；阴性：反应板孔中C端出现红色圆斑，T端不出现红色圆斑，为幽门螺杆菌抗体阴性。
失效：反应板孔中C端不出现红色圆斑，或C端、T端均不出现红色圆斑，为试剂盒失效。
10.检验方法的局限性:本试剂试验仅用于检测幽门螺杆菌抗体而非直接检测幽门螺杆菌，因而阳性结果并不能确诊是幽门螺杆菌感染。
对患者状况的诊断应结合患者临床体征与症状和试验结果的综合分析。
抗体含量低的血清样品，不能被检测出来是可能的。
部份幽门螺杆菌感染的患者，不产生抗体或产生少量的抗体。
此时，可能显示阴性结果。
试验结果可疑时，应用培养基进行培养确诊。
11.产品性能指标:批内精密度：阳性符合率和阴性符合率均应≥95%，反应斑点颜色深浅程度应接近。
批间精密度：阳性符合率和阴性符合率均应≥95%。
12.注意事项:本产品尚未获得产品注册证号，仅供研究，不用临床诊断。
试验一旦开始操作，应按操作步骤连续进行，直至结束。
幽门螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒的生产(胶体金法)
幽门螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒的生产(胶体金法)
白月辉
【期刊名称】《中国社区医师（医学专业）》
【年(卷),期】2010(012)004
【摘要】目的:建立一种快速检测抗H.pylori IgG抗体的幽门螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒(胶体金法).方法:以柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条.结果:用柠檬酸还原法制备的胶体金溶液呈亮红色,以此试纸条检测临床血清标本.受检血清中抗Hp血清抗体IgG胶体金法中出现1条红色(对照)沉淀线,为血清学诊断阴性;出现2条红色(样品和对照)沉淀线,为血清学诊断阳性.【总页数】1页(P111)
【作者】白月辉
【作者单位】028000,内蒙古通辽职业学院药学院
【正文语种】中文
【相关文献】
1.4种幽门螺杆菌抗体检测试剂盒筛查幽门螺杆菌感染的性能研究
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5.人幽门螺杆菌尿素酶抗体诊断试剂盒的研制
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幽门螺旋杆菌抗体 胶体金 产品技术要求
幽门螺旋杆菌抗体胶体金产品技术要求下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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胶体金试纸条的制备
抗体与胶体金的偶联机制
抗体活性的保持
在抗体与胶体金结合过程中，应确保 抗体的活性不受影响，以保证检测的 灵敏度和特异性。
抗体与胶体金的结合是通过共价键或非共价 键实现的。共价键结合力较强，但不易解离 ；非共价键结合力较弱，但易于解离。
试纸条的制备工艺
基材选择与处理
选择合适的支持膜作为试纸条的基材，如硝酸纤维素膜、 聚酯膜等，并进行预处理，以提高其亲水性和结合力。
流感检测
在流感高发季节，胶体金试纸条可以快速检测流 感病毒抗原，为防控流感提供有力支持。
食品安全检测
农药残留检测
胶体金试纸条可用于检测果蔬等农产品中的农药残留，保障食品 安全。
兽药残留检测
通过胶体金试纸条检测肉类、禽蛋等食品中的兽药残留，有助于 监控食品安全，防止药物滥用。
重金属离子检测
用于检测食品中重金属离子的胶体金试纸条，能够快速、准确地 检测出食品中的重金属含量。
新材料的应用
高分子材料
研究新型高分子材料，提高试纸条的灵敏度、稳定性和耐用性。
纳米材料
利用纳米材料的特点，增强试纸条的信号放大效果和特异性。
生物材料
探索生物相容性更好的生物材料，降低试纸条对人体的潜在风险。
新技术的开发
免疫分析技术
研究更高效、特异的免疫分析技术，提高试纸条的检测准 确性。
微流控技术
环境监测
1 2
水质监测
胶体金试纸条可用于快速检测水体中的有害物质， 如铅、汞、砷等，确保水质安全。
大气污染监测
通过胶体金试纸条检测大气中的有害气体和颗粒 物，有助于及时发现和防控空气污染。
3
土壤污染监测
胶体金试纸条可用于检测土壤中的重金属和有机 污染物，为土壤污染治理提供依据。
幽门螺杆菌I精选抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制精编版
幽门螺杆菌I精选抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制文件编码（008-TTIG-UTITD-GKBTT-PUUTI-WYTUI-8256）幽门螺杆菌I g G抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制【摘要】目的建立一种快速检测抗 IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条，并优化制备中各关键步骤的实验条件。
方法以柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金溶液，葡萄球菌A蛋白（SPA），制备免疫胶体金复合物，组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。
结果用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色。
胶体金标记SPA的最低稳定浓度5μg/ml，最适稳定量为6μg/ ml。
SPA标记的最适pH为。
以此试纸条检测血清标本与进口ELISA试剂盒比较，组间阳性率比较差异无显着性。
结论胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关，而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。
【关键词】幽门螺杆菌；胶体金；免疫层析检测Research on development of gold immunochromatographic test kit for serum antibody IgG【Abstract】 Objective Developing gold immunochromatographic test kit for serum antibody IgG and optimize the key experiment Preparing the colloid gold particles of 20 nm which were coupled with Streptococcusprotein A (SPA)，set up the gold immunochromatography test kit for serum antibody The spheroidal colloid gold particles of 20nm is shown in color of bright minimal stable concentration (MSC) of gold- SPA is 5μg/ml，and the suitable stable concentration ( SSC) is 6μg/ pH is appropriate. 53 sera samples were tested by GICA and ELISA，there is on significant difference between two The quality of gold immunochromatography test kit is associated with the factors，such as the quality and quantity of antigen or antibody，colloid gold particles，buffers，etc.【Key words】 helicobacter pylori;colloid gold;gold immunochromatographic assay在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染的诊断中，细菌培养、组织病检查、尿素酶试验、呼气试验等方法或因为给患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的条件和技术，或因为需要特殊仪器，或因为费用昂贵等，其临床推广及多次重复追踪复查受到限制。
一种新冠胶体金抗体检测试纸条及其制备方法
一种新冠胶体金抗体检测试纸条及其制备方法随着新冠肺炎病毒的全球大流行，快速、准确的检测方法成为防控疫情的重要手段。
传统的检测方法存在设备成本高、检测时间长等问题，因此需要开发出便携、简便的检测方法。
本文介绍一种新型的新冠胶体金抗体检测试纸条及其制备方法。
1.胶体金抗体检测试纸条的制备方法（1）准备材料：抗原（新型冠状病毒蛋白）、抗体、胶体金颗粒、纸条、卡片。
（2）制备胶体金颗粒：将HAuCl4加入到氢氯酸溶液中，加热至沸腾，加入柠檬酸和还原剂，搅拌后冷却至室温即制备好胶体金颗粒。
（3）制备探针：将抗原固定在纸条上，制备好探针。
（4）制备显色剂：将抗体与胶体金颗粒混合，制备好显色剂。
（5）制备检测试纸条：将探针涂在纸条的T线上，将显色剂涂在C线上，使用卡片将纸条装到试管中，待检测样本添加到试管中即可进行检测。
2.胶体金抗体检测试纸条的原理该测试纸条利用胶体金颗粒在特定光谱下的吸收反射，检测样品中的抗原或抗体。
当样品中的抗原与T线上的探针相互作用时，胶体金颗粒被聚集并沉积在T线上，产生颜色变化；当样品中无抗原时，显色剂仅在C线上呈现颜色。
3.胶体金抗体检测试纸条的优势与传统的检测方法相比，该测试纸条具有以下优势：（1）便携：该测试纸条可以在室外、公共场所等处进行快速检测，适用于病例筛查和初步诊断。
（2）简易：该测试纸条不需要设备和专业技能，操作简便，对于在偏远地区、资源匮乏的情况下的检测极为有利。
（3）准确：该测试纸条准确度高、反应时间短，可以作为初步筛查工具使用。
综上所述，该新型的新冠胶体金抗体检测试纸条具有很大的应用前景，可以作为新冠疫情防控的有效工具之一。
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幽门螺杆菌IgG抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制【摘要】目的建立一种快速检测抗H.pylori IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条，并优化制备中各关键步骤的实验条件。
方法以柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金溶液，葡萄球菌A蛋白（SPA），制备免疫胶体金复合物，组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。
结果用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色。
胶体金标记SPA的最低稳定浓度5μg/ml，最适稳定量为6μg/ ml。
SPA标记的最适pH为6.0。
以此试纸条检测临床血清标本与进口ELISA试剂盒比较，组间阳性率比较差异无显著性。
结论胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关，而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。
【关键词】幽门螺杆菌；胶体金；免疫层析检测Research on development of gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG【Abstract】Objective Developing gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG and optimize the key experiment conditions.Methods Preparing the colloid gold particles of 20 nm which were coupled with Streptococcus protein A (SPA)，set up the gold immunochromatography test kit for serum H.pylori antibodyIgG.Results The spheroidal colloid gold particles of 20nm is shown in color of bright red.The minimal stable concentration (MSC) of gold- SPA is 5μg/ml，and the suitable stable concentration ( SSC) is 6μg/ml.The pH 6.0 is appropriate. 53 sera samples were tested by GICA and ELISA，there is on significant difference between twomethods.Conclusion The quality of gold immunochromatography test kit is associated with the factors，such as the quality and quantity of antigen or antibody，colloid gold particles，buffers，etc.【Key words】helicobacter pylori;colloid gold;gold immunochromatographic assay在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染的诊断中，细菌培养、组织病理学检查、尿素酶试验、呼气试验等方法或因为给患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的条件和技术，或因为需要特殊仪器，或因为费用昂贵等，其临床推广及多次重复追踪复查受到限制。
而血清学检测因其非侵入性、快速、准确，可同时处理大量标本，检测不同类型的抗体，在临床检验、基础研究中倍受青睐。
20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测（gold immunochromagraphy assay，GICA），操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和特殊设备，特别适于基层卫生单位使用。
本研究预采用H.pylori超声全菌体抗原、葡萄球菌A蛋白（SPA）抗原，尝试研制一种根据双抗原夹心法检测原理检测血清、唾液中抗H.pylori的IgG抗体的胶体金免疫层析检测试剂，优化胶体金免疫层析快速诊断试纸条研制各关键步骤的实验条件，为进一步研制和开发奠定实验基础。
1 材料与方法1.1 材料幽门螺杆菌菌种SS1为军事医学科学院微生物与流行病研究所保存；TSB肉汤（Tryptic soy broth）为DIFCO 公司产品；氯金酸（HAuCl4.H2O），上海化学试剂公司产品；柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O），北京北化精细化学品有限公司产品；葡萄球菌A蛋白（SPA）、牛血清白蛋白（BSA），均为Sigma公司产品；聚乙二醇（PEG 20000），FLUKA公司产品;以上试剂均为分析纯。
厌氧培养罐AnaeroPack Rectangular Jar为三菱化学公司产品。
1.2 方法1.2.1 玻璃器皿的清洁制备胶体金的所用容器均应反复清洗，并硅化处理玻璃容器的内表面，最后用MQ超纯水冲洗晾干备用。
1.2.2 胶体金颗粒的制备取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01% 的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。
1.2.3 免疫胶体金复合物的制备胶体金标记蛋白最低稳定浓度与最适稳定量的确定目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至5.9～6.2，取11支洁净试管分装胶体金溶液（1ml/管）。
将待标记蛋白质SPA 逐级稀释后（由2～10μg另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，混匀；5min后，在上述各管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混匀，室温静置。
依表1顺序进行。
表1 胶体金标记SPA的最低稳定浓度实验（略）(1)室温静置2h以上观察结果；(2)未加SPA的11号管为对照管；1号管既不加SPA也不加氯化钠溶液同样设为对照；(3)未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。
以此使胶体金红色不变而蛋白质含量最低的试管的蛋白量，即为稳定1ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。
在此基础上再加20%即为稳定1ml胶体金所需蛋白质的实际最适用量。
最适标记pH的确定调节胶体金溶液pH依次为4、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，配合上述最低稳定量实验，确定标记蛋白的最佳标记pH。
SPA标记胶体金当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。
具体步骤如下：按最低稳定量的120%计算出所需待标记蛋白质的总量。
在磁力搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至5.9～6.2），加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min 加完。
分别取1ml胶体金-SPA结合物液（实验组）和1ml胶体金原液（对照组）于试管中加10%氯化钠溶液0.1ml，室温静置1h，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验，否则需补加标记用蛋白SPA。
最后加入终浓度为0.2%的聚乙二醇（PEG MW20000），继续搅拌30min。
1.2.4 胶体金标记SPA复合物的纯化超速离心法纯化免疫胶体金复合物。
先以3500rpm离心20min（4℃），弃沉淀将上清以13500rpm离心35min（4℃），弃上清，用保存液悬起较疏松的红色沉积物；再以11000rpm 离心35min（4℃），小心移弃上清后，用保存液悬起较疏松的红色沉积物至原体积1/10，即为初步纯化的免疫胶体金复合物。
1.2.5 胶体金标记蛋白质的检定定量测定：以保存液作对照测530nm处OD值，4℃避光保存。
质量鉴定：用有Formvar 膜的镍网沾取金标蛋白溶液，空气中干燥后醋酸铀负染，在Tecnai10透射电镜下观察。
1.2.6 金标垫的制备免疫胶体金复合物稀释度的确定纯化的胶体金标记SPA作不同程度稀释后，均匀等量浸于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫。
组装试纸条，在其他条件不变的情况下，根据反应结果，确定达到试纸条敏感度要求的最适胶体金标记SPA的稀释度，或称为工作浓度。
金标垫的制备保存液稀释胶体金标记SPA复合物原液至工作浓度，按比例均匀浸于玻璃纤维素膜，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。
1.2.7 H.pylori全菌超声粉碎抗原的制备［1］幽门螺杆菌SS1采用TSB固体斜面培养基微需氧（5%O2、10%CO2、85%N2）37℃培养，72h后转种TSB液体培养基，37℃振荡培养60h后收集菌体。
H.pylori菌体用小体积生理盐水悬浮，冰浴条件下超声粉碎有效时间5min（150W），超声粉碎置显微镜下观察呈均匀细颗粒状；4℃，12000r/min离心20min，收集上清；细菌沉渣再重复超声5min，重复离心过程取上清；合并2次上清，于0.01mol/L的PB缓冲液（pH 7.2）中透析24h，中间换液3次，最后12000 r/min离心20min，上清测蛋白浓度后分装，于-20℃保存。
1.2.8 H.pylori配体固相硝酸纤维素膜的制备H.pylor抗原室温融化后，12000r/min离心10min，取上清2mg/ml用0.01mol/L的PB 缓冲液（pH 7.2）以250μg/ml间隔，经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测带（T），距离检测带5mm远的质控带（C）用dispenser线形包被正常兔IgG(2mg/ml)。
37℃干燥2h，4℃密封保存。
1.2.9 样品垫的处理选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用。
试纸条组装根据功能不同可将试纸条分为四个部分：上段（A区）为手持部位（吸水滤纸：吸收检测样品中多余液体），中段（B区）为实验反应区（硝酸纤维素膜：包括判读结果的检测带T和指示试纸条质量的质控带C），下段（D区）为样品区（玻璃纤维素膜：接触待检测样品），在中下段之间（C区）放置浸有胶体金标记SPA复合物的金标垫；而整个试纸条贴附于双面胶白色塑料背板（见图1）。
1.3 临床血清标本H.pylor抗体IgG检测取1998年3月～2001年9月期间在我院消化门诊就诊，临床诊断为幽门螺杆菌胃炎患儿血清53份。