抗体工程重点总结
抗体工程简答
（3）单链抗体（ ScFv）：具有良好的结合性，但有时ScFv比其亲本抗体的亲和力明显降低，并常常显示聚集倾向，尤其在37℃是稳定性极差。
（4）单区抗体（Single domain antibody）：优越性在于（1）分子量进一步减小，（2）操作简便，避免了Fv段需分别克隆轻链和重链可变区基因的麻烦。（3）较ScFv稳定。
2. 基因工程抗体技术：主要包括两部分内容，一是用DNA重组技术对已有的单克隆抗体进行改造，包括鼠单克隆抗体的人源化、小分子抗体及抗体融合蛋白的制备；二是用抗体库技术筛选新的单克隆抗体和对抗体性能的改良。
3．抗体库技术：抗体库技术的主导内容是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。
另一条是补救途径,补救途径合成DNA需依赖次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷等DNA前体的存在，而且细胞内要有次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。
用两种突变细胞株，一种缺失TK酶，但保留HGPRT酶，另一种则相反，缺失HGPRT酶，但保留TK酶，在通常培养条件下，因为细胞可利用叶酸经主要合成途径合成DNA，所以这些酶的缺失对细胞生存并无影响。只要当这要合成途径被甲氨蝶呤封闭时，具有酶缺失的这些细胞便不能存活。若将这两种细胞融合，只有杂交瘤细胞能在HAT培养液中生存。因为一种亲代细胞补充了另一种亲代细胞的酶缺失，因此杂交瘤细胞能在筛选培养基中存活。没有融合的亲代细胞，或相同亲代细胞融合后产生的同核体则不能存活，因为他们仍然缺失TK酶或HGPRT酶。这样就可以筛选出杂交瘤细胞。
↓
磁珠-链亲和素-生物素-抗原-抗体生物素-抗原-抗体+ 磁珠-链亲和素
抗体工程制药
Adapted from M
ilstein (1980)
Scientific American
, Oct. p.58
1
2
3
4
m
m
m
m
1
2
3
4
oclonal
antibodies
Cell fusion
Spleen cells
+
Myeloma
x
Antiseum
Antigen
Immunization
1
2
3
4
多克隆抗体和单克隆抗体
Pure single Ab
After immunization, the mouse spleen contains B cells producing
specific antibodies.
Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to i
原理：将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。 放射免疫测定原理示意图
2.克隆化 为提高筛选出来的阳性克隆的稳定性，将单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。 有限稀释法：通过一系列稀释，使每个细胞培养孔平均只含一个细胞，而分离细胞 软琼脂法：将杂交瘤细胞悬液分散在半固体营养琼脂糖上，使呈单个细胞定位生长繁殖，以达到克隆化的目的。
HAT培养基： H 为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） A 可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T 在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料
生物工程的抗体工程
生物工程的抗体工程生物工程是应用工程学原理和生命科学知识，通过改变或利用生物体的遗传物质（如DNA、RNA）以及其代谢产物制造药物，改进农业生产或环境保护等领域的技术。
而抗体工程是生物工程领域中的一个重要分支，它利用对抗体的理解和工程化的方法来设计、生产和改良抗体，以应用于医疗诊断、治疗和疫苗研发等领域。
一、抗体的基本结构和功能抗体，也称免疫球蛋白，是一种由机体免疫系统产生的特异性蛋白质。
它由两个重链和两个轻链组成，每条链上包含一个可变区和一个恒定区。
抗体通过识别和结合病原体、细胞表面抗原或其他外源性物质来发挥免疫功能。
具体而言，抗体可以通过中和病原体、激活免疫细胞或为其他免疫效应分子（如补体）的结合提供平台等方式，来保护机体免受感染。
二、抗体工程的目标和方法抗体工程的主要目标是通过改变或改良抗体的结构，以使其表现出更好的疗效、减少副作用、提高稳定性等特性，在医疗和生产应用中发挥更大的作用。
为了实现这一目标，研究人员采用了多种方法。
1. 重组抗体重组抗体是指通过基因工程技术将抗体的编码基因导入到表达系统中，使其在非哺乳动物细胞或真核细胞中进行表达，并通过纯化和检测步骤获得的人工合成的抗体。
这种方法可以避免从动物体内提取抗体的繁琐过程，而且可调控性更强，可在较大规模上生产高纯度的单克隆抗体。
2. 人源化抗体人源化抗体是指通过重组技术将小鼠抗体的可变区与人源性抗体的恒定区结合，形成一种以人源性为主体的抗体。
这种方法可以减少小鼠源抗体在人体内产生的免疫原性反应，提高抗体的耐受性和稳定性。
3. 单克隆抗体单克隆抗体是指通过体外或体内杂交瘤技术，获得具有相同特异性和亲和性的抗体产生的B细胞克隆。
单克隆抗体具有高度特异性和亲和性，可用于精确诊断和靶向治疗。
4. 工程化抗体工程化抗体是通过对抗体基因进行改造，改变抗体的结构和性质。
比如引入一个特定的氨基酸残基，增强抗体的稳定性；或者改变抗体的亲和力和效价，提高治疗效果。
抗体工程技术
Niels K. Jerne G. Kohler
C. Milstein
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杂交瘤技术的基本原理
18
3、基因工程抗体
基因工程抗体即将抗体的基因按 不同需要进行加工、改造和重新装 配，然后导入适当的受体细胞中进 行表达的抗体分子。
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基因工程抗体与单克隆抗体相比的优点：
通过基因工程技术的改造，可以降低 甚至消除人体对抗体的排斥反应。 基因工程抗体的分子量较小，可以部 分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透 血管壁，进入病灶的核心部位；根据 治疗的需要，制备新型抗体。
7
显微镜下细胞融合过程
8
细胞融合研究进展
Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。
Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定 单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。
第七章 抗体工程技术
第四章 抗体技术
1
★ 第一节 抗体制备
一 、抗体类型
1、多克隆抗体(polyclonal antibody)
早期人工制备抗体的主要方法，以 相应抗原免疫动物，由此产生的抗体 是针对多种抗原决定簇（表位）的混 合抗体，故称之为多克隆抗体。
抗体工程复习内容
一、抗体的结构与功能1、抗体（Ab）：抗原剌激机体后，由浆细胞产生的并能与抗原发生特异性结合的球蛋白。
免疫球蛋白（Ig）：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。
2、免疫球蛋白超家族：含有免疫球蛋白折叠结构样功能区的分子。
Ig分子超家族的成员多数为细胞膜表面分子。
3、按免疫球蛋白抗原特性分类：1）同种型：指同一物种内所有个体的抗体共同具有的抗原特异性，存在于恒定区。
同种型抗原特异性因种属而异，主要包括Ig的类、亚类、型、亚型。
2）同种异型：是指同一种属不同个体间Ig分子所具有的不同抗原特异性。
可作为遗传标记，存在Ig的恒定区。
3）独特型：每一个抗体形成细胞克隆所产生的抗体分子上所特有的抗原特异性。
由V H或V L可变区氨基酸序列的不同所决定。
与抗体结合抗原的特异性密切相关。
4、人免疫球蛋白重链基因定位于第14号染色体长臂，跨度约1100kb，由V、D、J和C四种基因片段组成。
人免疫球蛋白轻链基因分为λ和қ基因，分别定位于第22号染色体长臂和第2号染色体短臂。
5、决定抗原物质免疫原性的四个主要因素是：抗原物质的异物性、分子大小、化学组成和结构复杂性以及与抗原提呈细胞MHC分子结合的能力。
二、多克隆抗体1、多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）：用普通抗原免疫动物所获得的抗体，由于抗原含多种抗原决定簇，同时刺激多个B细胞克隆产生抗体，所获得的抗体是包括多种特异性抗体的混合物，此为多克隆抗体。
2、抗体应答反应中初次应答和记忆应答的各自的特点。
初次应答：潜伏期长。
抗体类型最早产生IgM，接着才产生IgG，2w～2m才产生IgA。
抗体总量低。
维持时间短。
亲和力弱。
记忆应答：潜伏期短。
抗体类型IgG为主，IgM很少。
抗体总量高。
维持时间长。
亲和力强。
由初次应答和记忆应答的特点可看出：要获得高效价的抗血清，不仅与免疫剂量有关，而且免疫方法、接种途径和免疫的间隔时间等均至关重要。
3、免疫佐剂：概念：先于抗原或与抗原混合同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的物质，被称为佐剂或免疫佐剂。
抗体工程重点
第二章抗体的结构与功能* 重点章节。
（一个名词解释）1、（Ab）：抗原剌激机体后，由浆细胞产生的并能与抗原发生特异性结合的球蛋白。
免疫球蛋白（Ig）：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白3.功能区：Ig分子的H链和L链可通过链内二硫键折叠成若干个球形结构，每一个球形结构由110个氨基酸组成，具有一定的生理功能，称为功能区。
又叫结构域。
4.变异度（variability):某一位置的变异度为该位置出现的不同氨基酸数与该位置最常出现的氨基酸残基的出现频率之间的比值。
5、免疫球蛋白超家族immunogloblin superfamily IGSF ：含有免疫球蛋白折叠结构样功能区的分子。
Ig分子超家族的成员多数为细胞膜表面分子6、按免疫球蛋白抗原特性分类：1）同种型：指同一物种内所有个体的抗体共同具有的抗原特异性，存在于恒定区。
同种型抗原特异性因种属而异，主要包括Ig的类、亚类，型和亚型。
2）同种异型：是指同一种属不同个体间Ig分子所具有的不同抗原特异性。
可作为遗传标记，存在Ig的恒定区。
3）独特型：每一个抗体形成细胞克隆所产生的抗体分子上所特有的抗原特异性。
由VH或VL可变区氨基酸序列的不同所决定。
与抗体结合抗原的特异性密切相关。
7、CDR表位：VH和VL紧密地结合在一起，形成一个致密的球状结构，成为Fv段，6个CDR襻位于Pv段的N端，叫做CDR表面(CDR surface)，即抗原结合部位。
8、结合力：抗原抗体的结合依靠静电引力、氢键、范德华力等，需要合适的温度、pH、离子强度及完整的抗体，这种结合是可逆的。
9、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC) ：抗体分子与靶细胞表面抗原结合后，可通过其Fc段与杀伤细胞表面的Fc受体相结合，促进对靶细胞的杀伤作用，称为ADCC。
单核巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞第三章多克隆抗体（一个简答）1、多克隆抗体的概念传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同免疫途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物, 所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体。
抗体工程
• 国内外已有人源或鼠源抗HBV、HIV、 RSV、TNF、erbB2、gpl20、全人源抗大 肠癌单链抗体和鼻咽癌抗独特型单链抗 体等噬菌体抗体的报道。
• 目前世界上有四家专门从事全人源抗体 开发的公司，其中英国剑桥抗体技术公 司(CAT)采用的即是噬菌体显示技术。 CAT声称该公司生产的以TNF-为目标的 D2E7全人抗体己进入Ⅲ期试验，这种抗 体将用于治疗类风湿关节炎。
（四）抗体工程
抗体基因能转入植物中表达，这 方面研究较多且潜力较大的是烟草 叶中的表达，表达的抗体称为植物 抗体（plantibody）。
目前完整的抗体分子、单链 抗体和Fab片段均已在烟草叶和 拟南芥菜植物中得到表达，其产 量可达植物叶片总蛋白量的1.3%， 其高表达产量是抗体成本大幅度 下降，而且转基因植物表达可使 抗体大规模农业化生产。
(一)多克隆抗体
抗原分子具有多个抗原决定簇， 免疫动物后可刺激多种具有相应抗 原受体的B细胞发生免疫应答，因 而可产生多种针对不同抗原决定簇 的抗体，这些由不同B细胞克隆产 生 的 抗 体 称 为 多 克 隆 抗 体 polyclonal antibody, PcAb。
(二)单克隆抗体（McAb）
能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的
细胞毒作用（antibody dependent
cell-mediated cytotoxicity,
ADCC）等均消失殆尽，这也是基因工程
抗体的缺点。
2.类型
在基因工程抗体的研究中，先后研制 出多种人源化的单克隆抗体，如人－鼠 嵌合抗体、改形抗体和多种类型的小分 子基因工程抗体（如单链抗体、单域抗 体）等。
(二)两类淋巴细胞
1.T细胞
为 CD3+ 细 胞 ， 分 为 CD3+CD4+ 和 CD3+CD8+细胞；
生物制药技术中的抗体工程技术介绍
生物制药技术中的抗体工程技术介绍抗体工程技术在生物制药领域扮演了重要的角色，它通过改造和利用抗体的特性，为治疗疾病提供了新的途径。
在本文中，我将介绍抗体工程技术在生物制药技术中的应用和相关的进展。
抗体是由机体的免疫系统产生的一类蛋白质，可以识别和结合特定的抗原。
因其高度特异性和亲和性，抗体成为治疗疾病的理想候选药物。
然而，天然抗体存在一些局限性，比如生产成本高、不稳定性和免疫原性等。
为了克服这些问题，科学家们开发了抗体工程技术，通过改造抗体的结构和功能，提高治疗效果和降低副作用。
一种常见的抗体工程技术是单克隆抗体制备技术。
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的抗体，对特定抗原具有高度特异性。
传统的获取单克隆抗体的方法是从小鼠等动物的脾脏或骨髓中提取B细胞，再经过杂交瘤技术获得。
然而，这种方法存在一定的局限性，比如生产周期长、免疫原性问题等。
近年来，通过重组DNA技术，科学家们可以制备人源化的单克隆抗体，从而避免了相关问题，并提高了制备效率。
另一种抗体工程技术是通过改造抗体的结构来增强其稳定性和活性。
例如，人工合成的Fc区域可以提高抗体的半衰期和结合能力，从而增强了其治疗效果。
此外，通过改变抗体分子的结构，可以实现对抗体的亲和性、特异性和生物活性进行精确调控，进一步提高其治疗效果和选择性。
抗体工程技术还可以用于制备具有特定功能的抗体。
例如，单克隆抗体可以通过融合其他功能蛋白或药物分子，产生具有双重或多重功能的抗体。
这种方法被广泛应用于抗肿瘤药物的研发，通过将细胞毒性物质连接到抗体分子上，实现对肿瘤细胞的靶向杀伤。
此外，抗体工程技术在免疫诊断和分子影像等领域也发挥着重要作用。
通过使用与特定抗原结合的抗体或改造的抗体，在体外或体内实现对疾病标记物的检测和定量。
同时，可以通过标记放射性同位素或荧光物质等标记物，将抗体用于其它生物学研究和医学应用。
需要注意的是，抗体工程技术的应用仍然面临一些挑战和限制。
首先，抗体的规模化生产和纯化仍然是一个技术难题，造成了制备成本高昂。
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简答题
1.简述鼠源性单抗的改造原则及常见类型
a)改造原则：降低其免疫原性、尽量保持其亲合力
b)常见类型：人鼠嵌合抗体、CDR移植抗体、小分子抗体
2.噬菌体抗体库技术的主要流程及优点
a)噬菌体抗体库技术：借助噬菌体展示技术，将抗体V基因与噬菌体外壳蛋白基因
融合表达于噬菌体表面，从而构建噬菌体抗体库，然后通过筛选获得特异性抗体的
V区基因。
b)主要流程：
i.扩增全套抗体基因
ii.构建合适的重组噬菌体表达载体
iii.转化大肠杆菌并保存
c)优点：
i.省时省力
ii.筛选容量大
iii.直接得到抗体基因
iv.可制备人源抗体和其它难于制备的抗体
v.可原核表达
d)缺点：
i.库容受转化效率限制：一般不超过1010
ii.一些抗体分子会抑制宿主菌生长
iii.具极高亲和力的抗体与抗原结合后，难以洗脱，造成丢失
3.简述基因工程抗体的各表达系统的优缺点
a)哺乳动物细胞表达系统：
i.优点：
①. 具有完整的转录、翻译后加工及分泌机制，抗体能被准确子合成、加工和
分泌
②. 具有完全糖基化功能和完善的重折叠机制，可表达形成良好活性的抗体分
子
③. 可实现抗体的分泌表达
④. 既可表达完整的抗体分子，也适合表达其它形式的小分子基因工程抗体
ii.缺点：
①. 构建周期长，操作繁琐
②. 表达量相对低，成本较高
③. 大规模生产受限
④. 具潜在致癌性和病毒核酸的污染可能
iii.常用的宿主细胞
①. 淋巴细胞：主要是小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO
②. 非淋巴细胞：常有的细胞有CHO、COS
b)大肠杆菌表达系统：
i.优点：
①. 遗传背景清楚
②. 产量高：130—150mg／L
③. 生长速度快
④. 操作简单
⑤. 成本低
⑥. 可大规模生产
ii.不足
①. 不具有糖基化功能，不适合表达完整抗体分子
②. 抗体产物多为无活性的包涵体形式
③. 存在的致热原污染可能
c)酵母表达系统：
i.优点
①. 遗传背景清楚，易操作，生产成本低，产量高1.2g/L
②. 具备较好的加工修饰功能，可得到较高活性的抗体分子
③. 消除了大肠杆菌中的致热原和哺乳动物细胞中潜在致癌性和病毒核酸的
污染
ii.缺点：
①. 存在过度糖基化（50/20）影响抗体活性
②. 具备较好的加工修饰功能，可得到较高活性的抗体分子
③. 消除了大肠杆菌中的致热原和哺乳动物细胞中潜在致癌性和病毒核酸的
污染
d)昆虫表达系统：常用的体系有两种：一种是以重组杆状病毒为载体；另一种是稳
定转化昆虫表达体系。
i.特点：具有必要的翻译后修饰、加工及分泌能力可表达各种形式基因工程抗体
表达量高
e)转基因动物表达系统：
i.特点
①. 可产生完全人源抗体
②. 表达抗体具高亲和性
③. 抗体具多样性
④. 可通过杂交瘤等制备功能性抗体
b)植物表达系统：
i.优势
①. 生产成本低
②. 可大规模种植已
③. 种子形式保存种系
④. 受人类病原体污染的危险性最小
4.人一鼠嵌合抗体的制备
a)改造依据
i.抗体的免疫原性主要C区
b)主要流程
i.免疫动物
ii.制备杂交瘤
iii.克隆鼠源单抗的可变区基因
iv.克隆人抗体恒定区基因
v.构建包含鼠V区和人C区的重组表达载体
vi.哺乳动物细胞表达(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)
c)特点
i.可减少90%以上免疫原性
ii.具有完备的免疫功能
iii.不易被清除
d)不足
i.仍有一定免疫原性
5.CDR移植抗体的制备
a)改造依据
i.CDR直接形成抗原表位结合结构
b)改造分类
i.移植抗体
ii.表面残基人源化—镶面抗体
c)移植抗体
i.改造原则
1.选择FR，最大可能维持抗体的天然构象
2.将FR中可能影响抗原结合部的AA替换为亲本AA
3.合适保留CDR两侧骨架序列
4.可将抗体N末端数个AA（L）一起移植
5.须在降低免疫原性和保持亲和力权衡
ii.改造方法：
1.置换法：以人Ig为骨架，以鼠抗体CDR置换人抗体的CDR
2.定点突变法：用定点突变的方法将人V区基因的CDR序列变为鼠抗体的
CDR序列
iii.制备过程：
1.制备杂交瘤
2.克隆V区基因
3.设计移植抗体V区基因序列（mCDR+hFR）
4.构建V区基因
5.与人C区基因相连
6.构建H和L链表达载体
7.哺乳动物细胞表达
6.常用的几种抗体表达系统的优缺点
a)淋巴细胞表达系统：主要是小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO
i.特点
1.本身不产生和分泌任何Ig
2.具备抗体表达的原生条件和环境
3.可产生完全活性的抗体分子
4.适合表达各种重组抗体
5.产量偏低：5μg/ml
6.稳定性不高
b)非淋巴细胞表达系统：常有的细胞有CHO、COS
i.CHO：目前最主要的基因工程抗体生产细胞，常用的属CHO工程株
1.特点：
a)遗传背景清楚
b)转染效率高
c)适用于多种载体
d)可表达各种类型的抗体
e)可长期稳定表达有功能活性抗体
f)可无血清培养和高密度发酵
g)产量可达200μg/ml
ii.COS：由SV40病毒的大T抗原转染猴肾细胞获得，可长期传代
1.特点：
a)转染的抗体DNA以游离形式存在并复制
b)外源基因表达迅速，瞬时表达仅需3-6d
c)适用于研究抗体基因的表达效果以及快速制备少量抗体检测其活性
及特征
c)重组杆状病毒为载体的表达系统：常用载体为多核多角体病毒MNPV。
1.特点：
a)具完整的感染性
b)可容纳100Kb外源片段
c)不依赖辅助病毒既可包装
d)可分泌表达完整抗体分子
e)重组病毒生存短暂，可保证生物安全
f)不感染脊椎动物。