SephadexG10凝胶色谱柱
凝胶色谱柱
装柱由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。
凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。
最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。
将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。
柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。
最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。
3、柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。
由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。
也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。
4、上样凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。
凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。
为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。
样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。
当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。
用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。
当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。
重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。
g-10葡聚糖凝胶色谱柱使用
g-10葡聚糖凝胶色谱柱使用
G-10葡聚糖凝胶色谱柱是一种常用的分离和纯化生物大分子
的柱子，特别适用于分离寡聚糖和多糖混合物。
该柱子采用葡聚糖作为固定相，具有一定的孔隙大小和分子筛效果。
G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于分离多糖、寡糖和其他大分
子化合物。
在使用之前，需要将柱子进行激活和平衡，具体步骤如下：
1. 将G-10葡聚糖凝胶色谱柱放入柱子支撑架上，并连接到色
谱系统上。
2. 将适当的缓冲液（如适应于样品的缓冲液）通过柱子进行激活，以去除可能存在的杂质和污染物。
3. 进行柱子平衡：将适当的缓冲液通过柱子流经，直到柱子和系统达到平衡状态。
4. 加载样品：将待分离的样品按照柱子载样方法加载到柱子上。
5. 进行色谱分离：根据需要，控制缓冲液的流速和浓度梯度，使待分离的目标化合物在柱子上进行分离。
6. 收集分离物：根据其他方法（如按时间段收集、检测波长等）进行分离物收集和检测。
值得注意的是，G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于相对较小的
生物大分子分离，如寡聚糖和多糖，对于更大分子的分离可能需要使用其他类型的色谱柱。
此外，在操作过程中需要根据具体样品的特性和需要进行柱子条件的调整。
交联聚苯乙烯凝胶 色谱柱
交联聚苯乙烯凝胶色谱柱
交联聚苯乙烯凝胶色谱柱是一种常用于分离和纯化生物大分子的色谱柱。
它通常由交联的聚合物制成，具有高度的孔隙度和表面积，能够提供良好的分离效果。
这种色谱柱在生物化学、生物医药等领域得到广泛应用。
首先，让我们从结构和特点方面来看。
交联聚苯乙烯凝胶色谱柱具有均匀的孔隙结构，这使得大分子能够在色谱柱中得到良好的分离。
此外，由于其高度的孔隙度和表面积，交联聚苯乙烯凝胶色谱柱具有较高的样品吸附能力和分离效率，能够有效地分离生物大分子。
其次，我们可以从应用领域来看。
交联聚苯乙烯凝胶色谱柱在生物制药领域被广泛应用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在生物化学研究中，它也常被用于分离和纯化生物大分子样品，如蛋白质复合物、细胞器等。
此外，我们还可以从操作和维护方面来看。
在使用交联聚苯乙烯凝胶色谱柱时，需要注意选择合适的流动相和操作条件，以确保分离效果和样品纯度。
另外，定期进行色谱柱的清洗和保养也是非
常重要的，可以延长色谱柱的使用寿命并保证分离效果。
总的来说，交联聚苯乙烯凝胶色谱柱是一种在生物大分子分离和纯化中应用广泛的色谱柱，具有良好的分离效果和操作性能，适用于生物化学、生物医药等领域的研究和生产实践中。
凝胶色谱柱的使用
凝胶色谱柱的使用一、凝胶色谱柱的使用原理凝胶色谱柱的分离基于分子在柱中的扩散速率差异。
凝胶柱独特的孔隙结构可以使得较小的分子扩散速度更快，从而在柱中落后于分子较大的组分。
分离效果主要依赖于分子与凝胶孔隙的相互作用力，如尺寸排阻作用、电荷作用或亲疏水作用。
根据分子的大小、形状和性质，可以选择不同类型的凝胶色谱柱。
二、凝胶色谱柱的类型1. 托尔伯特柱（Tskgel）：是一种常见的高效凝胶色谱柱，适用于生物大分子的分离和纯化。
根据分子的大小选择不同的托尔伯特柱，包括S、M和G三个系列，具有不同的孔径和分离范围。
2. 超滤柱（Sephacryl）：适用于分子量小于2×10^7道尔顿的生物大分子的分离和纯化。
超滤柱具有较大的孔径，可以快速分离高分子量的物质。
3. 离子交换柱（DEAE Sepharose、CM Sepharose）：用于根据分子电荷选择或分离带有不同电荷的生物大分子。
正离子交换柱（DEAE Sepharose）适用于弱酸的分子，而负离子交换柱（CM Sepharose）适用于弱碱的分子。
4. 亲和层析柱（Protein A、G、L Sepharose）：利用生物大分子与固定在凝胶上的特定结合剂之间的亲和作用进行分离。
常用的亲和层析柱包括Protein A、G和L Sepharose，用于分离抗体或蛋白质。
三、凝胶色谱柱的优缺点1.分离效果好：凝胶柱的孔隙结构可以有效分离不同大小和性质的分子，保证高分离效率和纯度。
2.操作简便：凝胶柱操作相对简单，无需复杂的设备和耗时的准备工作。
3.适用广泛：凝胶柱适用于各种生物大分子的分离和纯化，如蛋白质、抗体、核酸等。
1.分离速度较慢：由于分子在凝胶柱中的扩散速率较慢，分离过程相对缓慢，需要较长的操作时间。
2.不能分离具有相似大小和性质的分子：如果要分离具有相似大小和性质的分子，凝胶柱的分离效果会较差。
四、凝胶色谱柱的实验操作步骤1.准备工作：如准备所需样品、试剂和凝胶柱。
凝胶色谱柱的使用
凝胶色谱柱的使用凝胶色谱柱（Gel chromatography column），又称为凝胶过滤色谱柱，是一种常用于蛋白质和多肽分离纯化的柱层析技术。
它是根据溶质在凝胶颗粒孔隙和凝胶颗粒表面之间的扩散速率不同来实现分离的。
凝胶色谱柱由内核和包覆层构成。
内核是由纤维素、琼脂糖、琼脂和聚丙烯酰胺等材料制成的颗粒，颗粒大小一般在10-300微米之间。
内核是柱层析的主要分离介质，具有一定的孔隙结构，可以根据溶质的分子量来选择孔径大小。
包覆层是一层较细的凝胶层，在内核表面涂覆各种高分子材料，通过改变包覆层的化学性质，可以调控分离过程中的选择性和分离效果。
1.样品制备：准备待分离的样品溶液，通常需要用缓冲液进行稀释和调整pH值。
如果样品中含有高浓度的盐类或有机溶剂等，需要进行脱盐或柱外固相萃取处理。
2.样品加载：将样品溶液加载到凝胶色谱柱上，可以通过重力流动或使用泵进行加样。
3.柱洗脱：用缓冲液进行柱洗脱，一般要满足样品的最佳分离条件。
可以使用单一缓冲液或梯度洗脱，根据需要选择合适的洗脱方式。
4.收集分离物：根据需要，收集分离物进行后续分析或纯化。
1.蛋白质纯化：凝胶色谱柱可以根据蛋白质的分子量进行分离，常用于蛋白质的粗提和富集。
2.多肽纯化：凝胶色谱柱可以根据多肽的大小和亲水性进行分离，常用于多肽的富集和纯化。
3.药物研发：凝胶色谱柱可以用于药物分子的纯化和分析，有助于药物研发过程中的药物筛选和性质表征。
4.生物分析：凝胶色谱柱可以用于生物样品中复杂成分的富集和纯化，有助于生物样品的分析和研究。
1.分离效果好：凝胶色谱柱可以通过调控柱层析介质的孔隙大小和分离效果，达到较好的分离效果。
2.操作简单：凝胶色谱柱的操作相对简单，不需要复杂的设备和操作流程。
3.适用范围广：凝胶色谱柱适用于不同分子量和化学性质的样品，可以满足不同的纯化需求。
1.分离速度慢：由于样品分子需要通过凝胶层的扩散来实现分离，凝胶色谱柱的分离速度较慢。
葡聚糖凝胶柱(sephadex column)使用及注意事项(1)
葡聚糖凝胶柱(sephadex column)使用及注意事项(1)1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。
其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。
虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。
此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把 Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20的柱头部分弃去，很心痛呀）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。
凝胶色谱柱
凝胶色谱柱1. 引言凝胶色谱是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法之一。
凝胶色谱柱是凝胶色谱的核心部分，被广泛应用于生物分析和制药工业。
2. 凝胶色谱柱的原理凝胶色谱柱是一种由多孔材料制成的柱子，多孔材料通常是由高分子聚合物构成的凝胶（如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶）。
凝胶色谱柱通过孔隙大小的选择性分离溶液中的生物分子。
凝胶色谱柱的分离原理是根据生物分子在凝胶中的分子大小差异进行分离。
当溶液经过凝胶色谱柱时，大分子无法进入较小的孔隙，因此较大的分子会比较快地通过柱子，而较小的分子会被凝胶柱内的孔隙所捕获，使其在柱中停留更长的时间。
3. 凝胶色谱柱的类型凝胶色谱柱可以根据不同的凝胶材料和孔隙大小进行分类。
目前常用的凝胶色谱柱主要包括以下几种类型：•分子筛色谱柱：适用于分离分子量较小的生物大分子，如小型蛋白质和核酸。
•聚丙烯酰胺凝胶柱：适用于分离中等分子量的生物大分子，如中型蛋白质和寡核苷酸。
•琼脂糖凝胶柱：适用于分离大分子量的生物大分子，如大型蛋白质和多聚核苷酸。
•离子交换色谱柱：根据样品的电荷性质进行分离，适用于带电的生物大分子。
4. 凝胶色谱柱的应用凝胶色谱柱广泛应用于生物科学研究和制药工业。
以下是凝胶色谱柱常见的应用领域：•蛋白质纯化：凝胶色谱柱可用于分离和纯化复杂的蛋白质混合物。
•核酸分析：凝胶色谱柱可用于分离和纯化DNA、RNA和寡核苷酸。
•生物药物制造：凝胶色谱柱可用于生物药物的分离、纯化和检测。
•病原体检测：凝胶色谱柱可用于分离和检测病原体，如病毒和细菌。
5. 凝胶色谱柱的操作注意事项使用凝胶色谱柱时需要注意以下几点：•预处理：在使用凝胶色谱柱之前，需要进行柱子的预处理，如洗涤和平衡，以保证柱子的稳定性和分离效果。
•样品加载量：要根据样品的性质和要求确定加载量，过高的加载量可能会影响柱子的分离效果。
•柱温控制：柱子的温度会影响分离的速度和效果，需要根据实验要求进行温度控制。
•溶液选择：柱子的分离效果受溶液 pH 值和离子强度的影响，选择适当的溶液条件可以优化分离效果。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。
对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用sephacryls-300。
对于分子量在3~5kda的蛋白质，脱盐时应选用sephadexg50或g25；而对于小分子量多肽物质（1~5kda），脱盐则应选用sephadexg10或sephadexg15。
②凝胶介质的处置和装柱商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。
一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。
溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。
为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。
凝胶过滤器层析柱的短与直径的比例应属50~100:1。
装柱时柱体必须横向，先在柱内重新加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）烘烤光滑，缓慢并已连续地一次性转化成柱内。
装柱过程中，必须防止柱内缓冲液流干，特别注意维持柱体凝胶光滑无气泡和裂缝。
出厂后，需用2ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的光滑性。
例如柱体光滑，可知蓝色区带光滑稳定地通过凝胶，不取任何条纹。
必须维持凝胶和缓冲液温度一致，以增加气泡的产生。
③上样凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。
样品体积不应超过柱床体积的1~5%，如超过5%，则会导致分离效率降低，低于1%则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20mg/ml。
样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。
上样前样品应经0.2μm?孔径滤膜过滤或10，000g离心5min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。
④洗脱洗脱液应当维持一定的离子强度以消解凝胶中所含的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的融合促进作用。
sephadex和sepharosecl凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应属0.02mol/l；sephacryl凝胶应属0.05mol/l。
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Sephadex G10 凝胶色谱柱
在药物质量控制中的应用
（大连依利特公司应用实验室）
1.前言
目前国内外分离分析β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的主要方法是色谱法，应用的色谱分离模式包括反相、离子交换和凝集色谱等。
由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（如均为过敏性杂质），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。
因此根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法具有明显的优势。
在深入研究药物与葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该作用影响的基础上，人们开发了葡聚糖凝胶Sephadex G-10为固定相的凝胶色谱模式，可以方便地用于各类β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离分析。
中华人民共和国药典2000版规定了采用Sephadex G-10色谱柱测定头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松四种药物中高分子杂质的含量。
但是采用传统的玻璃低压凝胶色谱柱柱效非常低，很难达到药典规定的色谱柱的指标，同时该类色谱柱还由操作不方便、分离时间长、分离度差等不足。
针对上述问题，大连依利特公司在药典规定的基础上于2000年开发成功高效Sephadex G-10凝胶色谱柱，能够满足药典规定的四种药物中高分子杂质质量控制的需要。
2年来用户使用得到很好的效果。
2．药典规定用Sephades G-10色谱柱的分析方法描述
中国药典2000版采用Sephadex G-10色谱柱分离表1所示的四种头孢化合物中的聚合物，定量方法均为自身对照外标法，药物对照品的分析采用相同的流动相条件（0.01％十二烷基硫酸钠溶液），但是样品的分析用流动相组成和盐的浓度不完全相同。
评价色谱柱柱效和拖尾因子均采用蓝色葡聚糖2000。
以下分别在上述条件下评价了依利特Sephadex G-10色谱柱的性能指标及其在药物分析中的应用谱图。
3．Sephadex G-10色谱柱的性能评价
表2 在药典规定条件下蓝色葡聚糖2000评价色谱柱性能
Sephadex G-10凝胶色谱柱能够分离分子量小于700的肽、蛋白及葡聚糖等高分子化合物。
药典规定评价色谱柱用分子量为2000的蓝色葡聚糖，此时，蓝色葡聚糖的洗脱体积即为色谱柱的排阻体积。
以下分别为在药典规定条件下蓝色葡聚糖的色谱图及相应的色谱柱参数。
表2的数据表明，在药典规定条件下，用蓝色葡聚糖2000测定的色谱柱的理论塔板数在1092到1342之间，拖尾因子在0.92到1.18之间，洗脱时间的重复性非常好。
完全满足药典对色谱柱性能指标的要求。
4．β-内酰胺类抗生素对照品分析
药典规定β-内酰胺类抗生素对照品分析的流动相条件为0.01％的十二烷基硫酸钠溶液，流动相流速为1ml/min，在上述条件下分别分析了头孢他啶、头孢噻肟和头孢哌酮，相应的谱图和色谱峰指标列于表3中。
表3 药品对照品的分析
5．头孢噻肟中高分子杂质的分析
6．头孢哌酮钠的分析
7．头孢他啶的分析。