目标区域捕获测序 目标区域捕获文库制备
DNA捕获技术在基因组学中优势及挑战讨论
DNA捕获技术在基因组学中优势及挑战讨论DNA捕获技术（DNA capture）是一种常用于基因组学研究的方法，它能有效地高通量捕获特定DNA片段，用于测序和分析基因组中的关键区域。
这种技术的出现，为研究人类遗传变异以及其他物种的基因组变异提供了强有力的工具。
本文将探讨DNA捕获技术在基因组学中的优势，并讨论它所面临的挑战。
DNA捕获技术的优势主要体现在以下几个方面：1. 高效捕获特定DNA片段：DNA捕获技术能够选择性地富集目标DNA序列，以减少测序的成本和工作量。
相比于全基因组测序，该技术能够仅关注与研究目的密切相关的区域，从而提高测序深度和覆盖度，获得更加精确的结果。
2. 目标区域测序的精度和灵敏度更高：通过使用DNA捕获技术，研究人员可以集中精力在感兴趣的基因组区域上，从而获得更加精确和灵敏的测序结果。
尤其在研究复杂疾病的发病机制时，捕获并测序关键候选基因或区域可以帮助识别潜在的遗传变异并揭示其与疾病之间的关联。
3. 可以在不同样本的基因组中进行比较：DNA捕获技术允许研究人员对不同样本的基因组进行相互比较和分析。
这对于研究个体之间的遗传差异以及物种之间的进化关系具有重要意义。
通过捕获和测序多个样本的目标DNA片段，研究人员可以识别和分析这些样本之间的共同和差异之处。
尽管DNA捕获技术在基因组学研究中有诸多优势，但它也面临一些挑战，包括：1. 复杂的样本准备：DNA捕获技术的成功应用需要对样本进行特定的处理和制备，包括提取和纯化DNA，构建文库以及选择目标捕获探针等。
这些步骤往往需要专门的实验技术和设备，且耗时耗力。
样本准备的复杂性会增加分析的难度，同时也可能引入潜在的误差。
2. 数据分析和解释的挑战：DNA捕获技术产生的数据量通常很大，对数据的分析和解释需要复杂的生物信息学工具和算法。
处理和解释这些数据需要高级的计算能力和专业的分析技能。
此外，对于非编码区域的捕获和测序，数据的解读更加困难，因为这些区域的功能和意义还不完全清楚。
高通量基因组测序中测序深度覆盖度
1G=1024M测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值.假设一个基因大小为2M,测序深度为10X,那么获得的总数据量为20M.测序深度=总数据量20M/基因组大小2M=10X覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例.由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在,测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域,这部分没有获得的区域就称为Gap.例如一个细菌基因组测序,覆盖度是98%,那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的.核苷酸多态性位点SNP,插入缺失位点InDel,Insertion/Deletion、结构变异位点SV,StructureVariation位点.SBC可以协助客户,通过手段,分析不同间的结构差异,同时完成注释.技术路线提取基因组DNA,利用Covaris进行随机打断,电泳回收所需长度的DNA片段0.2~5Kb,加上接头,进行cluster制备Solexa或E-PCRSOLiD,最后利用Paired-EndSolexa或者Mate-PairSOLiD的方法对插入片段进行重测序.图1-1,以SOLiD为例,说明整个实验方案.2、外显子测序也称目标组捕获,是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法.是一种选择基因组的的高效策略,外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势.外显子expressedregion是真核生物基因的一部分,它在剪接Splicing后仍会被保存下来,并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质.外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列,又称表达序列.既存在于最初的产物中,也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列.在人类基因中大约有180,000,占人类基因组的1%,约30MB.。
DNA的质量监测通常有两个方法
2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。
其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。
最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。
否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。
2.限制性内切酶的活性1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。
因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小。
2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。
3.限制性内切酶的用量1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。
2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。
由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。
3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。
4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。
使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。
5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。
临床基因检测实验室建设要求
临检实验室建设标准与要求一、高通量测序（NGS）实验室简介1.1NGS实验室又叫高通量测序检测实验室。
NGS是下一代测序技术(N EXTG ENERATION S EQUENCING)即高通量测序技术的简称。
高通量测序技术是对传统S ANGER测序（称为一代测序技术）革命性的改变,可同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,也称为深度测序(D EEPSEQUENCING)。
1.2由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致检测结果准确性下降；另外NGS技术要求高、影响因素多，实验过程处理不当易导致检测结果准确性下降或检测失败。
因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是NGS技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。
二、NGS实验室临床应用的基本条件2.1必须拥有符合临检中心相关规定的标准NGS实验室。
2.2检测设备必须符合标准NGS实验室设置要求：高通量测序仪及配套服务器；高通量测序检测试剂盒；通用电脑；自动分析软件，实验室样本信息管理系统等。
2.3检测人员必须通过专门的技能培训，并获得省级以上卫生计生行政部门颁发的临床基因扩增检验技术上岗证书。
NGS实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行。
2.4NGS临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。
三、NGS实验室建设基本要求3.1主体结构主体为彩钢板、铝合金型材。
室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。
结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。
3.2标准的各区分隔和气压调节将检测过程分成试剂准备、样本制备、PCR扩增和高通量测序四个独立的实验区。
整个区域有一个整体缓冲走廊。
利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• /SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
外显子捕获结题报告
外显子捕获结题报告2010-11-22内容1 项目信息 (1)2 工作流程介绍 (2)2.1 Agilent液相捕获平台 (2)2.2 NimbleGen 液相捕获平台 (3)2.3 生物信息分析流程 (4)3 分析报告 (5)结果 (5)3.1 标准生物信息分析 (5)3.1.1 数据产出统计 (5)3.1.2 目标区域单碱基深度分布图 (6)3.1.3外显子捕获测序的均一性 (7)3.1.4一致序列组装和SNP检测 (7)3.1.5 SNP注释 (8)3.1.6插入/缺失(indels)检测 (9)3.1.7插入/缺失(indels)注释 (9)3.2个性化分析 (9)3.2.1氨基酸替换预测 (9)3.2.2群体SNP检测和等位基因频率估计 (12)3.2.3孟德尔遗传病分析 (13)3.2.4 NGS-GW AS 分析 (14)3.2.5正向选择信号的检测 (14)4 数据分析方法说明 (15)4.1信息分析软件及常用参数介绍 (15)4.2参考数据库 (16)4.3数据文件格式 (17)1 项目信息2 工作流程介绍采用Aglient SureSelect外显子靶向序列富集系统和NimbleGen SeqCap EZ人全外显子捕获系统。
这两个系统都采用液相系统进行高特异性和高覆盖率的外显子区域捕获。
2.1 Agilent液相捕获平台图2.1 Aglient外显子捕获和测序流程基本流程：首先将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库。
文库经纯化后经过LM-PCR的线性扩增与SureSelect Biotinylated RNA Library (BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR 的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序（Hiseq2000测序仪）。
对每个捕获文库进行高通量测序并保证测序深度达到要求，原始图像文件经过Illuminabasecalling Software 1.7进行碱基读取，获得读长为90bp双末端序列（reads）。
探针捕获测序原理
探针捕获测序原理
摘要：
1.探针捕获测序的原理概述
2.探针捕获测序的基本步骤
3.探针捕获测序的优势与应用
正文：
【探针捕获测序的原理概述】
探针捕获测序（Probe-based capture sequencing）是一种基于基因组捕获的高通量测序技术，其主要原理是通过特定的探针与目标DNA 序列结合，实现对目标序列的捕获与富集，然后进行高通量测序，以获取目标序列的信息。
这种技术能够有效解决基因组结构复杂、重复序列高等问题，为全基因组测序提供了一种有效的研究手段。
【探针捕获测序的基本步骤】
探针捕获测序主要包括以下几个步骤：
1.设计探针：根据目标DNA 序列设计特异性的捕获探针，使其与目标序列特异性结合。
2.捕获目标序列：将设计好的探针与基因组DNA 混合，通过高温解链，使探针与目标序列结合。
3.富集目标序列：结合后的目标序列与探针一起进行PCR 扩增，实现目标序列的富集。
4.高通量测序：对富集后的目标序列进行高通量测序，获取目标序列的详
细信息。
5.数据分析：对测序数据进行分析，得到目标序列的基因型、表型等信息。
【探针捕获测序的优势与应用】
探针捕获测序技术具有以下优势：
1.较高的捕获效率：通过特异性探针的设计，可实现对目标序列的高效捕获，降低非目标序列的干扰。
2.较高的测序深度：由于富集了目标序列，使得高通量测序得到的数据中，目标序列的占比大大提高，从而提高了测序深度。
3.广泛的应用领域：探针捕获测序技术可应用于基因组结构分析、基因变异检测、基因表达谱分析等领域。
临床分子病理NGS-100问简明问答
捕获法制备检测变异类型点突变 缺失变 一定的
、小片段的插入 异，基因重排、 拷贝数变异点突ຫໍສະໝຸດ 、插入缺失变异， 基因重排，拷贝数变异
适用检测 Panel 大小 适用小 Panel
适用大中型 Panel
样本要求
对提取核酸的完整性要 求相对较低 一 般 2-20ng 核 酸 即 可 完成检测
对提取核酸的完整性要
求较高 一般需要 100ng 以上
步 骤 简 洁， 操 作 较 简 步骤相对较多，操作较
实验操作
单，实验周期较短，一 复杂，实验周期相对较 般 1 天 左 右 可 以 完 成 长，一般需要 3 天左右
武汉大学中南医院
• 许春伟
福建省肿瘤医院
• 许三鹏
华中科技大学附属同济医院
• 叶丰
四川大学华西医院
• 叶庆
南京鼓楼医院
• 于津浦
天津医科大学肿瘤医院
• 赵九洲
河南省肿瘤医院
• 周晓燕
复旦肿瘤附属肿瘤医院
• 左志向
中山大学附属肿瘤医院
序言
二代测序（NGS）技术在临床中的应用涉及到分子生物学、生物信息学、 肿瘤学、医学遗传学等多个学科知识的交叉。为了让病理工作者能更自信、更 积极地开展福尔马林固定石蜡包埋组织样本（FFPE）以及其他多种病理样本 的 NGS 检测工作，中华医学会病理分会和中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会 多次组织了院内多中心临床应用验证工作。极大地促进了 NGS 在临床的应用 和推广。在院内多中心项目实施及以后的临床实践当中，各单位也都遇到了各 种各样的问题，这些问题在实践中也得到了积极处理。为了积累这些宝贵的经 验，我们特别邀请全国开展 NGS 较早的单位以及参与 NGS 工作的专业技术 人员共同总结选取了 100 个具有代表性的问题及处理应对方法，编写了这本《临 床分子病理 NGS 100 问简明问答》，以期能为已经或即将开展 NGS 检测的 分子病理实验室提供借鉴和参考。本书特别针对临床分子病理实验室专业技术 骨干，鼓励线上线下多种方式交流，促进新技术在病理行业的推广。由于时间 仓促，又是初次编写，错漏难免，请读者提出宝贵意见（邮箱：75804792@ ），便于我们不断修正。感谢上海 远生物技术有限公司对本工作的 技术及印刷等方面的支持。
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HaloPlex目标区域捕获文库制备操作流程
1目的
本文件旨在规范HaloPlex目标区域捕获文库制备操作流程，提供相关标准。
2职责
实验操作人员在文库构建过程中，必须按照本标准操作流程操作，未经实验负责人允许，不得随便更改实验条件和操作方法，否则如果文库构建失败，将由实验操作人员负责。
3适用范围
1
本文件是基于Agilent HaloPlex目标区域捕获技术而制定的文库制备流程，所制备的文库适用于Illumina GA\HiSeq
2000 测序仪。
4术语和定义
无
5操作步骤
5.1 基因组DNA酶切
为方便实验操作，本SOP推荐进行12个样本的酶切反应，其中包括11个基因组DNA和1个Enrichment Control DNA
(ECD)样本。
在这一步，每个DNA样本会被平均分为8份，然后每份样本被2
种不同的限制性内切酶酶切消化，最后每个DNA样本会得到8份酶切消化后的混合产物。
5.1.1 每个基因组DNA样品，取225ng的总量至0.2ml的PCR管，分别用
ddH2O 稀释到45ul，终浓度为5ng/ul;另吸取45ul的ECD样本至额外的1个
0.2ml的PCR管。
5.1.2 配制RE Master Mix:
2
a.在1个1.5ml的EP管中加入476ul的RE Buffer和11.9ul的BSA Solution，震荡混匀并短暂离心。
b.准备一个新的8连管，分别加入56ul的RE Buffer/BSA mixture。
c.按照A-H的顺序，往8连管里面加入7ul的RE Enzymes(Green)。
d.同样按照A-H的顺序，往8连管里面加入7ul的RE Enzymes(Red)。
e.轻柔震荡混匀，然后稍微离心。
【注意】务必确保RE Enzymes(Green)和RE Enzymes(Red)的加样方向是一致的，否
则有可能导致酶切效果不佳。
5.1.3 准备一个新的96孔板，使用8道排枪向每个孔里加入5ul的RE Master Mix。
然后按照以下示意图，每列中分别小心加入5ul的DNA样本。
其中1-11列为不同基因组DNA样本S1-S11，12列为ECD样本。
5.1.4 封膜，小心震荡混匀，然后稍微离心。
5.1.5 在热循
3
环仪上(加热盖)37?C反应30min。
5.1.6 反应后通过对ECD样本的电泳分析验证酶切效果。
酶切后的ECD样品中分别每个取4ul到新的0.2ml的PCR管中，80?C灭活5min。
然后用Agilent 2100
对这8个ECD酶切产物以及没有反应的ECD样本进行检测。
反应完全的ECD酶切产物应该在125、225、450bp左右有3个明显的亮带。
备注:其中lane2-9分别为ECD酶切产物，lane10为未反应ECD样本。
【注意】不要在这一步就将1个DNA样本的8个酶切产物混合了。
如果在限制性内切酶
仍有活性的情况下将酶切产物混合，可能会导致不适当的酶切消化结果。
DNA 样本应该在杂交反应时混合，因为在该反应条件下，限制性内切酶是失活的。
5.2 HaloPlex探针杂交
4
5.2.1 杂交反应体系:
5.2.2 按照上表的比例配好Hybridization Master Mix，震荡混匀，然后分别分装70ul至12个0.2ml的PCR管。
5.2.3 每个EP管里加入10ul不同的Indexing Primer
Cassette(见附录2)。
5.2.4 随后在每个EP管逐一加入相对应的DNA样本的8个酶切产物，震荡混匀并稍微离心。
【注意】限制性内切酶在该反应体系中是没有活性的。
对应的ECD样本，需额外加入32ul
的ddH2O。
5.2.5 在热循环仪上(加热盖)运行程序:先95?C变性10 min;然后54?C杂交3 h。
5.3 目标DNA捕获
事先取出Capture Solution, Wash Solution和HaloPlex
5
Magnetic磁珠，平衡至室温。
5.3.1准备HaloPlex Magnetic
磁珠:
a.为每一个杂交反应取40ul HaloPlex Magnetic磁珠于一新的1.5mL离心
管，对于12个样本，则需500ul(含损失)。
b.将离心管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液,并小心吸干残留;
c.加入等体积(500ul)的Capture Solution，重悬磁珠。
5.3.2从热循环仪中取出杂交反应管，立即往每个反应管中加入40ul已重悬的磁珠，上下吹打混匀，室温下静置15min。
5.3.3 简单离心，然后将离心管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液。
5.3.4 取下EP管，每个加入100ul Wash Solution，上下吹打混匀，46?C下
静置10min。
5.3.5 简单离心，然后将EP管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液，并小心吸干残留，含磁珠的EP管留用。
5.4 缺口连接
6
5.4.1 连接反应体系:
5.4.2 按照上表配好DNA ligation master mix，震荡混匀，然后分别分装
50ul至5.3中含磁珠的EP管中，上下吹打混匀。
5.4.2在热循环仪上55?C反应10 min。
5.5 洗脱DNA
5.5.1取出反应后的EP管，简单离心，然后放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液; 5.5.2取下EP管，每个加入100ul SSC Buffer，上下吹打混匀。
5.5.3简单离心后将EP管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液，并小心吸干残留。
5.5.4取下EP管，加入25ul新鲜配置的50mM的NaOH溶液，上下
吹打混匀，室温下静置1min。
5.5.5简单离心，然后将离心管放于磁力架上，待液体变澄清后，回收上清液至新的EP管中备用，此时含磁珠的EP管可弃掉。
5.6 PCR扩增
7
5.6.1 PCR反应体系:
5.6.2 按照上表配好PCR master mix，震荡混匀，然后分别分装30ul至新的0.2ml的PCR中，并分别加入20ul洗脱后的DNA样本，上下吹打混匀。
5.6.3在热循环仪上(加热盖)运行以下程序:
a) 98 oC 2min
98oC 30sec
b) X cycles of
8。