MLVA分型技术和实验操作步骤
不规则抗体筛查标准操作规程
不规则抗体筛查标准操作规程(一)检验目的检测受血者、孕妇等血清中是否存在抗A、抗B以外的不规则抗体，为交叉配血、ABO血型正确定型(不规则抗体干扰反定型)以及新生儿溶血病产前、产后诊断提供参考依据。
(二)检验原理1.盐水介质法IgM类不规则抗体可以在室温盐水介质中发生凝集反应，使用手工试管法就可以判断受检者血液中是否存在IgM类不规则抗体。
2.凝聚胺法利用多聚季胺盐类——凝聚胺携带很多正电荷，可以中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距离减少，引起正常红细胞可逆性凝集。
无抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，当加入中和液后，则凝集消散，而被不规则抗体致敏的红细胞被凝聚胺凝集，则不能消散，以此来判断受检者血液中是否存在不规则抗体。
3.微柱凝胶法微柱凝胶卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗人球蛋白试剂，红细胞表面抗原与其对应的IgG抗体结合以后，在离心力的作用下不断向管底沉降，并与抗人球蛋白结合形成红细胞凝集，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶上端，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。
4.玻璃珠微柱法微柱卡的每一个微管中装填有直径均一的玻璃微珠和抗人球蛋白试剂(抗-IgG和抗补体C3)，红细胞表面抗原与其对应的IgG抗体结合以后，在离心力的作用下不断向管底沉降，并与抗人球蛋白结合形成红细胞凝集，玻璃微珠具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过玻璃微珠，使其悬浮在玻璃微珠层的上端，而未凝集的红细胞则可以通过玻璃微珠之间的微小空隙到达微管底部。
(三)适用范围适用于手工凝聚胺法、手工微柱凝胶法、手工玻璃珠微柱法、全自动微柱凝胶法、全自动玻璃珠微柱法不规则抗体筛查及鉴定试验。
(四)设备性能参数各种用于不规则抗体筛查试验的检测系统性能指标参见相应说明书。
(五)器材与试剂1.器材KA-2200血清学专用离心机、B600-A型低速离心机、WADiana全自动血型配血系统、SWING-SAXO血型配血系统、Techno全自动血型配血系统、Othro Au-toVuelnnova全自动血型配血系统、阅片灯箱、卡式专用离心机、孵育器、塑料软试管、塑料硬质试管(75m m×l2mm)、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、移液器、一次性移液枪头。
MLVA分型技术和实验操作步骤
MLVA分型技术和实验操作步骤MLVA（Multiple Locus Variable-number Tandem Repeat Analysis）是一种常用的分子生物学技术，用于研究微生物的遗传多样性和分离株的亲缘关系。
MLVA技术通过分析微生物基因组中多个可变数目串联重复序列的变异程度，建立分型模式，从而快速鉴定、分类和追踪微生物株系。
下面是MLVA分型技术的基本操作步骤：1.样品处理：从分离出的微生物培养物中，提取基因组DNA作为起始材料。
可以使用商业DNA提取试剂盒或改良的酚氯仿法进行DNA提取。
2.靶位选择：根据所研究微生物的特征和遗传多样性要求，选择多个具有可变数目串联重复序列的基因位点作为靶位。
这些位点通常位于基因组的非编码区域，具有高度变异性。
3.扩增PCR：设计引物对靶位进行PCR扩增。
引物的设计应该充分考虑位点的特异性和扩增效率。
一般采用多重PCR反应，同时扩增多个靶位。
4.电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析。
根据扩增片段的大小，可以评估靶位的扩增成功与否，以及是否存在扩增产物的差异。
5.数据分析：根据凝胶电泳结果，将每个样品的扩增片段大小进行分析，得到每个靶位的相关数据。
可以使用软件进行数据处理和峰值分析，计算不同重复序列的长度和频率，构建分型模式。
6.分型模式构建：将每个样品的靶位数据整合到一个分型模式中，通过比较不同样品的分型模式，可以推断微生物株系的相似性和亲缘关系。
尽管MLVA技术相对简单，但在实验操作中需要注意以下几个关键点：1.引物设计：引物的选择和设计对于扩增特异性和效率至关重要。
建议使用多个引物对每个靶位进行扩增，以增加准确性和可重复性。
2.试剂质量控制：使用高纯度和质量良好的试剂，避免试剂污染对实验结果的干扰。
每次实验前进行负对照扩增以检测试剂是否受到污染。
3.PCR条件优化：对于不同的靶位可能需要优化PCR反应的温度和扩增周期数，以确保扩增效率和特异性。
2015年5月文献解读
组别
n
皮下出血
轻
常规组 改良组 X2值 p值 180 180 88 152 4.08 <0.01
中
32 21 3.77 <0.01
重
60 7 3.19 <0.01
统计学中x2，p值意义
卡方检验就是统计样本的实际观测值与理论推断值之间的偏 离程度，实际观测值与理论推断值之间的偏离程度就决定卡 方值的大小，卡方值越大，越不符合；卡方值越小，偏差越 小，越趋于符合，若两个值完全相等时，卡方值就为0，表 明理论值完全符合 结果的统计学意义是结果真实程度（能够代表总体）的一种 估计方法。专业上，p值为结果可信程度的一个递减指标，p 值越大，我们越不能认为样本中变量的关联是总体中各变量 关联的可靠指标。p值是将观察结果认为有效即具有总体代 表性的犯错概率。如p=0.05提示样本中变量关联有5%的可能 是由于偶然性造成的.结果0.05≥p>0.01被认为是具有统计 学意义，而0.01≥p≥0.001被认为具有高度统计学意义
引言
1.低分子肝素钙( low molecular weight heparin ，LMWH) 是一种新型 抗凝药.其分子量小，药效持续时间长、出血可能性小，无需监测凝血机 制，具有抗栓作用强、副作用小的优点.已广泛应用于临床，常用于预防 和治疗血栓栓塞性疾病。 2.临床通常选择腹壁前外侧皮下注射途径给药。但若操作不当，极易引 起注射部位疼痛、皮下出血，甚至皮肤坏死增加了患者的痛苦，也影响 了治疗效果. 3.本文通过长期临床观察及实践，针对患者注射低分子肝素钙引起疼痛 及皮下出血的原因进行了分析，并对注射方法的改进提出了切实可行的 方案，即: 腹壁垂直皱褶法皮下注射低分子肝素钙可有效减轻患者的疼 痛、减少皮下出血、皮下瘀斑等不良反应的发生率，在临床治疗和护理 中取得了良好的效果.
院内感染艰难梭菌的毒素检测及核糖体分型研究
院内感染艰难梭菌的毒素检测及核糖体分型研究章黎华;董丹凤;江岑;彭奕冰【摘要】目的了解艰难梭菌临床分离株的毒力情况,并运用核糖体分型技术进行流行病学研究.方法采集住院腹泻患者的未成形粪便标本,无水乙醇处理后接种CDMN选择培养基行艰难梭菌分离培养,并通过革兰染色、耐氧试验和凝集试验行菌落鉴定；提取菌株DNA,选择特异性引物用PCR法扩增毒素基因tcdA和tcdB；核糖体分型针对细菌基因组16S～23S rDNA间区序列进行扩增,并根据电泳带型的多态性实现分型.结果共计分离得44株艰难梭菌,3种毒素型分别为A+B+型、A-B+型和A-B-型,分别占 57％、34％和9％；18种核糖体型中以R8 型和R4 型为主,分别占 20％和18％.结论本研究临床分离的艰难梭菌菌株中,毒素型以A+B+型为主,核糖体分型存在相对优势的型别；无证据提示存在院内艰难梭菌感染的暴发流行.%Objective To investigate the virulence of Clostridium difficile clinical isolates, and conduct an epidemiologic study by PCR-ribotyping for the strains. Methods The unfonned stool samples from hospitalized patients with diarrhea were collected, and were inoculated onto CDMN selective culture media after pretreatment with dehydrated alcohol tor the culture of Clostridium difficile. Isolates were identified by Cram staining, oxygen tolerance test and agglutination assay. Bacterial genome DNA was extracted from the Clostridium difficile strains, and toxin gene tcdA and tcdB were amplified by PCR with specific primers. Meanwhile, PCR-ribotyping was performed through amplification of the genomic 16S-23S rDNA intergenic spacer region sequence, followed by electrophoresis to distinguish different ribotypes according to the polymorphism of thebands. Results Forty-four Clostridium difficile strains were divided into 3 toxin types: A + B + strains, A - B + strains and A - B - strains, which accounted for 57% , 34% and 9% , respectively. All the strains belonged to 18 ribotypes. mainly rihotype R8 (20%) and ribotype R4 ( 18%). Conclusion fn the study, the Clostridium difficile clinical isolates were mainly A + B + strains, and there existed relatively predominant ribotypes. but no evidence suggested nosoeomial outbreak of Clostridium difjicile infection.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(032)011【总页数】4页(P1436-1439)【关键词】艰难梭菌;感染;毒素;核糖体分型【作者】章黎华;董丹凤;江岑;彭奕冰【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025【正文语种】中文【中图分类】R37艰难梭菌(Clostridium difficile)广泛存在于自然界和人与动物的粪便中，是一种专性厌氧的革兰阳性芽孢杆菌。
04多位点VNTR分析
多位点VNTR分析多位点VNTR分析（MLVA）是一种基于串联重复序列可变拷贝数（VNTR）对微生物分离株进行亚型分型的分子分型方法。
即使在高度相关的细菌菌株中，VNTR通常表现出大拷贝数目的不同。
对于一组选定的串联重复序列，拷贝数分析揭示了微观进化关系。
在实践中，选择的VNTR位点对于所研究的生物具有足够的互补性，并且在每个VNTR的串联重复序列外设计保守引物。
因此，每个PCR-扩增子的碱基对的大小是串联重复序列的大小加上两端的偏移的总和。
出于经济原因，有时会合并多个VNTR，即用相同的染料标记它们并以混合物的形式装入毛细管测序仪的同一列中。
条件是混合的VNTR PCR产物的大小范围不重叠。
例如，使用4种染料和2种不重叠的VNTR，每个毛细管电泳可以确定6种VNTR（一种染料包含用于大小计算的参考marker）。
Bionumerics中MLVA分析BioNumerics软件提供了用于多位点VNTR分析的全自动工作流程，该流程从原始毛细测序仪图谱文件或预处理峰表（Applied Biosystems和Beckman）开始。
最初必须在数据库中输入MLVA设置。
这涉及进入样品池的规则：样品池是在同一毛细管中一起加载的VNTR扩增产物的混合物。
这包括使用的不同染料以及（可选）具有不重叠大小范围的兼容VNTR。
因此，每个VNTR由池、染料和（可选）大小范围定义。
大小范围由重复长度、偏移量和复制范围定义。
因此，该软件确切知道应在哪个大小范围内查找特定的VNTR。
请注意，复制范围仅在不同的VNTR与同一染料合并的情况下才是必需的。
如果是原始色谱图文件（AB，Beckman），则该软件可以使用用户定义的解析字符串从文件名自动解析池、染料和菌株信息。
对于GeneMapper或Beckman峰表文件，将从制表符分隔的峰表中自动解析此信息（请参见下面的示例）。
稳健而可靠的方法，与仪器类型无关由于仪器、染料和毛细管柱的不同，根据拷贝数测得的VNTR扩增子大小通常与理论大小有所不同。
食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展
食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展一、简述大肠杆菌作为食品中常见的微生物污染指标，其快速、准确的检测方法一直是食品安全领域的研究热点。
随着生物技术的不断发展，大肠杆菌的生物检测方法取得了显著进展。
这些方法不仅提高了检测速度和灵敏度，而且有助于更深入地了解大肠杆菌的生物学特性和污染途径。
本文将简述食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展，包括传统检测方法的优缺点、新型生物检测技术的开发与应用，以及未来发展方向。
传统的大肠杆菌检测方法，如多管发酵法和平板计数法，虽然操作简便、成本较低，但存在检测周期长、灵敏度低、易受干扰等缺点。
研究者们一直致力于开发新型的生物检测方法，以克服传统方法的不足。
基于分子生物学、免疫学、生物化学等原理的新型生物检测技术不断涌现，如脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点可变数衔接重复序列分析(MLVA)、气相色谱(GC)和高效液相色谱法(HPLC)、ATP生物发光技术、PCR检测技术等。
这些新型生物检测方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优点，能够在短时间内实现对大肠杆菌的准确检测。
PFGE和MLVA等技术可以实现对大肠杆菌的分子分型，有助于追踪污染来源和传播途径；GC和HPLC等色谱技术则可以通过分析大肠杆菌的代谢产物来评估其污染程度；ATP生物发光技术和PCR检测技术则具有快速、简便的特点，适用于现场检测和大规模筛查。
新型生物检测方法在实际应用中仍面临一些挑战，如技术成本较高、操作复杂、对实验条件要求严格等。
未来的研究应致力于优化这些技术的性能，提高实用性。
加强食品中大肠杆菌的生态学研究和风险评估，对于制定有效的食品安全控制措施也具有重要意义。
食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展为食品安全领域的监测和防控提供了有力支持。
随着新型生物检测技术的不断发展和完善，相信未来我们能够更加快速、准确地检测和控制大肠杆菌污染，保障人们的饮食安全。
1. 大肠杆菌在食品安全中的重要性在《食品中大肠杆菌生物检测方法的研究进展》“大肠杆菌在食品安全中的重要性”这一段落内容可以如此撰写：大肠杆菌在食品安全中占据着举足轻重的地位，其存在与否往往直接关联着食品的卫生状况和消费者的健康安全。
肺炎链球菌的检测与分型技术
2020/11/14
41
The Ct value corresponding to the detection level of RT-
PCR and MRT-PCR for pneumococcal serotyping
Serotype
RT-PCT
MRT-PCR
Combined with other serotypes
年龄组, 岁
458例死亡。死亡率 >65岁: 7.55/100 000 < 1岁: 0.71 / 100 000
*覆盖2800万 (占美国人口9%)
2020/11/14
13
/ncidod/DBMD/abcs/survreports/spneu06.pdf
欧洲1985 – 2006年<2岁儿童侵袭性肺炎球菌疾 病发病（发表的研究）
2020/11/14
8
沒有感染者
帶菌者
发病者
2020/11/14
9
肺炎链球菌疾病负担
突破血脑屏障 肺炎球菌菌血症
脑膜炎 脑脊液渗漏
鼻窦炎
突破呼吸道粘 膜纤毛防御系 统
中耳炎 鼻咽部移殖
腹膜炎 关节炎等
突破吞噬细胞防御系统
肺炎
2020/11/14 Salyers AA, Whitt DD. In: Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach. 2nd ed. Washington, USA: 10 ASM Press; 1994. p. 322-31
12A
19F
6C
12B
20
7A
12F
21
7B
13
22A
沙门氏菌研究进展
3 沙门氏菌的致病性研究^p沙门氏菌广泛分布于自然界,是对人类和动物健康有极大危害的一类致病菌, 由它引起的疾病重要分为两大类;一类是伤寒和副伤寒,另一类是急性肠胃炎。
据世界卫生组织报道1985年以来, 在世界范围内由沙门氏菌引起的已确诊的患病人数显著增长, 在一些欧洲国家已增长5倍。
据资料记录, 在我国内陆地区细菌性食物中毒中, 有70%~80%是由沙门氏菌引起的。
因此, 开展食品中沙门氏菌的风险评估对有效管理食品的安全问题, 保护消费者健康具有重要的意义。
3.1 沙门氏菌感染途径的研究进展3.1.1 侵袭性沙门氏菌的侵入在肠道黏膜表面派伊尔氏结(PP)上的滤泡上皮细胞,被认为是沙门氏菌入侵的最佳起始部位。
滤泡上皮中稀疏分布着捕获抗原的微皱褶细胞(m icrofold cell, M细胞),M细胞被肠上皮细胞所包围。
M细胞的基顶面有短而不规则的微绒毛及微褶,是其胞饮的部位沙门氏菌具有2个侵袭途径:一个是通过PP上M细胞进入上皮下组织;另一个是直接侵袭M细胞进入上皮下组织,并且侵袭是通过细胞的基顶面来进行的。
当沙门氏菌黏附到M细胞或上皮细胞顶部后,运用Ⅲ型分泌系统将效应蛋白分泌到胞外并易位于宿主细胞,从而诱导宿主细胞肌动蛋白细胞骨架的重排。
这时细胞质形成一个向外突起将细菌包裹在细胞膜内,以细胞摄粒的作用进入细胞。
3.1.2 非侵袭性沙门氏菌的摄入过去一直认为,沙门氏菌是通过侵袭M细胞或肠上皮细胞进入宿主体内的,但已有研究结果表白,给小鼠口服侵袭力缺陷的鼠伤寒沙门氏菌后,在脾脏中发现有沙门氏菌的存在。
这意味着除了侵袭途径外,还存在另一种途径,就是肠黏膜组织中的树突状细胞(DC)对沙门氏菌的摄入。
在PP中,DC与M细胞接触较紧密。
DC可打开上皮细胞间的紧密联接,从上皮细胞间伸出树突,直接将肠腔中的细菌摄入。
在这一过程中,肠上皮屏障仍然保持完整,其中的分子机制是DC对紧密联接蛋白的表达和调控,如闭合素、闭合带Ⅰ、联接黏附分子等.3.2沙门氏菌致病机制的研究进展3.2.1 沙门氏菌感染途径和机制沙门氏菌可经口感染、粪—口途径传播,可通过被感染畜禽和啮齿类动物携带、排泄,污染环境、水源、饲料、食品,导致流行和传播。
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核酸测序 确定重复模式
确认重复序列和重复单元数 14个确定指标
区分效能评价
9个指标的MLVA策略
21
串联重复的鉴定
TRF 软件
（Tandem Repeats Finder software）
://minisatellites.u-psud.fr/
• • • • 匹配赋2分 不匹配-3分 碱基缺失-5分 最小报告分值50分
98HAH12 SC84
22
串联重复的鉴定
23
串联重复的鉴定
Indices 1858865--1858900 1862974--1863158 1867321--1867363 Period Size 12 46 16 Copy Number 3.0 3.9 2.6 Consensus Size 12 46 16 Percent Matches 70 78 70 Percent Indels 0 4 7 Score 52 228 52 A 36 22 25 C 5 23 25 G 33 12 13 T 25 40 34 Entropy (0-2) 1.79 1.89 1.93
PCR primers:
CTCCCACACCCAGGACAC PCR CGGCCTACCCAACATTCC
230 bp
strain H37Rv : 215 bp
300 bp 200 bp
Gel migration
strain CDC1551 : 230 bp
测序分析
230 bp 215 bp 200 bp 7
Tandem repeat sequence
CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTT ATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGA AAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT AAAATATAGA CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAA GAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAA AAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGA CTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA GAGCA
24
串联重复的鉴定
25
26
inserted a small segment
泳道 菌号
1 SC22
2 NJ25
3 9802
4 9801
5 GZ1
6 89-1591
7 P1/7
8 R735
9 ATCC43765
10 11611
11 HASS-73
12 SC061001
13 SC06238
14 06GZ1
2 1
3 2
3 3
1 0
36 26
ST1 ST81
+ + - - -
1.7 1
10
分析软件：BioNumerics
• 命名MLVA型：MT1-MT85
• 评价各位点的分辨力：
Nei’s index = 1-Σ (allele frequency)2 • 评价MLVA方法的分辨力： Simpson's index = 1 - Σ [nj (nj-1)]/[N (N-1)]
菌株名称 GZ1 P1/7 05ZYH33
血清型 2 2 2 2 2
来源 (CP000837) (www.sanger.ac.u k) (NC_009442) (NC_009443)
ST 型 ST1 ST1 ST7 ST7 ST7
• 以猪链球菌为例： • 鉴定了750,749,790,784 • 测序菌株基因组串联重复位点的比较
100 bp
VNTR和等位基因
下游序列
VNTR 重复 Primer-F
atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat
上游序列 Primer-R
重复拷贝数 =
扩增大小-上下游序列 重复单元的大小
取整：就近取整或去除小数取整
8
串联重复序列可变重复数目的判定
9
MLVA方法
4
VNTR
• VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats •
重复单元
AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG
侧 翼 序 列
5
18bp*3
• AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA
217185--217309
12
9.7
12
58
14
87
27
16
34
21
1.95
29
第三部分
MLVA方法在猪链球菌分型中的应用
30
猪链球菌暴发疫情
• 2005年-四川人感染猪 链球菌暴发疫情 • 215人感染、39人死亡 • 波及四川36个县的202 个村庄 • 重庆， 贵州， 广东， 江西也发现病例
• SmaI酶切：ST7型分为单一的PFGE-01型 • 2005，2006年和2007年中国ST7菌株： PFGE-01型
Ye, et al. 2006. Emerg.Infect.Dis.
32
猪链球菌MLVA指标和特征
cod e Location in GZ1 Locus§ Matches In GZ1 % Tm℃
using arithmetic averages)
• 等分权重 • 分类图/最小生成树的形式展现 • 多态性指数： Simpson’s index
16
MLVA方法的应用
• • • • • • • • • • • • • • Neisseria meningitidis(23) Streptococcus pneumoniae(20), Streptococcus uberis(12), Salmonella Enteritidis(10), Salmonella enterica(5,35), Listeria monocytogenes(28,29,39), Legionella pneumophila(33), Clostridium perfringens(37), Leptospira interrogan(38,38), Escherichia coli O157:H7(30,46), Clostridium difficile(43), Burkholderia pseudomallei(42), Pseudomonas aeruginosa(32), Shigella spp(13) et.al..
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
LN1
GX2
CQ1
GZ2
SC17
SC84
4380032
4380026
RC4716
Gx407
27
28
多种重复模式
TR2
Indices 217182--217298 217182--217291 217221--217313 Period Size 24 15 39 Copy Number 4.5 8.1 2.4 Consensus Size 24 14 39 Percent Matches 61 57 94 Percent Indels 18 18 1 Score 96 77 171 A 27 27 25 C 16 17 16 G 35 35 34 T 21 20 23 Entropy (0-2) 1.94 1.94 1.95
• 聚类分析 • 构建最小生成树
11
MLVA 实验操作
• • • • • • • • 一、模Байду номын сангаас制备：DNA提取模板或水煮模板 二、PCR 扩增 多重PCR反应 三、扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
VNTR产生的原因：聚合酶的滑链复制
6
VNTR 位点的确定
TRF 软件（Tandem Repeats Finder software）， ://minisatellites.u-psud.fr/
Strain H37Rv: 4 x 15 bp Strain CDC1551: 5 x 15 bp
215 bp
• • • • 多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：
其他特征
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST