多克隆抗体制备
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体的制备方法多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。
多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。
制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。
一、抗原的选择在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。
抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。
选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。
抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。
二、免疫小动物免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。
在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。
还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。
三、免疫过程免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。
首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。
在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。
免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。
四、细胞融合与筛选经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。
五、生产与纯化经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。
之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。
六、性质鉴定与应用纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。
最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，需要科学合理地选择抗原、合理设计免疫方案、熟练掌握细胞融合和筛选技术，以及对多克隆抗体进行严格的生产和性质鉴定。
多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程
多克隆抗体制备的基本过程包括以下步骤：
1. 免疫原的选择：选择合适的免疫原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面抗原等。
2. 免疫动物的选择：选择适合的免疫动物，常见的包括小鼠、兔子等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，刺激其免疫系统产生特异性抗体。
4. 收集免疫动物的血清：在免疫动物免疫一段时间后，收集其血清，其中含有特异性抗体。
5. 分离特异性抗体：通过多种方法如沉淀、层析等技术，将特异性抗体从血清中分离出来。
6. 筛选特异性抗体：对分离出的抗体进行筛选，通常采用ELISA、免疫组化等方法，筛选出特异性较好的抗体。
7. 克隆特异性抗体：将特异性较好的抗体细胞与骨髓瘤细胞（如SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。
8. 杂交瘤细胞的筛选：通过培养基中添加抗代谢毒物质如氨甲酰青霉素（HAT），筛选出只含杂交瘤细胞的细胞。
9. 单克隆抗体的扩增：将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，得到大量的单克隆抗体。
10. 纯化和鉴定：对单克隆抗体进行纯化和鉴定，确保其纯度和特异性。
11. 应用：获得的多克隆抗体可以应用于免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光等实验和应用中。
需要注意的是，多克隆抗体制备的过程可能因具体实验目的、免疫动物的选择等因素而有所差异。
以上是一般的基本步骤，具体实验过程中还需根据实际情况进行调整和优化。
多克隆抗体单克隆抗体的制备流程
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17多克隆抗体制备——动物免疫
多克隆抗体制备多抗制备通常用抗原免疫动物，激发动物机体免疫系统产生抗体，最后通过获取动物高免血清获得抗体；获得的高免血清大部分可以直接使用，用于普通免疫学实验，有些则需要机一部纯化修饰才可以使用。
一、动物免疫动物的免疫是制备抗体最为重要的环节之一，物种选择上最好选择与抗原物种远亲缘动物为宜。
下表列出常规抗原在不同动物上的使用剂量和免疫程序。
程序和剂量：以蛋白类抗原为例（一般免疫间隔为3周，如果比较急，也可间隔2周免疫一次）天数佐剂类型免疫程序剂量（质量/体积）兔子小鼠大鼠豚鼠山羊鸡0 完全佐剂预取血（血清背景检测）首次免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl20 不完全佐剂第一次加强免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl40 不完全佐剂第二次加强免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl60 不加佐剂第三次加强免疫(静脉)100μg/500μl40μg/50μl100～500μg100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl70 终放血1.动物的准备及背景测试选取健康符合实验动物标准的动物，免疫前需要静养一周，免疫前采血进行背景测试。
1.2 兔耳静脉取血方法耳静脉取2ml血，如果耳静脉不明朗，可擦拭二甲苯，一般来说取1ml以上是足够做背景测试用的。
1.2.1 将兔子固定在固定盒内，轻轻抚摸背部使其安静下来；1.2.2 用75%酒精棉擦拭兔耳朵，使其耳静脉可见，必要时可用刮刀刮净兔耳上的毛，如果血管依然不明显可用二甲苯擦拭，使其血管膨胀。
多克隆抗体制备免疫小鼠 (2)
多克隆抗体制备免疫小鼠简介多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。
免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。
本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。
流程多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤：1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原，可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。
2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠体内，观察免疫反应情况。
3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清，获得抗体。
4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术，对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
关键步骤抗原制备抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。
抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。
以下是一些常见的抗原制备方法：•纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。
•重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。
•合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。
适当的佐剂适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。
佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的活化。
常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。
免疫小鼠免疫将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等方式将抗原注射到小鼠体内。
注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。
血液采集和抗体收集一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。
血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。
抗体筛选和纯化获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体的制备过程及原理
多克隆抗体是一种由多个不同的B细胞克隆所产生的抗体，能够识别并结合多个抗原表位。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原的选择：选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、细胞表面蛋白等。
2. 免疫动物的选择：根据抗原的物种来源，选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子、山羊等。
3. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到免疫动物体内，激发免疫反应。
通常采用多次免疫，间隔一定时间进行。
4. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，通常采用脾细胞或骨髓细胞。
与骨髓或脾细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：采用筛选培养基，筛选出杂交瘤细胞，一般是通过对杂交瘤细胞进行限稀稀释培养，进行单克隆细胞的筛选。
6. 克隆抗体的生产：将单克隆细胞进行扩增，并进行细胞培养，使其产生大量的抗体。
多克隆抗体制备的原理是利用免疫动物的免疫系统产生多个克隆的抗体。
当免疫
原进入免疫动物体内时，会激发免疫细胞产生对应的免疫反应，形成多个不同的克隆细胞。
这些克隆细胞会产生具有不同的抗体结构的抗体分子。
通过细胞融合和杂交瘤筛选的步骤，可以筛选出产生目标抗原特异性抗体的单克隆细胞，并进行大规模生产。
这样就获得了能够结合多个抗原表位的多克隆抗体。
抗体的制备
抗体的制备为了研究抗体的理化性质、分子结构与功能，以及应用抗体于临床疾病的诊断、治疗及预防都需要人工制备抗体。
目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。
一、多克隆抗体大多数抗原是由大分子蛋白质组成，但只是抗原上有限部位的特殊分子结构能与其相应抗体结合，称此部位为抗原决定簇（antigenic determinant）或表位(epitope)。
一种天然抗原性物质（如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等）往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体一种抗体形成细胞产生一种特异性抗体。
在机体淋巴组织内可存在千百种抗体形成细胞（即B细胞），每种抗体形成细胞只识别其相应的抗原决定簇，当受抗原刺激后可增殖分化为一种细胞群，这种由单一细胞增殖形成的细胞群体可称之为细胞克隆（clone）。
同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质、分子结构、遗传标记以及生物学特性等方面都是完全相同的均一性抗体，亦可称之为单克隆抗体。
在早期传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种抗原决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇抗体分泌到血清或体液中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，也是第一代抗体。
由于这种抗体是不均一的，无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制，因此如何能获得均一性抗体成为关注的问题。
二、单克隆抗体体内免疫法很难获得单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
如能将所需要的抗体形成细胞选出并能在体外进行培养即可获得已知特异的单克隆抗体。
1975年德国学者Kohler 和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞（sheep rue blood cell），SRBC）免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖又能分泌抗SRBC抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤（hybridoma）。
多克隆抗体
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。
多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。
本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。
第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。
目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。
其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。
一、实验动物的生物学特性实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。
掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。
1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。
新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。
成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。
小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。
2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。
兔耳大，表面分布有清晰的血管。
有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。
α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。
唾液型分两种：排出型与非排出型。
排出型易获得人血细胞 A 型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。
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多克隆抗体制备
多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
【晶莱生物】
具体实验步骤如下：
1.兔子的准备
挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.
预采血（作阴性参照用）
1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；
1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；
1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；
1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；
1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；
1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；
1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫
2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；
2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测
3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清
3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1 小时。
3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。
每孔加入100ul的HRP标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。
3.7倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。
每孔加入100ul的TMB底物（Sigma 单组份TMB ）37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。
3.8每孔加入50ul的终止液（2N H2SO4），在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。
抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。
抗体的纯化
4.抗体的亲和---亲和柱的制备
4.1称取1mg CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。
4.2 将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml 2mmol／L的盐酸洗介质3次。
4.3 用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。
4.4 将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中
4.5 室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。
用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。
4.6 加入15m l 1% BSA 溶液室温下孵育2小时或4`C过夜。
4.7用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上h.
4.8抗原固相化完成，可用于纯化。
4.9若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。
5.抗血清的纯化和保存
5.1抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r／min离心15分钟，取上清.
5.2用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。
5.3将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。
5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜
5.5用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白
5.6用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体
5.7用10倍体积PBS平衡柱子
5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于-20`C可长期保存。
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