金黄色葡萄球菌荧光定量PCR法与国标培养法的比较

实验研究
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金黄色葡萄球菌荧Hale Waihona Puke 定量 PCR 法与国标培养法的比较
黄小真 林 磊 张鑫桐 林清荷
（福州市产品质量检验所，福建 福州 350008） 摘 要：目的 比较荧光定量 PCR 法、Baird-Parker 平板计数法、MPN 计数法，探索荧光定量 PCR 快速筛检金黄色
葡萄球菌方法的灵敏性和可行性，为缩短食品中金黄色葡萄球菌的检测时效提供参考。方法 以金黄色葡萄 球菌定量检测能力验证样本、年糕、调理肉制品、酱卤肉、方便米饭为试验样品，针对三种检测方法设计 灵敏性试验和人工污染试验。结果 灵敏性试验三种方法在浓度 105CFU/ml 均有阳性检出，MPN 计数法灵 敏性略好，人工污染试验符合预期。结论 荧光定量 PCR 法可为食品中金黄色葡萄球菌应急检测提供依据。 关键词：金黄色葡萄球菌；荧光定量 PCR 法；Baird-Parker 平板计数法；MPN 计数法 文章编号：ISSN2096-0743/2019-02-0081
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌，食 用了被金黄色葡萄球菌肠毒素污染的食品会引起食物 中毒。金黄色葡萄球菌作为判断食品微生物污染的重 要指标之一，也是食品监督抽检工作的重点。跟踪关 注各类食品监督抽检结果发现，金黄色葡萄球菌相对 于沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏 菌 O157:H7 等食品致病菌阳性检出率较高，且不同食 品受金黄色葡萄球菌污染程度不同。GB 29921-2013 标准对多种食品中金黄色葡萄球菌进行了限量规定， 探索准确、快速的金黄色葡萄球菌定量检测方法具有 重要的意义。金黄色葡萄球菌检验国标方法采用传统 的培养法，步骤多，操作繁琐，从制样到初筛结果需 要 48 小时，到最后确证鉴定需要 3d ～ 4d。随着分子 生物学等技术的不断发展，荧光定量 PCR 方法越来越 多应用到食品微生物检验研究中。本试验将荧光定量 PCR 法、Baird-Parker 平板计数法、MPN 计数法三种方 法进行对比试验，比较三种方法的灵敏性，并观察三 种方法人工污染的检出效果，为荧光定量 PCR 法在食 品中金黄色葡萄球菌定量检测的应用提供参考数据。
表1 三种检测方法灵敏性和试验时长比较
待测样液浓度 （CFU/ml， 104 105 106 MPN/ml）
结果值
试验时长
+
+
-
荧光定量PCR +
-
- 4.3×105MPN/ml 24h
方便米饭 5 批次。 1.1.3 培养基和试剂 金黄色葡萄球菌 PCR 快检试剂盒购自广州迪澳
生物科技有限公司，磷酸盐缓冲液、7.5%NaCl 肉汤、 Baird-Parker 平板培养基、卵黄亚碲酸钾增菌液、血琼 脂平板、冻干兔血浆、BHI 营养肉汤、金黄色葡萄球 菌标准菌株（ATCC6538）均购自北京陆桥技术股份有 限公司。
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实验研究
性组和阴性对照组两组，阳性组按照每 g 样品添加 1ml 浓度 104CFU/ml 金黄色葡萄球菌菌悬液进行阳性加标， 阴性对照组不进行阳性加标，两组样品分别按照 1.3.1 进行操作。
2. 结果与分析
2.1 灵敏性试验结果和试验时长比较 不同浓度的金黄色葡萄球菌待测样液三种方法灵 敏性试验结果和试验时长如表 1 所示。荧光定量 PCR 法阳性检出浓度为 105MPN/ml，结合 MPN 检索表定量 结果为 4.3×105MPN/ml，试验时长 24h。Baird-Parker 平板计数法阳性检出浓度为 105CFU/ml，定量结果为 8.2×105 CFU/ml， 试 验 时 长 3d。MPN 计 数 法 阳 性 检 出浓度为 105MPN/ml，定量结果为 9.3×105MPN/ml， 试验时长 4d。比较发现，三种方法阳性检出浓度均在 105 稀释度，MPN 计数法法灵敏性略好。已知该待测 样本结果真值为 8.0×105 CFU/ml（MPN/ml），三种方 法结果 Z 值均为满意，Baird-Parker 平板计数法结果 Z 值最小，最接近真值。荧光定量 PCR 法经过核酸提取、 PCR 扩增、高温等过程，每一环节都可能对结果产生 影响，所以其灵敏性还应考虑杂菌、环境、操作人员 等因素。
1. 材料与方法
1.1 样品 1.1.1 金黄色葡萄球菌待测样液 大连中食国实检测技术有限公司制备的金黄色葡 萄球菌定量检测能力验证样本，样本为西林瓶装固体 粉末。收到样本后，用 40ml 无菌磷酸盐缓冲液溶解水 化待测样本，即 100 待测原液，按 1:10 梯度稀释，获 得 100 ～ 107 八个待测样液。 1.1.2 试验样品 20 批次监督抽检金黄色葡萄球菌阴性样品，其中 年糕 5 批次，速冻调理肉制品 5 批次，酱卤肉 5 批次，
1.2 仪器与设备 ABI 7500 fast 荧 光 定 量 PCR 仪 器（ 美 国 Thermo Fisher Scientific）、涡旋混匀器（广州迪澳生物科技有 限公司）、小型离心机（Eppendorf）、MJP-250 Ⅱ型 生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司） 1.3 试验方法 1.3.1 三种方法的操作步骤 荧光定量 PCR 法：样液按照 GB 4789.10-2016 第 三法接种到 7.5%NaCl 肉汤管增菌培养 18h，根据 PCR 快检试剂盒产品说明书进行核酸提取和上机试验，上 机结束自动判断阴阳性结果，线性曲线为阳性结果， 结合 MPN 检索表报告定量结果。试验全程需要 24h。 Baird-Parker 平 板 计 数 法： 按 照 GB 4789.10-2016 第二法操作，试验全过程需要 3d。 MPN 计数法：按照 GB 4789.10-2016 第三法操作， 试验全过程需要 4d。 1.3.2 灵敏性试验 八个待测样液分别按照 1.3.1 三种检测方法进行操 作。 1.3.3 人工污染试验 采集实验室监督抽检的 20 批次金黄色葡萄球菌阴 性样品，其中其中年糕 5 批次，速冻调理肉制品 5 批次， 酱卤肉 5 批次，方便米饭 5 批次，每批次样品分为阳