基因工程讲义1

4. 分子生物学 1）DNA双螺旋结构的发现Watson and Crick（1953） 2）DNA复制模式的破解M.Meselson and F. W. Stahl （1958） 3）中心法则的确立F. Crick(1958) 4）密码子（codon）破译F.Crick，S. Brenner等多人 （1961~1966） 5. 基因工程创始 1）SV和入phage DNA重组 P. Berg and H. Boyer （1972） 2）R6-5 质粒和PSC101的DNA重组 S. Cohen（1973） 3）PSC101和非洲爪蟾核糖体DNA重组 S. Cohen and H. Boyer（1973）
79年由 J.C.Alwine等人开发出来的 （3）斑点印记杂交和狭线印记杂交（dot blotting and slot blotting） （4）菌落（或噬菌斑）杂交 菌落杂交由M.Grunstein，D.Hogness修改发展出来（75年） 噬菌斑杂交由W.D.Benton，R.W.Davis开发出来（79年）
溴化乙锭染料分子在DNA分子上的插入作用
DNA分子的酶切消化于琼脂糖凝胶电泳
2. 核酸分子杂交 （1）萨瑟恩DNA印记杂交（Southern blotting）
Southern DNA 印记杂交X光显像图片
Southern 凝胶转移杂交技术
（2） 诺塞恩RNA印记杂交（Northern blotting）
第2节 基因工程的定义和主要研究内容
1. 基因工程的定义 1） 重组DNA （recombinant DNA techniques) 2） 分子克隆（molecular cloning) 3） 基因工程 (gene engineering) 4） 基因操作(gene manipulation） 5） 遗传工程 (genetic engineering) 6） 基因克隆（gene cloning） 2. 主要研究内容 1）从生物有机体中分离出带有目的基因的DNA片 段； 2）在体外将带有目的基因的外源DNA片段与能够 自我复制并带有选择性标记的载体分子连接；
诱导子（inducer）
第3节 基因的现代概念
1. 移动基因（movable genes）或转位因子（transposable elements） 也被称为跳跃基因（jumping genes） 最早在1951年由美国女科学家B.McClintock发现 1) 插入序列(insertion sequence), 2) 转位子（transposon） 3）逆转位子（retrosposons）
IS因子转位形式
复合转位子示意图
Tn3系转位子示意图
2. 断裂基因（split gene）
前体mRNA（hnRNA），RNA剪切（RNA splicing） 间隔序列（intervening sequence）或间隔子（intron） 表达子（exon） 人-珠蛋白基因结构
真核细胞mRNA剪切位点的保留序列
应用RAPD分析法检测兔子与松鼠之间的亲缘关系
3）将重组DNA分子转化到受体细胞或直接用DNA阔增 仪阔增； 4）从大量增殖的细胞群体中筛选出获得重组DNA分子 的受体细胞； 5）克隆这些细胞以阔增目的基因，供进一步分析使用； 6）将目的基因克隆到表达载体上，并转化到寄主细胞， 实现功能性表达，生产人类所需要的物质或目的产物。 3. 基因工程的应用与发展中的重大事件 1）H. Boyer 和P. Berg等获得第1个重组DNA分子（1972） 2）DNA快速测序技术的开发F.Sanger，A.Maxam， W.Gilbert（1977） 3）由大肠杆菌表达人脑激素和人胰岛素（1978） 4）转基因小鼠成功R.D.Palmiter，R.L.Brinster（1981） 转基因果蝇成功A.C.Spradling，G.M.Rubin（1981）
5）入噬菌体48502bp序列测定F. Sanger等（1982） 6）第一个转基因植物培育成功（1983） 7）转基因家畜（猪，羊，兔）诞生（1984） 8）人类基因组计划（1988） 9）转基因玉米和小麦诞生（ 1990~1992） 10）基因工程西红柿上市（1994） 11）人基因物理图谱发表（1995） 12）酵母DNA完成测序（1996） 13）水稻基因组物理图谱（1997） 克隆羊问世（1997） 14）信息基因鼠的问世（1999）
3）DNA 序列分析的自动化
4）DNA杂交测序
杂交的测序
5 基因的化学合成 （1）磷酸二脂法（Khorana，1979年创立） 用选择性保护基团芳基磺酰氯或二环己基碳二亚胺封闭5’或3’羟基
（2） 磷酸三脂法
（3）固相亚磷酸三脂法
6. 基因的定点诱变 （1）盒式诱变
利用掺假的寡核苷酸进行盒式诱变
3.假基因（pseudogene）
G.Jacq等人于1977年在非洲爪蟾5SrRNA基因簇中首次发现 （1）重复假基因（duplication pseudogene） （2）加工假基因（processed pseudogene）
4. 重复基因及重复序列（repeated sequence）
（1）唯一序列（只有1个拷贝）； （2）低度重复序列（10个拷贝）； （3）中度重复序列（10到数百个拷贝）； （4）高度重复序列（数百到数百万个拷贝）
生命进化过程
进化阶段 生命分子进化 构筑生命的基本物质合成（氨基酸，碱基，核糖，核苷，核苷酸） 基本物质的缩合反应（寡核苷酸，寡肽，脂质） 祖先生物 最初的RNA复制酶出现（r RNA） 膜出现 出现和进化 RNA染色体（RNA复制与剪切，原始代谢开始？ 从制造特异性肽的核糖体诞生密码子 （原始t RNA， r RNA， 氨基酰-t RNA 合成酶） 依靠模板的翻译体系出现（m RNA） 双链RNA染色体反转录核的复制
基因工程原理与应用
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清华大学化工系 郭志刚
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第1章 引 言 第1节 基因工程的诞生
• 1. 进化论 Darwin • 2. 细胞学说的建立 • M. Schleiden and T. Schwann（1839） • 3. 遗传学说的建立 • 1）遗传学说创始 G. Merdel 提出独立分配定律（1865） • 2）染色体（chromosome）遗传学说.W. S. Sutton（1903） • 3）基因定位 T. H. Morgan 提出连锁定律（1915） • 4）基因载体（gene vector） O. T. Avery，C. M. • Macleod. and M. McCarty（1944）
基因
启动子
转录区
终止子
RNA起点 第2节 基因的表达与调控 操纵子学说（Jacob F. And Monod. J.，1961） 操纵子（operon）， 操纵基因（operator）
转录终止
调节基因（regulatory gene）， 结构基因（stractural gene） 阻遏物（repressor），辅阻遏物（corepressor）
第3节 生命分子进化与基因工程的可行性
参考文献 1）基因工程原理和应用， 生物化工教研室译，1994年 2）基因工程原理， 吴乃虎编著, 科学出版社，1990年 3）基因工程，邱泽生编著，首都大学出版社，1993年
4）GENES V，Benjamin Lewin，1994
5）MOLECULAR BIOLOGY of THE GENE，J.D.Watson， 1988 6）分子生物学，蔡武城等译，科学出版社，1993年 7）核酸研究技术，蔡良琬编著，科学出版社，1993年
RNA染色体反转录成DNA（反转录酶，核糖核苷二磷酸还原酶）
细胞及生物 祖先生物（DNA染色体，胸腺酸合成酶，所有的基因 进化 具有间隔序列，生长缓慢，从属于营养型）
直链型脂质
枝链型脂质
原真核生物
细菌 氧化磷酸化 光合细菌 线粒体
原始细菌
单细胞真核生物
叶绿体物
（2）寡核苷酸引物诱变
应用尿嘧啶的单链DNA摸板提高寡核苷酸引物突变效率的Kunkel法
硫代硫酸诱变法基本过程
PCR定点诱变
7. 基因扩增（gene amplification）
PCR反应的温度循环周期
反向PCR的基本操作程序
用不对称PCR技术合成供序列测定用的单链DNA
RT-PCR产物的定量测定
中度重复序列（串连重复排列组蛋白基因簇）
5. 重叠基因（overlapping genes） 或嵌套基因（nested genes）
最早由英国的分子生物学家F.Sanger研究小组发现 单链DNA噬菌体X174的重叠基因图
G4噬菌体的重叠基因图
第3章 基因操作的技术原理
1. 核酸的凝胶电泳 （1）琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide） 凝胶电泳 （2）脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis）
祖先生物的进化图谱 人类 哺乳类 鸟类 鱼类 植物 酵母 祖先 Aspergilus 大肠杆菌 B. Stearothemophilus 15亿年 10亿年 5亿年
第2章 基因工程的理论基础
第1节 遗传情报的传递 1. 半保留复制学说 反义DNA （anti sense DNA chain） 有义DNA （sense DNA chain） 模板链(反义链）anti sense strand （template strand） 编码链（义链）sense strand（coding strand） 2. 基因的结构 顺反子学说（Benzer，1955） 顺反子（cistron） 单顺反子（monocistron mRNA） 多顺反子（polycistron mRNA）
3. 细菌转化
（1）肺炎链球菌的转化 （2）大肠杆菌的转化 （3）细菌转化频率
4. DNA核苷酸序列分析