精细定2

生物界的许多性状是以数量性状为基础的，该类性状的发生不是决定于一对等位基因，而是受到两对或更多对等位基因的控制，每对等位基因彼此之间没有显性与隐性的区别，而是共显性。这些等位基因对该遗传性状形成的作用微小，所以也称为微效基因（minor gene），它们在染色体上的位置称为数量性状基因座（quantitative trait loci, QTL）。数量性状就是由许多对微效基因的联合效应造成的一类具有正态分布特性的性状，具有这种性状的个体在正态分布中的位置决定于它们所具有的微效基因的多少。数量性状之所以复杂，是因为这种性状与基因型之间没有一一对应的关系，并且环境因素对它有显着的影响[1]。 1961年，Thoday首次利用一对侧翼标记定位一个QTL[2]，随后QTL的研究得到飞速发展。

现已证明，只要是控制连续分布性状的数量性状基因座，就能在实验群体或远交群体中定位[3] 。在整个QTL的研究中，可分为发现QTL，QTL的定位估计和精细定位[4]。Glazier认

为可分成四个步骤：连锁和关联分析，精细定位，序列分析和候选基因的功能检测[5]。 在模式生物小鼠的QTL研究，已描述的实验步骤更为详细[6]： 第一，把QTL定位到染色体的区段上。典型的QTL定位方法须对几百个杂交后代进行恰当的表型检测；利用覆盖整个基因组的75-100个遗传标记进行基因组扫描，遗传标记的平均跨度为15-20个厘摩（cM）；准确基因分型，然后对性状和遗传标记之间进行连锁和关联分析；计算QTL与某标记位点靠近的可能性大小。这种方法即使经过成百上千次的表型和基因型的分析，定位的QTL在染色体上还是一个较大的区间。 第二，把一个QTL的作用与其它QTL的作用分开。通常在同源系（congenic strain）中进行，这样就把多基因遗传的性状转化成单基因性状进行研究。目标QTL与其它有作用的QTL分离后，仍须具有可测量的表型效应，否则达不到分离目的。该方法的局限性在于单个同类系不能分解几个连锁在一起的有相同作用的QTL，特别是该性状是由很多的基因控制的时候。由于不知道单个QTL能否引起一个表型的可测量变化，使得进一步的工作更加困难[7,8]。

第三，QTL的精细定位。在开展分子水平的研究之前，尽可能把QTL所在的区间缩短至几个厘摩，甚至更小的范围内。这就需要大量的染色体片段的重组和可靠的表型测定，解决方法是构建一些特殊的实验群体，并对其中的特殊个体进行后代测试（progeny testing）。 第四，鉴定和评估候选基因。模式生物基因组测序的完成，提供了该基因的全部序列信息。但是对于QTL已经精细定位的遗传距离还显得太宽（1 cM 大约含有30个以上的基因）。因此在对候选基因进行功能检测（functional test）之前，必须清楚了解每个QTL对表型的影响。 第五，证实候选基因。一般用基因打靶或转基因的方法。QTL是在漫长的自然变异中形成的，研究QTL的最大挑战是要在两个亲本之间精确区分高度连锁在一起的多态性性状。要证明一个QTL性状是由某个等位基因引起，必须在主系（host strain）中把该等位基因用其它基因替换并观察效应，这在技术上很困难，而且主系在很多情况下不是一个标准的近交系[9-12]。

以上几个步骤在QTL在研究过程中不是截然分开的。 由于QTL研究能够定位基因，因此研究基因间的相互作用和功能，筛选和操纵农作物的重要经济性状，了解进化，为复杂遗传疾病提供新的诊断和治疗方法，在学术界引起了广泛的研究兴趣[13]。在过去的20年里，已在人类、模式生物、植物中发现和定位了许多影响复杂性状的QTL。随着高通量的基因表达谱分析、新的分子遗传工具对基因组的操作、比较制图和复杂的统计软件的开发，使得QTL的精细定位和位置克隆成为可能。 本文将对QTL精细定位的研究进展进行综述。 （一）QTL精细定位的基本策略与方法 QTL的初步定位在染色体上是一个比较宽的区间，有必要对此进行精细定位，尽可能地把关键区间缩小，但精细定位难度很大。利用一般群体进行QTL定位时，QTL的可信区间通常在10 cM以上[14]，很难确定检测到的一个主效QTL到底是一个还是包含有多个微效QTL[15]。因此，还须构建特殊的实验群体来精细定位QTL。

目前设计了多种方法进行QTL的精细定位，如高分辨率的杂交（high-resolution crosses），构建同类系（congenic strains），近等基因系（near-isogenic lines，NIL），后代测试（progeny testing），连锁不平衡（linkage disequilibrium ，LD）分析，家系研究（family-based studies），

或是病例-对照研究（case-control studies）等[5]。实验一开始的低分辨率连锁分析主要用来发现QTL，以便进行接下来的精细定位研究，与其相反的是，高分辨率研究的目标是有效缩小侯选区间的范围。综合使用这些方法能把QTL的可信区间降到1cM以下[16-19]。 研究QTL精细定位最好的群体是构建目标QTL的近等基因系(QTL-NIL)。近等基因系的基本特征是整个染色体组的绝大部分区域完全相同，只在少数几个甚至一个区段存在彼此差异。因此，它能使基因组中只存在一个或几个QT L分离。这样做可以消除其她背景干扰和消去主效QTL对微效QTL效应的掩盖作用，从遗传上和统计上为QTL定位创造条件。尽管近等基因系构建时间长、工作量大，但近等基因系对QTL分解和精细定位的独特优越性使其成为分离和克隆QTL的理想群体。构建近等基因系，首先需要对QTL初步定位，再结合回交和分子标记辅助选择，对QTL靶区间进行正选择，对背景进行负选择，从而快速构建靶区间的近等基因系。如果创建一套覆盖全基因组的染色体片段的替代系，将对QTL精细定位提供非常便利的条件。目前在番茄中已建立起这样的替代系[20]。 DorweiIer等[21]利用近等基因系把控制玉米主穗差异的基因座TGA1，精确定位成孟德尔

基因。Yamamoto等[22]用连续回交选育的方法获得水稻抽穗期近等基因系，其后代的抽穗期分离呈现一对基因的孟德尔遗传分离规律，6号染色体上的抽穗期主效QTL(Hd1)定位在相距0.6 cM的R1679-P130之间，与C235共分离。Yano等[23]把一个12kb的基因组序列确定为该QTL的候选基因，并发现双亲的等位基因序列间存在多种差异，包括碱基替换、一段缺失和一段插入等。应用NILs和亚NILs（sub-NILs），精细定位了3个番茄迟发枯萎抗性QTL[24]。

理论研究表明，缩小QTL可信区间的瓶颈在于研究群体只能提供有限的减数分裂的信息[25,26]。因此，有学者建议应充分利用生物在长期繁育过程中累积起来的标记与QTL之间

的重组信息。目前，常联合采用连锁与连锁不平衡进行QIL的精细定位[27] （二）近交群体中QTL的精细定位 能够方便构建近交群体的生物，如水稻[28]、玉米[29]、小麦[30]、果蝇[31]、酵母[32]等，使得一些数量性状得到了精细定位。本文着重介绍近交小鼠的精细定位。 近交小鼠是研究复杂性状和人类疾病的很好的模型。一个近交系是由经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育而成的品系，可以认为在整个基因组上所有的遗传位点都是纯合的。只要品系间有差异，就可以利用品系间杂交2代、2代以上以及回交群体中性状分离的个体进行控制基因位点的确定。利用近交小鼠可构建许多精细定位所需的群体。 1、以高级互交系（Advanced intercross line, AIL）进行QTL的精细定位

该策略是Darvasi在1995年提出的[33]。AIL是由两个近交系随机交配产生F1代，F1代个体再随机互交产生F2代。以同样的方式产生AIL F3、F4、F5，…，直到获得实验所需的AIL为止。为了增加染色体间重组的概率，在实验动物的繁殖中应避免同窝间的交配。AIL能进行QTL精细定位的理论基础是一个群体之间不断的互交，能减少连锁不平衡，使得任何连锁位点之间重组的几率趋向于0.5[34]。经过多代交配以后，精细定位所需的重组事件就会在AIL个体中积累，达到实验检出的水平。对AIL群体大小的要求是不少于100只。 利用AIL寻找QTL时，因能打破QTL与连锁标记位点之间的连锁不平衡，所以可以把几个连锁的QTL与一个效应较大的QTL区别开。 QTL定位的精度用可信区间来表示，与AIL定位精度有关的参数有染色体的长度，QTL所在区间相对于染色体末端的距离，标记之间的跨度，实验群体的大小，QTL效应的大小等[33]，这和用F2代小鼠定位参数是一致的[35]。 一些在F2代中提高定位准确性的方法，如Zeng[36]提出的"复合区间作图法"(CIM)，在AIL中也同样适用。当在一个区间检测一个QTL时，CIM方法可利用其它标记作为协方差控制其它QTL，并且减少了残余方差，这样检测就有所改进，而且AIL能把连锁在一起的QTL显着分开。 F2代和回交 (back cross， BC)小鼠，也能进行QTL的精细定位，但须繁育大量的群体。比

如，一个效应为25%的QTL，精细定位至5 cM，利用F2代需4500个个体，而用AIL（F10）只需1500个个体[33]。若繁育个体和表型测定的成本低，或是一些简单的形态学性状，用F2进行精细定位也不失为一种方法。若表型很难测定，或对一些复杂的行为进行定位，采

用AIL更好。 两个近交系杂交的后代经连续20代以上兄妹交配可形成重组近交系（Recombinant inbred line, RIL），此过程中染色体的重组概率也在不断增加，一个RIL积累的重组事件与AIL（F4）

的相同。使用AIL定位QTL的效率，和使用多个RIL是一致的，花费却只是培育一个RIL的费用。若某个性状是由少量低遗传度的QTL决定的话，那么使用RIL更有效，因为RIL更能降低环境因素的影响[33]。 运用A/J×C57BL/6J（F6）AIL，Iraqi等人成功精细定位了小鼠三个锥体虫抗性数量性状基因座[37，38]。Wang等人在C57BL/6J×NZB/BlNJ （F11）群体精细定位了浓缩高密度脂蛋白（HDL）胆固醇的4个QTL[39]，分别位于1、5和16号染色体上。肺腺癌易感基因1-3[40]在(A/J×C57BL/6) F(11) AIL中也得到了精细定位。 2、选择性表型测定（Selective phenotyping）

虽然繁育了大量的F2与BC群体，但只有在原QTL所在区间发生染色体重组的个体才用作表型的测定。因为一旦某个QTL定位到某个区间内，那么只有在那个区间内发生重组的个体对精细定位才有意义。任何次数的重组都会缩小QTL所在的区间，随后在更小的区间内寻找新的重组。实验时，需要测定表型的动物总量会减少，减少量为F2代个体的1/2r（1-r），BC个体的1/r(r 为所研究QTL内发生重组的概率)，但繁育的动物总数与F2和BC的个体数