转基因动物与生物反应器

（六）获得纯合的转基因鼠
优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。
缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产
仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件 需要大量资金投入的事情。
三、反转录病毒法
（一）反转录病毒感染法的原理
（二）反转录病毒感染法的载体的构建
转移至细胞中。此法简单、
效率较高，广泛应用于培养
细胞的基因转移。
电穿孔法实现外源基因的转移
利用显微操作技术转移外
源基因的方法。此法转入 基因长度可达数百kb；并 能随机地整合在受体细胞 染色体DNA上，因此应用 范围广。但是这种整合有 时会导致转基因动物基因
组的重排、易位、缺失或
定点突变。
显微注射转基因技术
提取病毒未整合的环状形式DNA；
将环状DNA克隆到适当的载体中； 选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除； 将外源目的基因克隆到载体中
（三）通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞
反转录病毒载体的工作原理：寄生在受体细胞中的重组病毒由于没 有包装信号，能生产病病毒RNA和所有蛋白质，但不能包装成病毒 颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白 把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。
（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养 液， 仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继 之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部； （8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵 细胞膜内(小鼠胚卵直径约10m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原
作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细
胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射
DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，
成为转基因动物。
DNA显微注射法的基本程序
通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注
射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超 数排卵为35个；
选择获得携有目的基因的细胞
选择合适的体外培养系统和宿主动物
转基因细胞胚胎发育及鉴定
筛选所得的转基因动物品系
第一节 目的基因的制备
一、目的基因的来源
1. 采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因； 2. 通过mRNA合成cDNA； 3. 人工合成的DNA片段；
4. 聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。
二、目的基因的克隆
• 通过载体在适当的宿主中克隆
选择载体
目的基因与载体的连接
重组体导入受体细胞
• 通过PCR反应克隆目的基因
三、目的基因的转移
电穿孔法 显微注射法 裸露DNA直接注射 磷酸钙—DNA共沉淀法 脂质载体包埋法 病毒介导的生物学方法
利用脉冲电场提高细胞膜的
通透性，从而使外源DNA
这种方法是受二价金属离
子能促进细胞吸收外源 当核酸以磷酸钙—DNA共 沉淀物的形式在时，细胞 但转移效率较低，仅有 1%~5%的外源DNA可以
DNA的启发而发展起来的。
摄取DNA的能力显著加强。
进入受体细胞核中，大约
仅有1%的DNA可以在细 胞中稳定表达。 磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术
将需要转移的外源DNA 或RNA包裹于脂质体内， 由于脂质体具有磷脂双层
(5)向含卵团表玻皿的分离液中加5 l新制备的透明质酸酶(透明质酸酶10mg／1ml分
离液，Sigma产)，把胚卵团消化分散开； (6)当卵团散开后，立即把分散游离的卵细胞用吸管转移入培养皿中，通过硅油层接
种入任一培养液小滴中)，以清除酶的继续作用；
(7)再依次通过皿内其余培养液小滴，以继续除掉酶和摆脱碎片(碎片能堵塞吸管口)， 此时的卵己可用作DNA注射之用。
输卵管内；
（7） 把输卵管及周围组织送回腹腔内； （8） 仔细紧密缝合创口， （9） 再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。
（六）显微注射法获得转基因鼠的成活率
优点： 转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何
病毒基因组片段，绝对安全 。
缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不
第五章
转基因动物与生物反应器
山东师范大学生命科学学院
将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中； 接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育； 移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转 入的外源基因； 利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。
与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵； 将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内 ； 将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内 ； 受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代 ； 从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位
点；
子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达 。
将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和 加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动 物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传 给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物
称为转基因动物（transgenetic animal）。
外源目的基因的制备
外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
2 DNA注射
（1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡 （厚约5mm）； （2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100l为单元的小滴 数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)； （3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中； （4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥， 重悬于注射缓冲液中(含1mgDNA／ml)，使其最终浓度为：0.05~0.5mg/ml； （5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消 除末溶解物，防止阻塞注射管口； （6）把待注射用的DNA装入注射管中；
其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合， 这时用GCV筛选， tk基因表达的胸苷激酶能反
GCV转化成有毒的化合物，使细胞死亡。这是
负选反择。
（四）转基因ES细胞的检测
（五）转基因小鼠的繁育
正确整合的转基因胚胎干细胞经培养后就可以移入胚 泡期的供体胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子
宫内，繁育转基因小鼠。
（3） 麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)；
（4） 剪出背肾部两侧毛，碘酒／酒精消毒；
（5） 使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm； （6） 轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见 成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚 卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入
表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺
失等；需显微操作仪，技术性要求强。
二、胚胎干细胞方法
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）
分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。
•它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。 •可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。
通过DNA显微注射获得转基因小鼠示图
（一）显微注射DNA的制备与纯化
DNA构型和末端结构 载体 DNA的长度与浓度 溶解DNA的缓冲液 DNA的纯度
（二）鼠的准备与要求
转基因鼠实验所用各类鼠
（三）超排卵与取卵
1 超排卵
孕马血清（PMS）其有效成分为卵泡刺激素（FSH）。 人绒毛膜促性腺激素（hGG）
（三）转基因ES细胞的筛选——正负选择法
正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：
通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，
在含有抗菌素G418的培养基中，没有整合外 源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基
因的细胞才可以存活下来。
负选择法筛选出特异整合型ES细胞：
如果非特异性整合发生，则两个tk基因或
四、重组反转录病毒感染早期胚胎
优点：能有效地将转基因整合入受体细胞的基因组内，单拷贝整合型；转
基因整合后能稳定地遗传；整合机制相应明确，在TR区域内进 行，不会破坏转基因结构
ES细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养
（二）ES细胞的基因组操作
将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影
响ES细胞的各种功能。
这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基 因结构及功能没有影响或影响最小。
① 与整合位点两端区域同源的两
段DNA序列（HB1和HB2） ② 转入的目的基因（TG） ③ 编码抗G418的新霉素磷酸转移 酶基因（neor） ④ 两个不的胸苷激酶基因（HSVtk1和HSV-tk2）
结构，与细胞膜类似，因
此可以与受体细胞膜融合，
从而将外源DNA转入宿
主细胞。这种方法转基因 效率高。
脂质载体包埋法
病毒介导的生物学方法
第二节 转基因动物的方法
•反转录病毒法 •基因显微注射法
•胚胎干细胞移植法
一、基因的显微注射法
何为显微注射？
显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操
（一）ES细胞的建立与维持
动物的准备：取受精之后3.5天的母鼠分离鼠胚。
胚胎的分离和初培养：3.5天孕鼠
鼠断颈处死
解剖小鼠取出胚胎 4—6天后，离散ICM。 培养离散细胞 ES细胞集落