14-分子发光光谱法
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分子发光光谱法
内转换
内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐 射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子 跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换 外转换：激发分子与溶剂或其他 分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“ 猝灭”。
系间跨越 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非 辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道 耦合进行。
荧光强度对温度变化敏感。
一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强
度将增大，并伴随光谱的蓝移。温度增加，碰撞频率增加， 使外转换的去激发几率增加。
(3) pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 如苯胺：在pH 5-12溶液中，以分子形式存在，有荧光。
pH< 5时以苯胺阳离子形式存在，无荧光
ex em
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，直接
比较。
三、荧光分析法的应用
可采用直接测定法或间接测定（荧光猝灭）法
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
第十一章 分子发光―荧光、 磷光和化学发光光谱法Molecular .
已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍，研究内
容2已020从/6/15经典的荧光分析方扩展到新近发展起来的新技术。
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§11－1 分子荧光和磷光光谱法
1．产生机理
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动 能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化 学能或光能等到)后天激发为激发态。激发态是很 不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回 基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光) 的形式释放能量，就称为“发光”；如果物质的 分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的 电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论 来讨论荧光和磷光的产生机理。
进入二十世纪以后，荧光现象被研究得更多了，在理论 或实验技术上都得到极大的发展。特别是随着激光、计 算机和电子学的新成就及技术的引入，大大推动了荧光 分析法在理论上及实验技术的发展，出现了许多新的理 论和新的方法。
在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作
者从事荧光分析方面的研究工作。到了 下一张幻灯片
磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光。1944年 Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光 是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光， 它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分 析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也 不断得到发展。
2020/6/15
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处于分子基态单重态的分子轨道上的电子，激发 时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上（不符 合光谱选择定则），但处于单重激发态的轨道上 的电子，可以通过体系跨越（系间窜跃），转移 到三重态轨道上；在这个过程中，处于激发态的 电子自旋发生变化，这个过程需要时间较长，故 处于三重激发态的寿命为10－4~1s；当其由三重激 发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光。
分子荧光光谱法
激发态分子在发射荧光之前，很快经历了振动松 弛或者内转化的过程损失了一部分激发能，致使 发射向对于激发总是有一定的损失。
荧光光谱 磷光光谱
辐射跃迁只使激发态分子衰变到基态的不同振动 能级，然后通过振动松弛进一步损失能量。
图2 萘的激发光谱I、荧光II和 磷光光谱III
荧光与分子结构的关系
具有大的共轭π键的结构 化合物
ϕF
λex/nm
λem/nm
含有π→π＊跃迁能级的芳 苯
0.11
205
278
香族化合物的荧光最强芳环 蒽
0.29
286
321
越大其荧光峰越移向长波长 萘
0.46
365
400
方向，且荧光长度往往比较
丁省
0.60
390
480
强。
戊省
0.52
580
640
取代基的影响
给电子基团，如-0H、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等，使 荧光增强。
分子荧光光谱法
molecular fluorescence analysis
CONTENTS
01 概述/ 02 荧பைடு நூலகம்分析基本原理/ 03 荧光分析仪器 /
04 检测结果与分析/ 05 对比与发展 /
Part 01
概述
overview
原子光谱法 分子光谱法
主要研究内容
The Main Contents Of The Research
系间窜越 isc
03 不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过 程（例如S1---T1，T1---S0）
内转换
振动弛豫
S2
系间跨越
S1
能
量
荧光光谱 磷光光谱
辐射跃迁只使激发态分子衰变到基态的不同振动 能级，然后通过振动松弛进一步损失能量。
图2 萘的激发光谱I、荧光II和 磷光光谱III
荧光与分子结构的关系
具有大的共轭π键的结构 化合物
ϕF
λex/nm
λem/nm
含有π→π＊跃迁能级的芳 苯
0.11
205
278
香族化合物的荧光最强芳环 蒽
0.29
286
321
越大其荧光峰越移向长波长 萘
0.46
365
400
方向，且荧光长度往往比较
丁省
0.60
390
480
强。
戊省
0.52
580
640
取代基的影响
给电子基团，如-0H、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等，使 荧光增强。
分子荧光光谱法
molecular fluorescence analysis
CONTENTS
01 概述/ 02 荧பைடு நூலகம்分析基本原理/ 03 荧光分析仪器 /
04 检测结果与分析/ 05 对比与发展 /
Part 01
概述
overview
原子光谱法 分子光谱法
主要研究内容
The Main Contents Of The Research
系间窜越 isc
03 不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过 程（例如S1---T1，T1---S0）
内转换
振动弛豫
S2
系间跨越
S1
能
量
分子发光光谱法
由于物理主义的进步，人们发现分子发光光谱的重要性，它的应用也
越来越普遍。
分子发光光谱是一种用来测量分子光学性质的技术。
它
通过测量发光分子的光谱图，可以获得更多完整且准确的信息，而这
些信息有助于揭示分子结构与性质的关系。
分子发光光谱是一种活性技术，它利用光谱来了解化学反应物的结构。
这项技术利用发出的光的频率和强度来分析分子，由于分子的结构它
们发出的光每个都有不同的频率和强度。
另外，分子发光光谱还能够
反映分子间的相互作用，从而在实验室中观察分子间的相互作用。
分子发光光谱法在科学研究中也得到广泛应用，它被用来研究分子的
结构、反应机理、生物活性及其过程，广泛应用于有机合成、药物研
究及生物化学等领域。
它已经成为结构和生物活性异质性测定的重要
手段，其应用范围也得到了显著的扩展。
例如，分子发光光谱被用来
研究有机和无机分子的生物活性和结构特征，以及有机分子間的相互
作用。
它还可以用来分析酶的结构和功能，从而帮助人们了解酶的作
用机制，还可以检测药物的生物学活性和结构。
未来，分子发光光谱将继续在科学研究中得到广泛应用，将在许多实
际领域，如医学、农业等方面发挥重要作用。
它将为人们提供更多关
于分子结构和性质的信息，从而有助于更深入地探索分子的特性和机制。
《分子发光光谱法》课件
分子对光的吸收具有选择性，激发光谱和发射光谱是荧光物 质的基本特征。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
分子荧光光度法
分子荧光光度法
分子荧光光度法是一种常用于检测物质浓度和反应动力学的分析方法。
它基于分子在受到光激发后发射荧光的原理，通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
在分子荧光光度法中，首先需要选择一个适合的激发波长，以激发待测物质中的荧光染料或标记物。
当激发波长的光照射到样品中时，样品中的分子吸收光能并跃迁到激发态。
在激发态停留的时间足够长时，分子会发生非辐射跃迁，即释放出荧光。
荧光的强度与待测物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
分子荧光光度法具有许多优点。
首先，它具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的物质。
其次，它具有快速和简便的特点，可以在短时间内完成测定。
此外，分子荧光光度法还具有广泛的应用领域，包括环境监测、生物学研究、医学诊断等。
然而，分子荧光光度法也存在一些限制。
首先，荧光信号受到许多因素的影响，如环境条件、荧光染料的性质等。
因此，在进行分子荧光光度法测定时，需要对这些因素进行严格的控制。
其次，某些样品可能会产生背景荧光干扰，这会降低测定的准确性。
因此，需要采取适当的方法来消除背景荧光的影响。
分子荧光光度法是一种重要的分析方法，它在物质浓度测定和反应
动力学研究等方面具有广泛的应用。
通过合理选择激发波长和采取适当的控制措施，可以获得准确和可靠的分析结果。
这种方法的发展将进一步推动科学研究和实际应用的进步。
分子发光
（ 3）基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基 态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁。
（4）激发三重态的能量较激发单重态的能量低。
2、分子能级结构与分子发射光谱
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射
跃迁方式再回到基态。
辐射跃迁：荧光、磷光的发射。 无辐射跃迁：振动弛豫（VR）、内转化（ic）、体系间 窜跃（isc）等。
A
(2.3 A) 2 (2.3 A)3 I f I o [2.3 A ] 2 3
如果吸光度A<0.05, 方括号中其他各项与第一项相比 均可忽略:
I f 2.3 I o A
由于A=bc，故在实验条件固定时，荧光强度与浓
度成正比，即：
I f 2.3I 0 A
抗体、抗原
酶联免疫吸附分析示意 Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）
2. 荧光与有机化合物结构的关系
（1）跃迁类型 对于大多数荧光物质，首先经历激发，然后经过
振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。
（2）共轭效应 容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光。 增加体系的共轭度荧光效率将增大，主要是由于增大荧 光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子。
类型 转入三重态猝灭： 溶解氧与荧光物质。 发生电子转移反应猝灭： 猝灭剂与荧光物质。 浓度较高单重激发态的分子在 荧光物质的自猝灭： 发生荧光之前和未激发的荧光 物质分子碰撞而引起的自猝灭。 29
二、荧光分析仪
Cary Eclipse 荧光分光光度计 荧光、磷光化学/生物发光 美国瓦里安技术中国有限公司
抗磁性。
当分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生电子自旋方
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反而降低，有时发生荧光猝灭效应。
14.3 荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器——主要由光源、2个单色器、
液槽、检测器和显示器组成
I0
光源 第一单色器
I
液池
吸收检测器
l ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
①两个单色器
l em
检测器 放大器及记录器
②检测器与激发光互成直角
1、光源
激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的 发射强度；适用波长范围宽 分光光度计计中，常使用氘灯、卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
T1 → S0跃迁
电子由S0进入T1的可能过程：
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1
发光速度很慢： 10-3～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
荧光 ( 磷光 ) ：光致发光，照射光波长
如何选择？
1. 荧光(磷光)激发光谱
固定发射波长，化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光激发波长的关系曲线
不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形 成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产 生荧光 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+（如 Al3+、 Mg2+）形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加 M 强 OH OH
N
N
（4）取代基的类型
取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影 响。分成三类：
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
不产生荧光
产生荧光
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 法测定
• 3，4-苯并芘是强致癌物
lex = 386 nm lem = 430 nm
（2） 刚性平面结构—较稳定的平面结构
具有强荧光的分子多数有刚性平面结构Hale Waihona Puke 光致发光及影响荧光发射因素
荧光 涉及吸收和发射两个过程 1.基态--激发态
基态 ﹡
n ↑↓ ↑↓ ↑ ↑↓ ↑↓
激发态
↑ ↑↓ ↑↓ n→﹡ S=1 M=2S+1=3 激发三重态 T ↓ ↑↓ ↑↓
分立轨道上 非成对电子 平行自旋更 稳定
→﹡
净电子自旋 S=0 分子多重态 M=2S+1=1 单重基态 S0 S=0
5. 溶液荧光的猝灭
荧光猝灭——荧光物质与溶剂或其它物质之间发生 化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效 率f 下降称为荧光猝灭。
使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂
氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是 常见的荧光猝灭剂
碰撞猝灭—— M +l激 → M*；M* + Q → M + Q +热 静态猝灭——荧光分子与猝灭剂形成不发荧光的基 态配合物
荧光显微镜
38
应用示例
利用三明治夹心免疫法研究MCF-7 肿瘤细胞表面MUC1蛋白的 表达，以正常细胞HepG2为对照
From left to right: Hoechst fluorescence excited at 405 nm; FITC fluorescence excited at 488 nm; bright field and merged. Scale bars: 20 μm.
利用汞蒸气放电发光的 应用最广泛的一种光 光源；常用其发射365 nm、 源，可发射 250~800nm 405 nm、 436 nm 三条谱线 很强的连续光源 以365 nm 的谱线最强
2、单色器
荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析， 不能获得光谱
大多数荧光光谱仪采用两个光栅单色器，有较高的分
二、分子荧光分析法的特点
1. 灵敏度高
荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光 强度，可提高荧光强度。
激发光 强 发射荧光 强 激发 物质
荧光检测的信号是发射光的绝对强度，采用高灵 敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光 分析法比分光光度法低2~4个数量级
2. 选择性好
不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发 光波长
较高激发态 吸收能 量受激 基 态 光辐射 退激
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为 以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光
荧光—荧光分析法
磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法
发射荧光的能力， f 越大，荧光越强，在0~1之间
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数 有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射
2. 荧光（磷光）与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生 *、n * 跃迁，产生荧光
*与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大 102~103，寿命短
但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
OH
_ O
例：—苯酚 无荧光 有荧光
另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性
4. 内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧
光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
14.2
荧光和磷光光谱法
一、荧光和磷光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁 产生荧光和磷光 基态分子 光照激发 价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基 态
在光致激发和去激发的过程中，分子中的价电 子（ 、n电子）处于不同的自旋状态，通常用 电子自旋状态的多重性来描述。
辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧
光光谱
第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳 激发波长l ex ，用此激发光激发液池内的荧光物质 第二单色器作用：滤掉杂散光和杂质所发射的干扰光， 用来选择测定用的荧光波长l em。
在选定的l em 下测定荧光强度，定量分析
3、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面 都透光，只能用手拿棱或最上边 4、检测器 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏 度，荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是 因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光 强度可 大大提高荧光强度 5、读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱 和发射光谱
不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光 波长
比较容易排除其它物质的干扰，选择性好
3. 实验方法简单
4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广
发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物， 广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧 产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用广泛
*跃迁常产生较强的荧光 n *跃迁产生的荧光弱，但可产生系间跨跃，产 生更强的磷光
（1） 共轭体系——有较强的荧光 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭 程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越 大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强
f 苯 萘 蒽 菲 0.11 0.29 0.46 l ex /nm 205 286 365 lem /nm 278 310 400 350
五、荧光强度与荧光物质浓度的关系
用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质 时，产生荧光，荧光强度If 用仪器测得，在荧光 浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度If 与浓度 呈线形关系
只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或
痕量组分，灵敏度高
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If
M=2S+1=1 激发单重态 S
允许
允许
禁阻
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过 辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 T2
（c）影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、
- SO3H等
四 环境对荧光、磷光的影响
1. 溶剂的影响 同一荧光物质在不同溶剂中会有不同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长红移，荧光
强度增大
2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度
辐射跃迁的速率基本不随温度变，非辐射跃迁随温
度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升
620
3.激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长。 振动弛豫消耗了能量+溶剂的弛豫作用 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生 不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。 发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回 第一激发单重态的最低振动能级
14.3 荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器——主要由光源、2个单色器、
液槽、检测器和显示器组成
I0
光源 第一单色器
I
液池
吸收检测器
l ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
①两个单色器
l em
检测器 放大器及记录器
②检测器与激发光互成直角
1、光源
激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的 发射强度；适用波长范围宽 分光光度计计中，常使用氘灯、卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
T1 → S0跃迁
电子由S0进入T1的可能过程：
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1
发光速度很慢： 10-3～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
荧光 ( 磷光 ) ：光致发光，照射光波长
如何选择？
1. 荧光(磷光)激发光谱
固定发射波长，化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光激发波长的关系曲线
不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形 成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产 生荧光 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+（如 Al3+、 Mg2+）形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加 M 强 OH OH
N
N
（4）取代基的类型
取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影 响。分成三类：
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
不产生荧光
产生荧光
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 法测定
• 3，4-苯并芘是强致癌物
lex = 386 nm lem = 430 nm
（2） 刚性平面结构—较稳定的平面结构
具有强荧光的分子多数有刚性平面结构Hale Waihona Puke 光致发光及影响荧光发射因素
荧光 涉及吸收和发射两个过程 1.基态--激发态
基态 ﹡
n ↑↓ ↑↓ ↑ ↑↓ ↑↓
激发态
↑ ↑↓ ↑↓ n→﹡ S=1 M=2S+1=3 激发三重态 T ↓ ↑↓ ↑↓
分立轨道上 非成对电子 平行自旋更 稳定
→﹡
净电子自旋 S=0 分子多重态 M=2S+1=1 单重基态 S0 S=0
5. 溶液荧光的猝灭
荧光猝灭——荧光物质与溶剂或其它物质之间发生 化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效 率f 下降称为荧光猝灭。
使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂
氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是 常见的荧光猝灭剂
碰撞猝灭—— M +l激 → M*；M* + Q → M + Q +热 静态猝灭——荧光分子与猝灭剂形成不发荧光的基 态配合物
荧光显微镜
38
应用示例
利用三明治夹心免疫法研究MCF-7 肿瘤细胞表面MUC1蛋白的 表达，以正常细胞HepG2为对照
From left to right: Hoechst fluorescence excited at 405 nm; FITC fluorescence excited at 488 nm; bright field and merged. Scale bars: 20 μm.
利用汞蒸气放电发光的 应用最广泛的一种光 光源；常用其发射365 nm、 源，可发射 250~800nm 405 nm、 436 nm 三条谱线 很强的连续光源 以365 nm 的谱线最强
2、单色器
荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析， 不能获得光谱
大多数荧光光谱仪采用两个光栅单色器，有较高的分
二、分子荧光分析法的特点
1. 灵敏度高
荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光 强度，可提高荧光强度。
激发光 强 发射荧光 强 激发 物质
荧光检测的信号是发射光的绝对强度，采用高灵 敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光 分析法比分光光度法低2~4个数量级
2. 选择性好
不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发 光波长
较高激发态 吸收能 量受激 基 态 光辐射 退激
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为 以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光
荧光—荧光分析法
磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法
发射荧光的能力， f 越大，荧光越强，在0~1之间
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数 有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射
2. 荧光（磷光）与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生 *、n * 跃迁，产生荧光
*与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大 102~103，寿命短
但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
OH
_ O
例：—苯酚 无荧光 有荧光
另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性
4. 内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧
光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
14.2
荧光和磷光光谱法
一、荧光和磷光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁 产生荧光和磷光 基态分子 光照激发 价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基 态
在光致激发和去激发的过程中，分子中的价电 子（ 、n电子）处于不同的自旋状态，通常用 电子自旋状态的多重性来描述。
辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧
光光谱
第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳 激发波长l ex ，用此激发光激发液池内的荧光物质 第二单色器作用：滤掉杂散光和杂质所发射的干扰光， 用来选择测定用的荧光波长l em。
在选定的l em 下测定荧光强度，定量分析
3、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面 都透光，只能用手拿棱或最上边 4、检测器 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏 度，荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是 因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光 强度可 大大提高荧光强度 5、读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱 和发射光谱
不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光 波长
比较容易排除其它物质的干扰，选择性好
3. 实验方法简单
4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广
发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物， 广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧 产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用广泛
*跃迁常产生较强的荧光 n *跃迁产生的荧光弱，但可产生系间跨跃，产 生更强的磷光
（1） 共轭体系——有较强的荧光 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭 程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越 大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强
f 苯 萘 蒽 菲 0.11 0.29 0.46 l ex /nm 205 286 365 lem /nm 278 310 400 350
五、荧光强度与荧光物质浓度的关系
用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质 时，产生荧光，荧光强度If 用仪器测得，在荧光 浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度If 与浓度 呈线形关系
只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或
痕量组分，灵敏度高
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If
M=2S+1=1 激发单重态 S
允许
允许
禁阻
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过 辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 T2
（c）影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、
- SO3H等
四 环境对荧光、磷光的影响
1. 溶剂的影响 同一荧光物质在不同溶剂中会有不同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长红移，荧光
强度增大
2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度
辐射跃迁的速率基本不随温度变，非辐射跃迁随温
度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升
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3.激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长。 振动弛豫消耗了能量+溶剂的弛豫作用 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生 不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。 发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回 第一激发单重态的最低振动能级