X连锁凋亡抑制蛋白对肺癌细胞生长和细胞周期的影响
细胞周期与癌症发生的关系
细胞周期与癌症发生的关系癌症是一种严重的疾病，它的发生和发展与人体细胞的分裂与分化密切相关。
细胞的生命周期包括G1期、S期、G2期和M期，其中S期是DNA合成期，M期是有丝分裂期。
正常情况下，细胞周期能够有序地进行，确保细胞分裂和分化的正确性和数量。
而在癌症细胞中，细胞周期发生了异常变化，导致细胞的不受控制的增殖和分裂，从而形成恶性肿瘤。
不同于正常细胞，癌症细胞在细胞周期中出现了许多异常情况。
癌症细胞中的G1期较短，这意味着它们更容易进入S期。
同时，S期也会变长，并且在这个阶段DNA复制发生异常，导致染色体结构的改变和突变的形成。
G2期也会缩短，而M期则变长。
这些异常的改变会导致许多细胞因子的异常表达，包括细胞周期相关的蛋白，信号转导分子和结构蛋白等。
这些异常会导致细胞凋亡途径的失活和DNA修复系统的失灵，从而使细胞得以生存下来并持续增殖。
癌症细胞的凋亡途径被破坏了，在正常细胞中，如果细胞周期出现了异常，则会通过检查点调控来激活细胞凋亡途径，从而避免异常细胞继续生长和分裂。
而在癌症细胞中，由于检查点系统异常，这些细胞始终处于无法终止生长的状态，从而导致肿瘤的持续生长和扩散。
癌症细胞的DNA修复系统也会受到影响。
正常细胞在DNA受到损伤时会通过多种机制修复DNA，包括核苷酸修复、碱基切除修复和非同源末端连接等方式。
而在癌症细胞中，这些修复机制也会受到损害，导致与生俱来的DNA损伤的积累，从而增加了癌症发生的风险。
此外，癌症细胞中还存在着一些细胞周期控制蛋白的表达异常。
例如，肿瘤抑制因子p53和BRCA等蛋白，在正常情况下可以控制细胞周期，并保证细胞的正常生命周期。
而在癌症细胞中，这些蛋白的表达异常，导致细胞周期无法得到良好的控制和调节，从而促进了细胞的不受控增殖和癌症的发展。
总的来说，细胞周期与癌症发生的关系非常密切。
癌症细胞的细胞周期异常会导致细胞增殖和分化的不受控制，从而形成肿瘤。
未来，通过研究这些异常机制，我们可以更好地理解癌症的发生和发展，并探索更多有效的治疗方法。
细胞凋亡和细胞周期蛋白在杀伤癌细胞中的协同作用分析
细胞凋亡和细胞周期蛋白在杀伤癌细胞中的协同作用分析癌症是当今世界最为严重的健康问题之一。
它的发病率和死亡率在不断上升。
虽然医学科技的发展带来了种类繁多的治疗手段，但是大部分治疗方法都有很多副作用和限制。
其中，化疗是目前最常用的治疗方法之一，但随着时间的推移，癌细胞也会对化疗药物产生耐药性，从而影响治疗的效果。
因此，研究新的杀伤癌细胞的手段和机理显得格外重要。
细胞凋亡和细胞周期蛋白是两个常见的癌症治疗靶点。
在这里，我们将详细讨论它们在杀伤癌细胞中的协同作用。
一、细胞凋亡细胞凋亡指的是一种能够引导细胞死亡的过程。
这个过程又分成多个不同的部分，其中包括细胞的凋亡信号传递、凋亡启动和执行。
在正常情况下，细胞凋亡可以帮助机体清除老化细胞和受损细胞，从而保护机体免受癌变和疾病的侵袭。
然而，在某些情况下，细胞凋亡反应被抑制，从而导致恶性肿瘤的形成。
因此，研究细胞凋亡已经成为了癌症治疗中的一个重要方向。
在细胞凋亡过程中，有一些蛋白质能够发挥重要作用。
例如，Bcl-2和Bcl-xL是抑制凋亡的关键蛋白，而Bax和Bad则是促进凋亡的蛋白。
另外，Caspase蛋白家族也是细胞凋亡的关键调节蛋白。
Caspase通过自我激活和相互作用来启动细胞凋亡。
二、细胞周期蛋白细胞周期蛋白是控制细胞周期的调节蛋白。
它们的功能在于调节细胞的增殖和分裂。
细胞周期蛋白包括多个家族和多个不同的亚基。
其中，Cyclin D和Cyclin E是调节细胞进入S期和G2/M期的关键蛋白。
在细胞被促使进入细胞周期时，这些蛋白会被活化并与Cdk蛋白相互作用，从而进一步激活细胞周期。
三、细胞凋亡和细胞周期蛋白的协同作用细胞凋亡和细胞周期蛋白在杀伤癌细胞过程中可以有协同作用。
例如，如果锁定了Cyclin E/Cdk2道路，那么癌细胞将被迫停留在G1期甚至无法进入S期。
这种情况下，凋亡促进剂就可以被应用来快速诱导癌细胞凋亡。
这是一种常见的癌症治疗方法。
细胞凋亡促进剂能够通过阻止Bcl-2或Bcl-xL等凋亡抑制蛋白的作用来启动凋亡。
细胞增殖与凋亡在肿瘤发生中的作用机制
细胞增殖与凋亡在肿瘤发生中的作用机制肿瘤是一种严重的疾病，其发生机制复杂，受到多种因素的影响。
其中，细胞增殖与凋亡是肿瘤发生过程中最为关键的机制之一。
本文将深入探讨细胞增殖与凋亡在肿瘤发生中的作用机制。
一、细胞增殖的基本原理细胞增殖是细胞分裂和生长的过程，是细胞生命活动中最基本的过程之一。
在正常情况下，细胞增殖受到严格的控制，以保证细胞的数量和质量都符合机体需要。
当机体需要大量细胞时，细胞增殖会增加，反之则会减少。
细胞增殖主要由两个过程组成：DNA复制和细胞分裂。
在DNA复制过程中，细胞会将其自身的DNA复制一份，从而增加DNA的数量。
而在细胞分裂过程中，细胞会将复制过后的DNA 平分到两个细胞之间，形成两个新的细胞。
在细胞增殖过程中，有许多因素可以影响细胞的增殖速度，如细胞因子、生长因子等。
这些因素可以通过与细胞膜上的受体结合，从而促进或抑制细胞增殖。
二、细胞增殖与肿瘤发生在肿瘤发生中，细胞增殖是一个至关重要的过程。
肿瘤细胞的特点之一是快速的增殖速度。
这种快速增殖是由多种因素引起的。
首先，癌细胞的生长因子和细胞因子水平往往异常高。
这些物质可以刺激癌细胞的增殖，从而导致肿瘤的快速发展。
其次，癌细胞的染色体异常往往会导致基因的突变或失控，从而导致细胞增殖不受正常的调控。
此外，癌细胞的生存环境和正常细胞也有所不同。
癌细胞常常处于低氧、高酸、高温、高压等极端的环境下，这些状况会通过多种方式促进肿瘤细胞的增殖。
三、细胞凋亡的基本原理细胞凋亡是一种自我调控的程序化细胞死亡过程，通常用于清除机体中不需要的或有害的细胞。
细胞凋亡的过程是高度规范的。
首先，细胞会通过外部和内部信号检测到自身存在问题。
然后，它会通过一系列反应，包括增强自我消化和压制自我生长等，最终导致自身死亡。
在细胞凋亡过程中，有两条主要的信号通路：内源性途径和外源性途径。
内源性途径是由于细胞内部的某些问题而引起的，如DNA损伤等。
外源性途径通常是由于外部信号引起的，如细胞因子的缺失、外部化学物质的刺激等。
细胞增殖与凋亡途径及其在肿瘤治疗中的应用
细胞增殖与凋亡途径及其在肿瘤治疗中的应用细胞增殖和凋亡是生物体内最为重要的细胞信号传导途径之一。
它们对于生物的正常发育和组织修复、再生起到至关重要的作用。
而在肿瘤的形成和治疗中，细胞增殖和凋亡也扮演着非常重要的角色。
本文将对细胞增殖和凋亡途径的基本原理进行介绍，并阐述它们在肿瘤治疗中的应用。
一、细胞增殖途径细胞增殖是细胞在分裂周期中不断重复的过程，其分为四个阶段：G1期、S期、G2期以及M期。
在这个过程中，细胞必须依赖于复杂的信号传导途径来保证正常的增殖过程。
其中最为关键的信号通路是细胞周期调控蛋白（CDK）-细胞周期抑制蛋白（CKI）信号通路。
CDK与CKI是相互作用的蛋白，可以控制细胞周期的进程。
在G1到S期间，CDK的活性升高，CKI的表达下降，这时间细胞进入S期。
而在S和G2期间，CDK和CKI的相互作用表明细胞的生长阶段已经完成，而进入M期。
此外，各种外界环境因素（例如DNA损伤）也会影响CDK与CKI的相互作用，归纳为细胞应激信号通路。
现代肿瘤治疗中，细胞增殖途径的调控成为了关键的治疗手段。
例如，一些药物可以通过抑制CDK与CKI的相互作用来诱导细胞的凋亡，从而防止癌细胞增殖。
二、细胞凋亡途径细胞凋亡是由于DNA损伤、外界压力或其他原因引起的一种自我死亡的程序性途径。
细胞凋亡的主要机制包括线粒体途径和死亡受体途径。
线粒体途径主要是由于线粒体膜受到损伤，导致线粒体内部的细胞色素c溢出，从而触发细胞凋亡。
而死亡受体途径则是由于外界信号分子与细胞表面的受体结合，从而引起一连串的细胞内磷酸化反应，并最终导致细胞凋亡。
肿瘤细胞与正常细胞有一个重要的区别，就是其凋亡途径被失调了。
一般来说，肿瘤细胞会通过多种机制来逃避凋亡，使得它们无法被细胞凋亡途径所消灭。
因此，目前肿瘤治疗中，研究细胞凋亡途径的调控成为一个热门的领域。
三、细胞增殖与凋亡在肿瘤治疗中的应用在肿瘤治疗中，许多药物都是设计用来干扰细胞增殖和凋亡的途径，从而达到杀死癌细胞的目的。
细胞周期调控基因变异与肿瘤的发生
细胞周期调控基因变异与肿瘤的发生随着基因测序和生物技术的发展，越来越多的人知道了细胞周期调控基因在肿瘤发生中的重要性。
细胞周期调控基因的突变可能导致细胞失去正常的调控，进一步导致肿瘤的发生。
这篇文章将详细介绍细胞周期调控基因的作用、突变和肿瘤的发生。
细胞周期基因的作用细胞周期是指细胞从一个分裂到另一个分裂之间所经历的一系列阶段，包括G1期、S期、G2期和M期。
在这些阶段中，细胞需要通过不同的蛋白质来完成各种任务。
这些蛋白质被称为细胞周期调控蛋白。
它们可以分为两类：激酶和抑制物。
激酶，如CDK激酶，可以将细胞周期调控蛋白激活，使细胞进行下一个阶段的工作。
抑制物，如p53和p21，可以阻止细胞进行下一个阶段的工作，以确保细胞处于稳定状态。
这两种类型的细胞周期调控蛋白都非常重要，因为它们可以保证细胞进行正常的周期，而不会出现突变或不正常的生长。
细胞周期基因的突变细胞周期调控基因的突变可能导致细胞周期失衡，使细胞无法正常调控自身的生长和分裂。
当这种失调发生在某些基因中时，它们可能会变成肿瘤抑制基因。
这些基因通常会抑制细胞的增殖，以防止它们成为癌细胞。
然而，当这些基因变异时，它们可能无法有效抑制细胞的增殖，从而导致细胞转化为癌细胞。
现在已经发现了很多肿瘤抑制基因的突变，如p53和RB1。
在许多不同类型的癌症中，这些基因都发生了突变。
这表明这些基因确实在肿瘤发生中起着重要的作用。
肿瘤的发生肿瘤的发生是一个复杂的过程，牵涉到许多基因和信号通路。
然而，细胞周期调控基因突变是肿瘤发生的一个重要因素。
当这些基因突变时，它们会影响细胞周期的调节和细胞的生长和分裂。
这可能会导致细胞过度增殖和潜在的癌变。
一些研究表明，肿瘤是由单个的细胞开始发展的，这个细胞可能已经发生了一个或多个突变。
当这些细胞不断分裂和增殖时，这些突变可能会引起其他细胞的突变。
最终，这些细胞会形成具有癌性的肿瘤。
结论细胞周期调控基因的突变是肿瘤发生的一个重要因素。
凋亡抑制蛋白在人类癌症细胞生长中的作用
凋亡抑制蛋白在人类癌症细胞生长中的作用癌症是世界各国公共卫生问题，其病因十分复杂。
癌症细胞是指某一种或几种细胞发生恶性变异后失去了正常生长和分化控制能力的细胞。
影响癌症细胞生长的因素非常多，其中一个关键因素是凋亡抑制蛋白。
凋亡抑制蛋白是一种抑制细胞程序性死亡的蛋白，对癌症的发生和发展有一定的作用。
凋亡抑制蛋白的作用机制细胞程序性死亡是一种自我调节的程序性死亡方式，可以通过基因调控和内外环境信号等因素来触发。
当细胞受到损伤或环境变化时，会产生一系列事件，触发关键基因的表达，导致空泡化、核裂解、细胞溶解等死亡现象。
而凋亡抑制蛋白的主要机制是通过抑制程序性死亡途径中的关键蛋白激酶等死亡因子，在多种等途径中发挥抑制作用。
凋亡抑制蛋白对癌症的影响在正常情况下，细胞程序性死亡是一个平衡的过程，细胞维持正常生长，修复和更新。
而当凋亡抑制蛋白过度表达或功能异常时，细胞程序性死亡的平衡被破坏，以肿瘤细胞形式逐渐增殖。
研究表明，许多癌症细胞会在失去凋亡抑制蛋白的抑制作用后出现程序性死亡现象。
逆之，过度表达凋亡抑制蛋白的癌症细胞会增强自身的耐药性和侵袭性，加强最终的生成和扩散能力。
凋亡抑制蛋白在放疗和化疗中的作用放疗和化疗是生物治疗器治疗癌症的常见方法之一，通过杀死癌细胞并减少癌细胞的数量来遏制癌症的发展。
然而，由于癌症细胞往往过度表达凋亡抑制蛋白，难以通过程序性死亡清除癌细胞，因此放疗和化疗的疗效比较有限。
在这方面，科学家在研究中尝试使用药物或其他手段来降低癌症细胞的凋亡抑制蛋白含量。
因为这样就能加强放疗和化疗杀伤癌细胞，往往会导致癌细胞的初始成果。
凋亡抑制蛋白在治疗和预防癌症中的应用研究发现，在某些情况下，抑制凋亡抑制蛋白的方法可以诱导癌症细胞保持程序性死亡，从而有效清除癌细胞。
应用于防癌是，人们可以尝试通过个体基因检测等方式，及早发现凋亡抑制蛋白异常变化，从而提前宣响警示，加强体育锻炼和恰当食物调整来降低癌症发病风险。
细胞增殖的调控机制及其与癌症的关系
细胞增殖的调控机制及其与癌症的关系概述一个成年人由数万亿个细胞组成，这些细胞不断增殖、更新，以维持身体正常功能。
细胞增殖一定程度上受调控，过度的细胞增殖可能导致癌症。
了解细胞增殖的调控机制及其与癌症的关系，对癌症的预防、诊断和治疗都有重要意义。
细胞增殖的调控机制细胞增殖可以分为两个阶段：有丝分裂和无丝分裂。
在有丝分裂中，细胞核分裂成两个细胞核。
在无丝分裂过程中，细胞核不会分裂，但是细胞质会增加，从而导致细胞的数量增加。
细胞增殖的调控是一个非常复杂的过程，包括许多分子、信号通路和细胞周期调控蛋白。
细胞周期调控蛋白具有非常重要的调控作用，它们能够促进或抑制细胞增殖，从而参与细胞周期的调节。
其中最为关键的分子是细胞周期蛋白和其配体细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）。
在细胞周期不同的阶段，CDK与不同的配体结合，从而促进或抑制细胞增殖。
此外，细胞周期调控蛋白还包括细胞周期抑制蛋白（CDKIs），它们通过抑制CDK的活性从而调节细胞增殖。
除了细胞周期调控蛋白，许多信号通路也能对细胞增殖进行调控。
比如，胞内信号分子WNT/β-catenin通路是一个重要的调控途径，通过激活β-catenin来促进细胞增殖，抑制蛋白素激活剂蛋白激酶（PKA）信号路径可抑制细胞增殖。
与癌症的关系癌症是指由于基因突变或遗传变异等原因导致细胞增殖过度、失控的一类疾病。
在正常情况下，细胞增殖是受调控的，但某些基因的突变，或者其他调控机制的失常，可能导致细胞无法停止增殖。
这些细胞不断分裂，形成肿瘤。
这些由于基因突变或遗传变异导致的异常细胞增殖和分化，可以是肿瘤的早期阶段。
正常细胞的增殖通常是有限和受到紧密的控制，但是在癌细胞中，细胞增殖的调控机制被破坏，使癌细胞能够无限制地增殖和扩散，形成恶性肿瘤。
癌症研究者已经发现，许多与细胞周期调控相关的基因在肿瘤中被突变或失活。
这些基因包括肿瘤抑制基因和肿瘤促进基因，它们可以通过不同的方式影响细胞周期的进程。
细胞周期调控与凋亡的关系研究
细胞周期调控与凋亡的关系研究在细胞生命周期中，细胞周期调控是非常重要的一个过程。
细胞周期调控负责控制细胞进入不同的生命周期状态，并决定细胞何时进行分裂。
细胞周期调控的失调可能导致细胞凋亡、疾病和癌症等问题。
在许多癌症研究中，人们发现细胞周期失调是癌症的一个主要因素之一。
在这篇文章中，我们将探讨细胞周期调控与细胞凋亡之间的关系，并探讨这个关系对癌症治疗的潜在影响。
1.细胞周期调控细胞周期调控是指一系列的细胞分裂相关蛋白质（CDKs）的激活和抑制作用，使细胞进入一个特定的生命周期状态。
这个过程可以被分为四个不同的阶段：G1、S、G2和M期。
在G1期，细胞生长并准备进行DNA复制。
在S期，细胞的DNA被复制。
在G2期，细胞准备对DNA进行核有丝分裂。
在M期，分裂产生两个相同的细胞。
细胞周期调控中的关键蛋白质包括CDKs和其配体蛋白质Cyclin，以及细胞周期抑制剂。
这些蛋白质在整个细胞周期中，通过磷酸化等方式相互作用、协调细胞的正常分裂。
2.细胞凋亡细胞凋亡是正常的细胞死亡过程。
当细胞分裂受到压力、DNA损伤或其它压力时，细胞通常会自杀以避免进一步的损伤。
在细胞凋亡过程中，细胞会自我降解并产生细胞内肿瘤坏死因子（TNF）等信号分子，可以引起一个链式反应，最终导致细胞死亡。
凋亡被认为是“清理”身体内有损组织的一种保护机制。
3.细胞周期调控与细胞凋亡之间的关系在细胞周期中，细胞在与各种分子和细胞因子的互动过程中调节DNA复制和细胞分裂。
如果细胞受到DNA损伤或其他压力，则会停止细胞周期，并调节细胞进入细胞凋亡。
当未经充分修复的细胞无法执行DNA复制和受损的基因调控过程，细胞凋亡就会发生。
细胞凋亡过程中，细胞周期调控中一些关键蛋白质，如P53、MDM2等也会参与。
P53是一个重要的细胞周期调控蛋白质，可以通过激活MDM2蛋白质来抑制细胞的有丝分裂，并刺激细胞进入凋亡深层过程。
细胞周期的失调可以导致细胞凋亡，这被认为是许多癌症的一个主要原因之一。
细胞周期调控和癌症的关系
细胞周期调控和癌症的关系细胞是构成人体的基本单位，细胞周期调控是维持细胞有序增殖和发育的基础。
然而，许多癌症是由于细胞周期调控失常引起的。
细胞周期是一个复杂的过程，由许多分子和信号网络控制。
本文将探讨细胞周期调控和癌症的关系，从基础知识、癌症发生机制、治疗措施等方面进行阐述。
基础知识细胞周期分为G1期、S期、G2期和M期四个阶段。
G1期是细胞之间最长的阶段，此时细胞对外界信号和内部环境的评估最为重要。
如果细胞接收到增殖刺激，细胞生长必不可少。
在G1期的末尾，细胞会经历一个叫做“restriction point”的控制点，确定细胞是否继续进入S期。
在S期，细胞会复制一份基因组。
G2期是一个较短的阶段，细胞在这里准备进入有丝分裂。
在有丝分裂的M期，细胞会将自己的基因组分为两个完全相同的细胞。
信号通路和调控因子细胞周期调控信号通路包括许多不同的分子和信号通路，如细胞周期蛋白（CDKs）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）抑制剂、核激素受体、细胞周期蛋白E等。
这些分子可以调节细胞周期的不同阶段，例如，CDKs可以促进细胞进入S期和M期。
而CDKs抑制剂则可以阻止细胞进入S期和M期。
除了这些信号通路之外，还有一些蛋白质也参与了细胞周期的调控。
例如：P53和Rb蛋白。
P53是一种分子，可以依靠细胞的内外部刺激而表达或不表达，它可以调控G1期和S期之间的控制点。
Rb蛋白是重要的调控蛋白，它可以阻止CDKs和E2F之间的相互作用，从而防止细胞进入S期。
癌症发生机制当细胞周期被打乱时，细胞生长和分裂就会失常，从而引起癌症。
细胞周期问题可能由许多因素引起，如基因突变、DNA损伤、病毒感染、环境因素等。
癌细胞通常是由一些细胞发生突变或变异而来的。
一些肿瘤易感基因的突变可能导致细胞周期失控，从而形成癌细胞。
例如Rb和P53基因的突变被认为是一些癌症的常见原因。
治疗措施目前，化疗、放疗和手术仍然是癌症的主要治疗方法。
然而，一些治疗性药物已经被用于干预细胞周期，这些药物通常是针对细胞周期中不同分子的调节因子。
细胞周期调控与癌症发生的关系
细胞周期调控与癌症发生的关系在我们的身体中，细胞如同一个个微小的生命工厂，不断地进行着生长、分裂和死亡的过程。
而这个有序的过程被称为细胞周期，它受到精密的调控以确保细胞的正常功能和身体的健康。
然而，当细胞周期的调控出现故障时，就可能引发一系列严重的问题，其中最为严重的就是癌症的发生。
细胞周期就像是一场精心编排的舞蹈，每个步骤都有其特定的节奏和规律。
它可以大致分为几个阶段：G1 期（细胞生长和准备 DNA 合成）、S 期（DNA 合成）、G2 期（细胞继续生长并准备细胞分裂）以及 M 期（细胞分裂）。
在这整个过程中，有一系列的“指挥家”——细胞周期调控因子，它们确保细胞在适当的时候进入下一个阶段，并且不会出现过早或过晚的错误。
细胞周期的正常调控依赖于多种蛋白质和分子机制。
其中，细胞周期蛋白（Cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）是关键的调控因子。
细胞周期蛋白的浓度会随着细胞周期的进程而变化，它们与CDKs 结合形成复合物，从而激活 CDKs 的激酶活性，推动细胞周期的进展。
例如，在 G1 期，Cyclin D 与 CDK4/6 结合，促进细胞通过 G1 检查点，进入 S 期进行 DNA 合成。
此外，还有一些检查点机制来监控细胞周期的进程。
G1 检查点决定细胞是否准备好进入 S 期进行 DNA 复制，G2 检查点确保 DNA 复制没有错误并且细胞准备好进入 M 期，M 期检查点则保证染色体正确分离。
这些检查点就像是交通信号灯，只有在一切条件都满足时才允许细胞继续前进。
那么，当细胞周期调控出现问题时，是如何导致癌症发生的呢？首先，如果细胞周期蛋白或 CDKs 出现过度表达或异常激活，细胞可能会不受控制地进入细胞周期的下一个阶段，导致细胞过度增殖。
例如，在许多癌症中都发现了 Cyclin D 的过度表达，这使得细胞更容易进入 S 期，增加了基因突变的风险。
其次，肿瘤抑制基因的失活也是导致细胞周期失控的重要原因。
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收稿日期223作者简介高 岩(2),女,主治医师,硕士,从事肺癌的诊治研究。
第25卷 第3期2007年6月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University (Natural S cience )V ol.25 N o.3Jun.2007文章编号:100727383(2007)0320335204X 连锁凋亡抑制蛋白对肺癌细胞生长和细胞周期的影响高 岩1,苏 远2,白 明2,金 阳2,朱莉萍3(1石河子大学医学院第一附属医院,新疆石河子832008;2华中科技大学同济医学院附属协和医院,湖北武汉430022;3华中科技大学同济医学院病理生理学系中心试验室,湖北武汉430022)摘要:为了研究靶向X 连锁凋亡抑制蛋白的发夹状RNA 对肺癌细胞中抗肿瘤作用,构建XIAP 基因的shRN A 表达载体,并设计阴性对照(psiRN A 2C on)质粒,分别转染A549细胞;实时定量PCR 和免疫印记法分别检测XIAP 的mR 2NA 和蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐试验(MT T )检测A549细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期分布。
实验结果表明:转染psiRN A 2XIAP 组细胞XI AP mRN A 和蛋白水平均低于正常对照组,生长慢于正常组(t =16.82和t =12.13,均P <0.01),G 2/M 期细胞所占比例增高(t =3.78,P <0.05),并出现亚G 1峰。
而阴性对照质粒ps iRN A 2Con 未能下调XI AP 的表达水平,对A549细胞增殖和细胞周期亦无明显影响。
结论:针对XI AP 的R NA 干扰质粒特异性地抑制了其RN A 和蛋白水平,使肺癌细胞A 549生长减慢,诱导凋亡,并使其发生G 2/M 期阻滞,有望发展为新的抗肿瘤药物。
关键词:RN A ;XIAP ;肺肿瘤;凋亡;细胞周期中图分类号:R73519 文献标识码:A X 连锁凋亡抑制蛋白(X 2linked inhibitor 2of 2apop 2tosi s protein ,X IAP)N 端含有有3个杆状病毒I AP 重复序列区(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat ,BIR ),不仅可以凭借BIR 功能域直接抑制胱天蛋白酶23、27、29的活性阻止细胞凋亡[1,2],还可以通过C 端环指结构域(ri ng finger domain )发挥泛素连接酶功能,介导胱天蛋白酶23经蛋白酶体26S 水解[3]。
XI 2AP 除了在外周血液的白细胞外,在几乎人体的各组织器官中都有XI AP 的mRNA 表达[4],但是在恶性肿瘤组织中表达水平明显升高,认为它可能在细胞的增殖过程和细胞向恶性转化过程中发挥重要作用[5,6]。
为此本试验采用RN A 干扰技术下调XI AP 基因的表达,分析肺癌细胞生长和细胞周期的变化,初步探讨其在肺癌基因治疗中的效应。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂B Ⅰ、T q D N 聚合酶、逆转录试剂盒购自立陶宛M B I 公司,T 4连接酶为购自美国Pr omega 公司,阳离子脂质体购自美国I nviv oG en 公司,凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自美国Omega 公司,含SY BR G reen Ⅰ的PCR 反应混合物购自美国A BI 公司,MTT 为美国Biom ol 公司产品,兔抗XI AP 和兔抗β2actin 分别购自美国R &D 和Santa Cruz 公司。
1.1.2 菌种、质粒大肠杆菌DH5α、psiRN A 2hH1为华中科技大学同济医学院卫生部呼吸重点试验室保存。
1.2 方法1.2.1 psi RN A 2XI AP 质粒的构建参考文献[7]中的方法,设计针对XI AP 基因的短发夹状干扰序列,正义链5’T CCCATG TG CT ATAC A G TC ATT ACTTC AAG AG AG TA AT G ACTG TAT AG C ACAT TT ‘3;反义链:5’C A AA AA ATG TG CT AT ACAG TCATT ACTCTCTTG A AG T AATG ACTG T AT AG C AC AT 3’;阴性对照正义链5’TCCC AG G TG CT AG TA CA AG TCCG ACT C AAG AGG TCG G ACTTG TACTAG C ACCT TT ‘3;反义链为5’G G TG T G T G T G T TT:2007040:1971bs a A CA AA A AA C A ACA A CC AC C CG AG TCG G ACTTG T ACT AG CACCT,(下划线部分为XI2 AP靶序列)。
5’和3’端引入BbsⅠ酶切位点,颈环结构为TC AAG AG。
两组寡核苷酸经退火后,连接在psiRN A2hH1两个BbsⅠ位点之间,命名为psiRN A2 XI AP和psiRN A2C on。
以上序列均经上海英骏公司测序证实。
1.2.2 细胞培养与稳定转染A549细胞由武汉大学典藏中心提供,于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中,置37℃、体积分数为5%C O2的温箱中培养。
转染前1d将A549细胞分以5×104/孔接种于60mm培养皿,培养24h后按LipofectamineT M200行转染:细胞分2组:psiR NA2C on 组和psiRN A2XI AP组。
当转染48h后,加入G418(终浓度为800mg/L)筛选,直至不转染质粒的正常对照组细胞全部死亡,以含500mg/L G418的1640培养基维持10d后,挑取已经形成的单克隆继续培养备用。
1.2.3 实时定量PCR检测X I APmRNA的表达Tr iz ol一步法提取细胞总R NA,逆转录成cDN A 后,在PCR仪(澳大利亚Rotor G ene公司)上进行扩增。
引物序列:正义链5’TG CTG TG ATG G TG G ACT2 C3’,下游5’G CTTG A ACTTG ACGG ATG3’,产物长度128bp。
以作β2actin(肌动蛋白)为内参,正义链5’GG ATTTG G TCG T ATTG G G3’反义链5’G A ATTTTTTC2 AC AG TTT AT3’,产物长度205bp。
扩增条件:95℃5min,40个循环(95℃15s,58℃15s,72℃20s),72℃10min。
数据分析:使用R otor2G ene Real2Time分析软件6.0,XI AP mRNA的含量用以2-ΔΔCT表示[6]。
(ΔΔCT由各组XI AP的CT值减去相应β2actin的CT 值后,再减去正常对照组ΔCT值得出,相当于把正常对照组XI AP mRN A水平定义为1。
)1.2.4 We st ern印迹法检测XI AP蛋白水平的变化裂解细胞:50m mol/L Tris2HC l(pH7.5),150mm ol/L NaCl,1m mol/L EDT A,0.25%脱氧胆酸钠, 1%Triton X2100,0.1%S DS,1mm ol/L NaF,1mm ol/L NaV O3(钒酸钠),加蛋白酶抑制剂10μg/mL(抑肽酶),1mm ol/L P MSF(苯甲基磺酰氟化物)。
离心取上清,BCA法测蛋白浓度。
取50μg蛋白上样于12% S DS2P AG E分离,再转移至硝酸纤维素膜,XI AP抗体(1∶2000)孵育过夜,次日经羊抗兔I gG孵育、T BS洗脱后,加入EC L显色液,X光胶片曝光,冲洗。
以β2 actin做内参照。
1.2.5 细胞增殖分析采用MTT方法试分析XI AP shRN A对A549细胞生长的影响,操作按其说明书进行。
将对数期细胞接种于96孔培养板,每孔2×104个细胞,每组6个复孔,共5组,铺5块板。
于培养1、2、3、4及5d 后,每孔加入5mg/mL MTT10μL,继续培养4h,弃去液体,加入100μL D MSO,震荡10min,酶标仪测定490nm处各孔A值,以A值反映活细胞水平。
1.2.6 细胞周期分析试验分组同1.2.5。
各组细胞经乙醇220度固定48h,冰冷P BS洗3次,加入RN ase(终浓度100μg/μL),碘化丙啶(终浓度10μg/μL),4℃避光30min,上机分析。
1.2.7 统计学处理数据以表示,应用SPSS12.0进行统计学分析,两组数据间比较用t检验,多组数据间比较用方差分析。
2 结果2.1 shRNA降低XI AP mRNA的表达转染psiRN A2XI AP组A549细胞中XI AP mR NA水平只达到正常对照组的0.35(t=12.03,P<0.01),差异具有统计学意义,而转染psiR NA2C on、对A549细胞XI AP mRN A水平无明显影响,(表1)。
表1 shRN A降低X IAP mRNA的表达组别CT XI AP CTβ2actinΔCTΔΔCT2-ΔΔ正常对照组26.31±3.1623.07±4.73 3.34±0.5701阴性对照组24.97±2.5422.13±3.87 3.28±0.43-0.05±0.020.98±0.14# PsiR NA2XI AP19.81±2.2318.03±3.49 1.73±0.25-1.68±0.240.35±0.083 注:试验重复3次,与正常对照组相比,#P>0.05,3P<0.01。
2.2 shRNA降低XI AP蛋白的表达以β肌动蛋白为内参,各组细胞XI AP蛋白表达量以与内参条带灰度比值表示。
经半定量分析,以正常5XI蛋白表达量为%,则转染R N2和RN2XI组XI蛋白水平分别为98.2%±13.4%和29.7%±4.6%。
稳定表达psiRN A2 XI AP的A549细胞XI AP蛋白表达受到明显抑制(t= 33.92,P<0.01),然阴性对照组和正常组之间XI AP 蛋白水平差异无统计学意义。
图、图中R N降低5细胞XI蛋白水633 石河子大学学报(自然科学版) 第25卷pirh2A49AP100psi A C on psi A AP AP12sh A A49AP平(n =3,#P >0.05,3P <0.05)2.3 抑制XI AP 基因表达对A549细胞增殖和细胞周期的影响1:正常对照;2:ps iRN A 2C on;3:psiR NA 2X IAP图1 XI AP 蛋白电泳图2 XI AP 蛋白条带的密度分析 转染psiR NA 2XI AP 组A549细胞生长受到明显阻遏,与正常对照和阴性对照相比,差异具有统计学意义(图3)。