酒精发酵
酒精发酵
２.主发酵期 由于酵母细胞大量形成，溶解氧的耗竭， 醪液中氮、磷等缺乏，酵母已不再大量繁 殖，而主要进行酒精发酵。此阶段，醪液 中的糖分消耗迅速，酒精含量逐渐增加。
３.后发酵期 醪液中的糖分已大部分被酵母菌所利用， 但醪液中残存的糊精等多糖成分继续被转 化为可发酵性糖，酵母则将它转化为酒精。
五、酒精发酵工艺
4.酒精发酵
发言人：
一、酒精发酵的目的
将糖化醪液中的糖、糊精和淀粉转化为酒 精和二氧化碳。糖化醪送入发酵罐后，醪 液中存活的糖化酶继续作用，将糊化的淀 粉、糊精转化为可发酵性糖；同时，在酵 母作用下，醪液中的糖被发酵生成酒精和 二氧化碳。糖化作用和酵母发酵作用的互 相配合，完成了酒精发酵。
二、酒精发酵机理
大罐发酵流程
酒精大罐发酵分为：间歇发酵和连续发酵两种 1、间歇发酵
2、连续发酵
六、影响酒精发酵的因素
• 糖化醪的浓度 • 发酵醪的酸度 • 酵母用量、发酵温度和发酵时间
七、淀粉质原料生产酒精酵母回收使用
• 回收酒精发酵成熟醪中的酵母返回发酵罐供糖液 发酵用，节省了酵母培养工段，杜绝了杂菌感染， 提高了发酵罐中酵母的浓度，发酵直接进入主发 酵期，稳定提高了发酵成绩，同时缩短发酵时间， 提高了设备利用率。 • 淀粉质原料生产酒精酵母回收核心是发酵成熟醪 用泵送入纤维分离装置进行分离，先经曲筛进行 一级分离，除去纤维的醪液泵入酵母分离机，分 离出来的酵母乳返回发酵罐循环使用。淀粉质原 料生产酒精酵母回收使用主要有３个流程 。
分为间歇式、半连续式和连续式3种
１、间歇发酵 间歇发酵也称单罐发酵，发酵的全过程在 一个发酵罐内完成。 ２、半连续式发酵 半连续式发酵是主发酵阶段采用连续发酵， 后发酵阶段采用间歇发酵的方法。
酒精发酵
七、酒母制备工艺展望：
1：液曲酒母：在液曲种子内接入酒母菌种，30-32℃通风培养32hr即成。
2：耐高温酵母：一般酵母不能超过34℃，耐高温酵母能在 40℃下正常发酵。
3：利用淀粉的酵母：若酵母能直接利用淀粉，糖化即可取
消，工艺大大简化，国内外有用：糖化锅、发酵罐容积相等的小酒精厂。
B：分次添加法： 先加入1/3罐糖化醪，接入8~10%酒母，经1~3h 发酵，在加入第二次糖化醪，再经1~3h发酵， 添加第三次，直到满罐为止，发酵成熟蒸馏。 优点：发酵旺盛，迟缓期短；酵母易优势生长， 有利于抑制杂菌；冷却水用量少。 缺点：加糖化醪满罐时间应控制在10h以内，否 则后加的醪液来不及转化为糖、发酵，造成出酒 率下降。 适用范围：适于锅小罐大的工厂。
2）拉斯12号（RassXⅡ）：圆形至卵圆形，细胞 间连接较多，能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、 半乳糖和1/3棉子糖，不能发酵乳糖。
3）K字酵母（日本）：细胞个头小，卵圆 形，但生长迅速，适于高粱、大米、暑类原 料生产酒精，有不少工厂使用。 4）1300（南阳五号）：细胞椭圆形，少数 腊肠性，能发酵葡糖、麦糖、蔗糖、1/3棉 子糖，不发酵乳糖。耐酒精13%以下。 5）1308（南阳混合酵母）：圆形少数卵圆 性，适于含单宁物质较多的原料，发酵速度 快，产酒精能力强。
5、酒精发酵机理：指葡萄糖在酵母酒化酶作用 下，经一系列反应转化成酒精的生化过程。共 分4个阶段，12步骤。
6、副产物的形成[醇、醛、酸、酯四大类]： 1]甘油：糖代谢产物，一般为醪量的0.3—0.5%。 若向发酵液中添加NaHSO3或使醪液呈碱性 pH7.6，则发酵向甘油方向转化，造成出酒率 降低。[主要发生在后酵期]
酒精发酵,酒度下降的原因
酒精发酵,酒度下降的原因
酒精发酵是制造酒类饮品的关键过程，但有时候酒度会下降，降低饮品的质量和口感。
下面是酒度下降的几个原因：
1. 发酵过程不完全：在酿造酒类饮品时，如果发酵过程没有完全完成，就会导致酒度下降。
这种情况可能是因为发酵过程中缺少必要的营养物质或酵母的数量不足。
2. 酵母品质差：酵母的品质对酒类饮品的质量有很大影响。
如果使用的酵母品质差，发酵过程可能不完全，导致酒度下降。
3. 温度过高或过低：在发酵过程中，温度的控制非常重要。
如果温度过高或过低，酵母可能无法正常工作，导致酒度下降。
4. 酒精蒸发：在存储酒类饮品的过程中，如果没有正确密封或存储条件不合适，酒精可能会蒸发，导致酒度下降。
因此，在制造酒类饮品时，需要控制好发酵过程中的温度、使用优质的酵母、确保发酵过程完全，并在存储饮品时注意密封和存储条件，以避免酒度下降。
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酒精发酵
2、浓香型：
③洋河大曲：江苏泗祥县洋河镇产。
• 在清初已闻名于世，1979年获全国名酒 奖，84年获全国金杯奖。
• 特点：以江苏优质高梁为原料，以 当地 著名的“美人泉”水酿制。有64º、62º、 55º、28º等。
• 风格：色香、鲜、浓、醇
2、浓香型：
④ 其他类： • 双沟大曲——江苏省泗洪县双沟酒厂 • 全兴大曲——四川成都酒厂 • 古井贡酒——安徽毫州 • 剑南春——四川绵竹 • 孔府家酒、杜康酒
米曲霉→黄曲霉→ 黑曲霉
二、与酒精发酵有关的微生物
• 根霉和毛霉也是常用的糖化菌。 • 著名的阿米诺法，即是以根霉为
糖化菌的酒精生产方法。 • 著名的根霉菌有东京根霉(又叫河
内根霉)、鲁氏毛霉和爪哇根霉等
2、酒精发酵菌
• 许多微生物都能利用已糖化进行酒精发酵， 但在实际生产中用于酒精发酵的几乎全是酒 精酵母，俗称酒母。
• 利用糖质原料的酒母除啤酒酵母外， 还有粟酒裂殖酵母和克鲁维酵母等
2、酒精发酵菌
• 可利用葡萄糖进行发酵生产乙醇 的细菌类： ——森奈假单胞菌 ——嗜糖假单胞菌 ——总状毛霉等
• 细菌生产的工业化还在研究
酵母图片
三、酒精发酵生化机制
• 不同生产原料，酒精发酵生化过程不同 ——对糖质原料，可直接利用酵母将糖转化
杂醇油（高级醇）、醛类、酯类等。
2.酵母菌的乙醇发酵
• 理论上1moL葡萄糖可产生2moL乙醇；即180g
葡萄糖产生92g乙醇，理论得率为51.5%
• 因酵母菌体的积累约需2%的葡萄糖，另2%的
葡萄糖用于形成甘油，0.5%用于形成有机 酸，0.2%用于形成杂醇油。因此实际上只有 约47％的葡萄糖转化成乙醇。
酒精发酵的原理及应用
酒精发酵的原理及应用原理酒精发酵是一种由酵母菌等微生物催化产生的生物化学过程。
它发生在无氧条件下，通过酵母菌将碳水化合物转化为酒精和二氧化碳的过程。
这一过程主要依赖于酵母菌的代谢能力，其中主要涉及到以下两种类型的发酵：1.乙醇发酵：酵母菌将碳水化合物转化为乙醇和二氧化碳。
酵母菌在缺氧环境中，通过糖的分解产生能量，并生成乙醇作为代谢产物。
这一过程广泛应用于酿酒、酵母面包等食品工业。
2.乳酸发酵：某些乳酸菌在缺氧条件下将糖转化为乳酸。
与乙醇发酵相比，乳酸发酵产生的产物是乳酸。
乳酸发酵广泛应用于食品工业中的乳制品生产、酸奶发酵等。
应用酒精发酵广泛应用于食品工业、饮料工业以及能源生产等领域。
食品工业酒精发酵在食品工业中有着重要的应用，主要包括以下几个方面：•酿酒：通过酵母菌将葡萄汁或其他果汁中的糖转化为乙醇，从而制造各种类型的酒精饮品。
•酵母面包：酵母菌催化面团中的糖类，使其膨胀发酵，从而制造出发酵面包。
•味精生产：酵母菌发酵产生的酒精可以被用来制造味精。
饮料工业酒精发酵在饮料工业中也有着广泛的应用。
主要应用包括：•啤酒：通过对大麦等谷物中的糖类进行酒精发酵，制造出啤酒。
啤酒酵母是一种特殊的酵母菌，它能够将大麦中的糖转化为乙醇和二氧化碳，同时还赋予了啤酒独特的风味。
•葡萄酒：通过对葡萄中的果糖和葡萄糖进行乙醇发酵，制造出葡萄酒。
葡萄酒的风味和香气也与酒精发酵的过程息息相关。
•其他发酵饮料：如发酵茶、发酵果汁等。
能源生产酒精发酵在能源生产中也有一定的应用前景。
主要应用包括：•乙醇燃料：将纤维制成的素材（如玉米、甘蔗）经过发酵和蒸馏，提取出高纯度的乙醇，然后用作燃料。
乙醇燃料具有可再生、环保的特点。
•生物柴油：一些微生物也能够通过发酵产生脂肪酸甲酯，即生物柴油，该柴油可以用作传统石油柴油的替代品。
总结酒精发酵作为一种由微生物催化产生的生物化学过程，具有广泛的应用前景。
在食品工业中，它被用于酿酒、制造酵母面包和味精；在饮料工业中，它被用于酿造啤酒和葡萄酒；在能源生产中，它被用于乙醇燃料和生物柴油的制造。
酒精发酵
酒精发酵过程是一个非常复杂的生化过程,有一系列连续反应并随之产生许多中间产物,其中大约有30多种化学反应,需要一系列酶的参加。酒精是发酵过程的主要产物。除酒精之外,被酵母菌等微生物合成的其他物质及糖质原料中的固有成分如芳香化合物、有机酸、单宁、维生素、矿物质、盐、酯类等往往决定了酒的品质和风格。酒精发酵过程中会产生的二氧化碳会增加发酵温度,因此必须合理控制发酵的温度,当发酵温度高于30～34℃,酵母菌就会被杀死而停止发酵。除糖质原料本身含有的酵母之外,还可以使用人工培养的酵母发酵,因此酒的品质因使用酵母等微生物的不同而各具风味和特色。
（6）酒的老熟和陈酿
酒是具有生命力的，糖化、发酵、蒸馏等一系列工艺的完成并不能说明酿酒全过程就已终结，新酿制成的酒品并没有完全完成体现酒品风格的物质转化，酒质粗劣淡寡，酒体欠缺丰满，固以新酒必须经过特定环境的窖藏。经过一段时间的贮存后，醇香和美的酒质才最终形成并得以深化。通常将这一新酿制成的酒品窖香贮存的过程称为老熟和陈酿。
（3）制曲
酒曲亦称酒母,多以含淀粉的谷类(大麦、小麦、麸皮)、豆类、薯类和含葡萄糖的果类为原料和培养基,经粉碎加水成块或饼状,在一定温度下培育而成。酒曲中含有丰富的微生物和培养基成分,如霉菌、细菌、酵母菌、乳酸菌等,霉菌中有曲霉菌、根霉菌、毛霉菌等有益的菌种,“曲为酒之母,曲为酒之骨,曲为酒之魂”。曲是提供酿酒用各种酶的载体。中国是曲蘖的故乡,远在3000多年前,中国人不仅发明了曲蘖,而且运用曲蘖进行酿酒。酿酒质量的高低取决于制曲的工艺水平,历史久远的中国制曲工艺给世界酿酒业带来了极其广阔和深远的影响。
酒精发酵
• 淀粉 ，6葡萄糖苷酶（异淀粉酶） 淀粉-1， 葡萄糖苷酶 异淀粉酶） 葡萄糖苷酶（ 特点： 特点： 糖苷键→ （1） 作用α-1，6糖苷键→葡萄糖 ） 作用α ， 糖苷键 淀粉酶和β （2）能水解α-淀粉酶和β-淀粉酶作用后的产 ）能水解α 淀粉酶和 淀粉酶作用后的产 物
• 5.酒母制备 酒母制备 （1）实验室（营养和无菌要求较高） ）实验室（营养和无菌要求较高） 原菌→斜面试管 液体试管→三角瓶培养 斜面试管→液体试管 三角瓶培养→ 原菌 斜面试管 液体试管 三角瓶培养 卡氏罐 （2）酒母车间 ） 卡氏罐-→小酒母罐 大酒母罐-→送发酵车 卡氏罐 小酒母罐-→大酒母罐 送发酵车 小酒母罐 大酒母罐 间
• 3.糖化曲的制备 3.糖化曲的制备
• （1）菌种 木霉、 根霉、 木霉、曲霉 、根霉、芽孢杆菌ห้องสมุดไป่ตู้• （2）方法 ： 固体曲、液体曲 固体曲、
• 4.糖化 4.糖化
（1）纤维素的水解 ） （2）淀粉的水解 ）
• α-淀粉酶（液化型淀粉酶） 淀粉酶（ 淀粉酶 液化型淀粉酶） 特点： 从淀粉分子内部作用α 特点： 从淀粉分子内部作用α-1，4糖苷键不 作用α 糖苷键及其周围的α 作用α-1，6糖苷键及其周围的α-1，4糖苷 键 结果：产生麦芽糖、寡糖， 结果：产生麦芽糖、寡糖，使淀粉溶液的粘 度下降
二、酒精生产原料
1. 淀粉质原料
(1)薯类原料：甘薯、木薯和马铃薯等 薯类原料：甘薯、 薯类原料 (2)谷物原料：玉米、高梁、大米和小麦等 谷物原料：玉米、高梁、 谷物原料
2.糖类原料 废糖蜜、甘蔗、甜菜等 糖类原料: 废糖蜜、甘蔗、 糖类原料 3.纤维质原料 农作物秸秆、甘蔗渣、废纤维垃圾 纤维质原料: 纤维质原料 农作物秸秆、甘蔗渣、 4.其他原料 : 亚硫酸纸浆废液、淀粉渣等 其他原料 亚硫酸纸浆废液、
酒精发酵,酒度下降的原因
酒精发酵,酒度下降的原因
酒精发酵是一种生物化学过程，通过酵母将糖类物质转化为酒精和二氧化碳。
发酵过程中，酵母在适宜的pH值、温度和氧气条件下生长，吸收糖类物质进行代谢作用，同时产生酒精和二氧化碳。
这时会出现酒精度数下降的现象，主要有以下原因：
1. 酿酒酵母已经代谢完毕大部分的糖类物质，此时糖分浓度下降，自然导致酒精度数的下降。
2. 发酵过程中，二氧化碳气体产生，会影响酒液中乙醛的浓度，从而影响酒精浓度。
3. 发酵温度过高，酿酒酵母失去活性，酒精度数下降。
4. 提前停止发酵或过滤处理过于彻底，也可能导致酒精度数下降。
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酒精发酵
一、实验目的
1．了解淀粉水解酶、糖化酶和活性干酵母活化的方法；
2．掌握双酶法糖化淀粉的方法；
3．掌握酵母发酵糖化液制取酒精的方法；
4．了解糖浓度和酒精含量的测定方法。
5．通过实验让学生理解糖的无氧酵解途；
二、实验原理
1．在无氧的培养条件下，酵母菌(或细菌)利用葡萄糖发酵生成酒精和二氧化碳，此过程即为酒精发酵，反应式为：
C6H12O6 2C2H5OH ＋2CO2
通过对发酵醪液酒精含量的测定，可以判断酒精发酵的程度。
酵母菌在有氧和无氧条件下的糖代谢的产物不同（好氧条件下生成水和二氧化碳），无氧条件下产生酒精和CO2，所以在酒精发酵时要杜绝氧气，否则酒精产率下降。
三、实验材料及仪器
1．实验材料：大米粉、玉米粉或甘薯粉等淀粉质原料，自来水，耐高温活性干酵母，耐高温α-淀粉酶，糖化酶，蔗糖，氯化钙，硫酸铜，亚甲基蓝，酒石酸钾钠，沸石。
2．实验仪器：铝锅，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精蒸馏装置，恒温水浴锅，蒸馏烧瓶，酒精计，糖度计，滴定管，温度计，pH计，三角瓶，容量瓶，石棉网等。
四、实验过程
1、实验步骤
（1）取自来水2000mL，按照1：4的料水比称取大米粉（500g），一起加入铝锅中，调节pH值5.5-6.0（用HCl），保持沸腾状态1h。
注意不要煮糊，可适当补水，但补水不宜过多，以免局部骤然降温，产生老化现象。
此过程中，请2个同学做淀粉酶的活化，2个同学做干酵母活化所需蔗糖溶液及吸管（10根）的灭菌，以及活化糖化酶所需的无菌水。
（2）加入CaCl2 0.01mol/L（酶的保护剂）冷却到85℃，按10U/g大米粉的比例加入活化好的淀粉酶酶液，80℃-85℃水浴保温，使其DE值在15-20之间。
（3）将醪液定容到2000ml，若是大于2000，则加热使其浓缩。
用盐酸调节上述醪液至pH4.0-4.5，分装到8个250ml三角瓶中，装液量为150ml。
121℃灭菌20分钟，冷却到手温，按150U/g大米粉的比例加入活化好的糖化酶酶液，及活化好的酵母液10ml。
（4）用滤布过滤糖化好的醪液，弃去滤渣，滤液调节pH4.8-5.0，定容（加水或煮沸）到2000mL，冷却到20℃用糖度计测糖，取滤液测还原糖（方法见下文）。
测糖后，将滤液分装到250mL三角瓶中，每瓶装液量为150mL，每组10瓶，121℃灭菌20min。
包上两层牛皮纸。
34℃恒温培养箱中培养，培养过程中，记录观察现象，同时取样测定酒精浓度和pH（pH精密试纸），取样间隔8-14h为宜，共取样6次，第一次在接种前，只测定还原糖（酒精度为0，pH已经调好）。
其余每次取样需要测定pH、酒精浓度、还原糖，以便计算酒精得率等。
2、酶和酵母的活化：
（1）淀粉酶：用250mL三角瓶装自来水100mL，用0.1mol/L的盐酸调节pH到5.5-6.0（可用试纸测，此为淀粉酶作用的最适pH），共做3瓶，每瓶加入5g淀粉酶（称量时一定要碾碎），用玻璃棒搅拌，使其完全溶解，35-40℃恒温箱保温30min，即为活化好的淀粉酶。
（2）糖化酶：用250mL三角瓶装自来水100mL，用1mol/L的盐酸调节pH到4.0-4.5（可用试纸测，此为糖化酶作用的最适pH），共做3瓶，加入5g糖化酶，用玻璃棒搅拌，使其完全溶解，35-40℃恒温箱保温30min，即为活化好的糖化酶。
（3）酵母的活化：
配置2％的蔗糖溶液700mL，用盐酸溶液调节pH4.5-5.0（酵母生长最适pH 为4.8-5.0），分装到8个250mL的三角瓶，每个三角瓶中装蔗糖溶液80mL，121℃灭菌20min。
灭菌后取出，冷却到40℃，以每瓶6g的量称取活性干酵母，加入酵母后38℃保温30min，即为活化好的酵母种子。
整个过程尽量做到无菌。
除酶外的器材尽量灭菌或在无菌操作台中操作。
同时，要灭菌10mL移液管6支（或10mL量筒6个），接种时用。
五、实验分析项目和方法
1．酒精度的测定（参见实验附1）。
2．还原糖浓度的测定（参见实验附2）。
3．总糖浓度的测定：利用糖度计进行测定。
将待测液转入量筒中，放入洁净、擦干的糖度计，再轻轻按一下（注意不要接触量筒壁），同时插入温度计，平衡约5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。
根据测得的糖度计示值和温度，查表，换算为20℃时样品的糖度。
所得结果应表示至一位小数。
4．pH值的测定：利用pH计或者精密试纸测定。
六、实验要求
1、实验开始前，复习有关淀粉糖化和酒精发酵的相关理论知识，务必理解液化
和糖化的原理，酒精发酵的原理和发酵过程的特点，了解酒精度测定和还原糖浓度测定的原理以及步骤。
2、观察实验现象，尤其是淀粉糖化和酒精发酵过程的现象，记录并分析原因。
3、详细记录实验的步骤和相关原始数据，并及时对原始数据进行整理和分析。
4、测定发酵开始和终止时的糖浓度，结合酒精发酵的理论得率，计算本实验的
得率，分析影响得率的因素。
5、发酵过程中，间隔适当时间取样测定酒精浓度，记录酒精浓度变化情况，绘
制酒精浓度变化曲线，并对曲线做分析。
附1：酒精度的测定
1 原理
试样以蒸馏法除去不挥发物质，用酒精计测定蒸馏液之比重。
根据蒸馏液的比重查比重-酒精度对照表或直接从酒精计读数求得酒精含量（%，v/v）。
2 仪器
2.1蒸馏仪器蒸馏烧瓶容积，500mL；冷凝器，套管长度不短于400mm；内管直径9 mm。
2.2酒精计量程为0-20或0-40（%，v/v）。
2.3恒温水浴准确度0.1摄氏度。
3 操作
取一清洁的100mL容量瓶，用被测试样荡洗2-3次。
然后注满至近刻度，将容量瓶置于20℃水浴中20-30min，用20℃试样补足至刻度。
将试样移入500mL （或250mL）蒸馏瓶，用50mL冷水分3次冲洗容量瓶，洗液一并移入蒸馏烧瓶。
将烧瓶接入蒸馏装置。
用装试样的原容量瓶作为接受器进行蒸馏。
为防止酒精挥发，在气温较高时蒸馏，应将容量瓶浸入（冰）水浴中，并使应接管出口伸入容量瓶的球部。
当蒸馏液体积达到容量的90%左右时停止蒸馏。
用少许水洗涤应接管的头端，洗液并入容量瓶。
塞好容量瓶，摇匀。
如在刻度以上瓶颈沾有液滴，小心用少许水洗下。
置容量瓶于20℃水浴中30min，并用清洁的洗瓶或毛细滴管加同样温度的水至刻度，再次摇匀。
蒸馏液用酒精计直接测定。
由附录查得20℃时试样以体积百分比（v/v）表示的酒精含量。
4 说明
蒸馏烧瓶中一定要加入沸石，蒸馏过程要全程观察，不允许出现烧瓶内溶液烧干的严重错误。
蒸馏过程中乙醇蒸汽的逃逸，会严重影响测定结果的准确性。
因此蒸馏前必须仔细检查仪器各连接处是否严密。
若蒸馏中出现漏气，必须重新测定。
蒸馏时，应先小火加热，待溶液沸腾后再慢慢用大火焰。
对于易产生泡沫的酒样加少量消泡剂。
但是加过消泡剂的试样蒸馏残液，不能用来作浸出物的测定。
葡萄酒和啤酒试样的挥发酸过高时，会使测定结果引入较大误差。
应根据总酸测定结果，用氢氧化钠溶液中和后，再进行蒸馏。
附2：3,5－二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖
【原理】
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基和酮基的糖类。
单糖都是还原糖。
利用单糖、双糖与多糖的溶解度的不同可把他们分开。
用酸水解法使没有还原性的双糖，彻底水解成具有还原性的单糖，再进行测定，就可以求出样品中的还原糖的含量。
在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇（1,2－烯二醇）。
烯二醇易被各种氧化剂如铁氰化物、3,5－二硝基水杨酸和Cu2＋氧化为糖酸。
氰化物和二硝基水杨酸盐的还原作用是还原糖定量测定的基础。
还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。
因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。
【DNS试剂的制备】
将6.3克DNS和262ml 2mol/L氢氧化钠，加到500ml含有182克酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml，即制成3,5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中备用。
（需在冰箱中放置一周后方可使用）。
【操作】
1. 葡萄糖标准曲线的绘制
分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25 ml 试管中，分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到25ml刻度。
在540nm波长下测定吸光度。
绘制光密度－葡萄糖浓度曲线。
2、样品中还原糖的测定
吸取一定量得样液，3500r/min离心8分钟后，取滤液进行适当稀释（使其吸光值在0.2-0.7之间），测定还原糖浓度（参考标曲制作流程）。
还原糖百分含量=从标曲中查得的还原糖浓度*N
式中N ——稀释倍数
附表1：原始记录模板。