【精品】植物生理学实验讲义2
葛云侠 《植物生理学》实验 讲义
植物的光合速率测定-----改良半叶法[目的]学习改良半叶法测定光合速率 [原理]植物叶片的主脉两侧对称部分叶面积基本相等，其形态和生理功能也基本一致。
用物理或化学方法处理叶柄或茎的韧皮部，保留木质部，以阻断叶片光合产物的外运，同时保证正常水分供应。
然后，将对称叶片的一侧取下置于暗中，另一侧留在植株上保持光照，继续光合作用。
一定时间后，测定光下和暗中叶片的干重差，即为光合作用的积累的干物质量。
通过公式计算出光合速率。
乘以系数后还可计算出C02的同化量。
光合速率(mgDW ·m -2 s -1)=[材料、仪器、药品]1．材料：任选户外一种植物。
2．仪器及用品：(1) 剪刀；(2) 4块湿纱布；（3）带盖磁盘；(4) 30个小纸牌，去户外之前用铅笔编号（1~15；1~15）；(5) 镊子；(6) 打孔器；（7）铅笔；（8）记号笔；(9) 12个称量瓶；(10) 烘箱；(11) 分析天平；（12）干燥器；（13）毛笔。
3．药品：5％三氯乙酸。
[方法]1．取样：在户外选择较绿的植物叶片10片，要注意叶龄、叶色、着生节位、叶脉两侧和受光条件的一致性。
绿叶用纸牌编号（例如绿叶为1、2、3、4、5-10）。
增加叶片的数目可提高测定的精确度。
2．处理叶柄：为阻止叶片光合作用产物的外运，可选用以下方法破坏韧皮部。
抑制法：用毛笔蘸取5％三氯乙酸涂抹叶柄一周。
注意勿使抑制液流到植株上。
3．剪取样品：叶柄处理完毕后即可剪取样品，并开始记录时间，进行光合作用的测定。
首先按编号次序（绿叶）剪下叶片对称的一半(主脉留下)，并按顺序夹在湿润的纱布中，放入磁盘中，带回室内存于暗处。
1-1.5h 后，再按原来的顺序依次剪下叶片的另一半。
按顺序夹在湿润的纱布中。
注意两次剪叶速度应尽量保持一致，使各叶片经历相同的光照时间。
4．称干重：取4个称量瓶分别标上绿叶光照1、2，绿叶黑暗1、2，将各同号叶片照光与暗中的两半叶叠在一起，用打孔器打取叶圆片，分别放入相应编号的称量瓶中（即光下和暗中的叶圆片分开）。
植物生理学实验讲稿
实验一
植物蒸腾强度的测定
一、植物蒸腾强度的测定 （钴纸法，p.14） 蒸腾作用是植物根系吸水的主要动力，蒸腾强度的大小 在一定程度上反映了植物生命活动（代谢）的强弱。测定 方法较多，其中钴纸法较为简单、适用。也可用光合蒸腾 仪测定，精确度更高。 1. 原 理： 单位面积的氯化钴纸吸收水量一定。 2. 氯化钴纸的制备 5 %CoCl2浸泡滤纸，60～80℃烘干，干燥皿中保存。 3. 钴纸标化：标准吸水量（X）=0.023 g/dm2 4. 材 料：红苕、天竺葵等（叶片） 5. 测 定： 用二玻片夹住叶片，橡皮筋固定。测定上、下表皮上的 钴纸由蓝色变为粉红色的时间（秒），重复3次。吸水变红 的钴纸，用电吹风吹干后再用。
4、测定准备。把连接参考气源的长塑料管子连接到面板上的“IN”接 气嘴上，并把手柄上的两根标有“IN2”、“OUT2”的管子分别与面 板上的“IN2”、“OUT2”接气嘴相连；同时，把手柄上传感器电缆 的插头插到面板上的“手柄连接”插座上，并拧紧。 5、测定。按下“参/初”键，待显示器（8）的 CO2 浓度值相对稳定 后，按下“测/终”键（CO2 初始值确定，待测CO2 最终值）；把 待测叶片夹到叶室上（叶片面积必须大于叶室面积，且使叶室密 封），当显示器（9）显示的 CO2浓度值相对稳定后，按下“完成” 键（CO2 最终值确定）。记下各显示器的数值。 6、更换叶片，重复上述第 “5” 步测定，共 3 次。 7、测定完毕，按回“开/闭路”测量键、“气泵”键、“电源”键， 结束开路测量。 8、将所得各显示器的数值，按要求输入本仪器自带软件，得到样品 的（净）光合速率（和蒸腾速率），计算3次平均值。
分子量no6作业计算材料由kno1fw193处理01moll磷酸缓冲液ph755ml蒸馏水5ml01moll磷酸缓冲液ph755ml02mollknoml4实验步骤材料0304处理液三角瓶抽气5min30酶促反应30min反应液1ml显色30min测定od5205标准曲线的制作nano取各标准液1ml于试管中加磺胺试剂2ml摇匀加萘胺试剂2ml摇匀30显色30min测定od5206作业计算材料由kno1fw20实验五叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定一层析用叶绿体色素的提取及色素分离1原理叶绿体色素各组分的脂溶性和分子量不同可用有机溶剂层析分离
8植物生理学课件讲义_第六章(2)
Structure of the Pr and Pfr forms of the chromophore (phytochromobilin) and the peptide region bound to the chromophore through a thioether linkage. The chromophore undergoes a cistrans isomerization at carbon 15 in response to red and far-red light. (After Andel et al. 1997.)
Brief History of Phytochrome Research
1980 -Dimer model proposed to explain wide fluence range and very low fluence response. 1983 - Vierstra and Quail reported successful purification of fully intact, native phytochrome from etiolated oat seedlings .
De-etiolated characteristics
Apical hook opens or coleoptile splits open Leaf growth promoted Chlorophyll produced Stem elongation suppressed Radial expansion of stem Root elongation promoted Lateral root development accelerated
植物生理学实验详解
一植物组织中ETH（乙烯）释放量的测定测定原理：ACC是乙烯合成的直接前体，为了更好地了解乙烯对植物的调节作用，有必要测定植物中ACC的含量，在冷却的Hg+存在下，NaClO专一地使ACC转化成乙烯。
ACC：1-氨基环丙烷-1-羧酸测定中气相色谱仪用的是氢火焰检测器FID。
色谱仪包括固定相和流动相。
由于固定相和流动相对各种物质的吸附或溶解能力不同，因此各物质的分配系数不一样。
当待测样（含ETH混合气体）加入固定相以后，不断通以流动相（通常为氮气、氢气）待测物不断再分配，最后按照分配系数大小顺序依次被分离，并进入检测系统被检测，检测信号的大小，反映出物质含量的多少，在记录仪上呈现色谱图。
判断气相色谱仪氢火焰检测器是否点燃的3种方法？如何判断检测器已工作？1、将不锈钢镊子接触到检测器的喷扣处，若镊子上有水珠证明氢气已被点燃；2、根据记录笔的位置来判断；3、微电流放大器的“引燃开关”切换“引燃”时，检测器如发出扑声火焰已被点燃。
结果分析：经冷冻的苹果ETH释放速率低于常温的乙烯释放速率。
经低温处理ACC合成酶的形成受到损伤和影响，从而降低乙烯的合成与释放。
3大温度3大气流量：基线成一直线表明稳定了柱温80度进样器温度120度检测器温度140度N2 流量35微升每分钟400 H2 流量45 微升每分钟55千帕空气流量350 微升每分钟40 千帕二植物组织中脂肪氧化酶活力测定原理根据基质浓度一定，反应体系中溶解氧浓度的变化与酶活力大小呈线性相关原理进行测定。
LOX氧化多元不饱和脂肪酸生成具有共轭双键的过氧化物时消耗氧气，溶液中氧浓度的减少速率与酶活力大小成正比，用氧电极可精确的测定酶活力。
结果：经过干旱处理的小麦组织中LOX活力低（受干旱条件的诱导LOX基因的表达）注意事项：1测定时，维持温度恒定，氧电极对温度变化非常敏感;2 反应杯中不应有气泡，否则会造成信号不稳3 进行试验时要保持磁转子的转动，以平衡氧气浓度4 电极使用一段时间后，在阳极上形成一层氧化膜，使电极的灵敏度下降，需要用清洁剂清洁阳极。
植物生理学实验讲义最新
实验一植物组织渗透势的测定（质壁分离法）一、实验目的植物细胞的渗透势主要取决于溶液的溶质浓度，因此又称溶质势。
渗透势与植物水分代谢、生长及抗性密切相关。
在干旱、盐渍等条件下，一些植物常在细胞内主动积累溶质，以降低其渗透势，增加吸水能力，在一定程度上保持膨压，保持细胞的生长和气孔的开放，这种现象称为渗透调节作用。
渗透调节能力的大小可以用逆境条件下细胞的渗透势的降低值来表示，在水分生理与抗性生理研究中经常需要测定。
掌握质壁分离法测定植物细胞渗透势的原理和方法。
二、实验原理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势，该溶液的浓度称为等渗浓度。
当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的溶液浓度。
带入公式即可计算出其渗透势。
三、实验材料、仪器设备和试剂1. 实验材料洋葱鳞茎（最好是紫色洋葱）2. 仪器设备光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、干净的小培养皿、滴瓶、吸水纸。
3. 试剂（1）1 mol/L蔗糖溶液，（2）蔗糖系列标准液以1 mol/L蔗糖溶液作为母液，配置梯度溶液: 0.20、0.30、0.35、0.40、0.45、0.5、0.55、0.60、0.65、0.70 mol/L的蔗糖溶液。
四、实验步骤1. 取10套干燥洁净的小培养皿，编号，将配制好的不同浓度的蔗糖溶液按顺序倒入各个培养皿中使成一薄层，盖好皿盖。
2. 用刀片在洋葱鳞片外表皮或其它带有色素的组织表皮上纵横划成0.5cm2左右的小块，用镊子将表皮小块轻轻撕下，依次迅速投入各浓度蔗糖溶液中，每个培养皿中放材料3个左右，使其完全浸没，并立即盖好皿盖。
浸泡10～15分钟。
3. 从0.70 mol/L 蔗糖溶液开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上载玻片，于显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的表皮做制片，进行同样观察，并记录质壁分离的相对程度。
(精)植物生理学实验讲义
植物生理学实验讲义目录目录 (I)实验一植物材料的无土培养及缺素症状观察（3学时） (1)实验二植物组织水势的测定（小液流法）（3学时） (2)实验三缺磷、缺铁对植物叶片中叶绿素含量影响（叶绿体色素的提取、分离及定量测定）及光合速率的测定（3学时） (3)实验四：缺素培养对叶片质膜透性及过氧化物酶活性的影响（电导率的测定&愈创木酚法测定POD酶活性）（3学时） (5)Part Ⅰ缺素培养对叶片过氧化物酶活性的影响 (5)Part Ⅱ缺素培养对叶片质膜透性的影响 (6)实验五：设计性实验：逆境胁迫下植物的适应机制研究（6学时） (7)PartⅠ蒽酮法测定可溶性糖 (7)Part Ⅱ植物体内可溶性蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法） (9)Part Ⅲ植物组织中丙二醛含量的测定 (11)实验一植物材料的无土培养及缺素症状观察（3学时）【实验原理】只要满足植物正常生长发育的要求(光、温、水、气、必需元素)，植物可以在水中或砂中生长。
把必需矿质元素配制成培养液培养植物称溶液培养，而把培养液加于洁净的石英砂中培养植物则称砂基培养。
由于培养液中元素的种类和数量可以人为控制，因此当要了解某种元素是否为植物必需时，只要有意识地配制缺乏该种元素的培养液，根据植物在该培养液中所表现出来的症状，便可了解该元素的作用以及对植物生长发育的必要性。
【器材与试剂】器材:，贮液塑料桶（10个)，量筒，移液管，石英砂或蛭石适量，水培设备4个移液器，酸度计，电子天平，数码相机。
试剂：硝酸钙，硝酸钾，硫酸镁，磷酸二氢钾，硝酸钠，氯化镁，硫酸钠，磷酸二氢钠，氯化钙，氯化钾，EDTA-Na2，FeSO4，CuSO4，HBO3，KI，MnCl2，ZnCl2，Na2MoO4。
HCl，NaOH，Na2ClO4或CaClO4以上试剂均需分析纯。
【方法与步骤】1.准备工作1）幼苗准备:实验用种子用漂白粉溶液灭菌半小时，用灭菌水洗几次，然后放在干净的湿石英砂中发芽，加以蒸馏水培养长至一定高度(5cm左右)。
植物生理学全课程讲义
植物生理学绪论一植物生理学的定义和内容研究植物生命活动规律和机理及其与环境相互关系的科学。
植物生命活动：从种子开始到形成种子的过程中所进行的一切生理活动。
植物生命活动形式：代谢过程、生长发育过程、植物对环境的反应植物生命活动的实质：物质转化、能量转化、信息转化、形态建成、类型变异1 物质转化体外无机物[H2O、CO2、矿质（根叶）]→体内有机物[蛋白质核酸脂肪、碳水化合物] →体外无机物[CO2 H2O]→植物再利用2 能量转化光能（光子）→电能（高能电子）→不稳定化学能（ATP，NADPH）→稳定化学能（有机物）→热能、渗透能、机械能、电能3 信息转化[1]物理信息：环境因子光、温、水、气[2]化学信息：内源激素、某些特异蛋白（钙调蛋白、光敏色素、膜结合酶）[3]遗传信息：核酸4 形态建成种子→营养体（根茎叶）→开花→结果→种子5 类型变异植物对复杂生态条件和特殊环境变化的综合反应植物生命活动的“三性”v植物的整体性v植物和环境的统一性v植物的变化发展性Ø植物生命活动的特殊性1 有无限生长的特性2 生活的自养性3 植物细胞的全能性和植株的再生能力强4 具有较强的抗性和适应性5 植物对无机物的固定能力强6植物具有发达的维管束植物生理学的内容1、植物细胞结构及功能生理﹕2、代谢生理：水分代谢、矿质营养、光合作用、呼吸作用等3、生长发育生理：种子萌发、营养生长生理、生殖生理、成熟衰老4、环境生理（抗性生理）以上的基本关系光合、呼吸作用→生长、分化水分、矿物质运输发育、成熟(功能代谢生理) (发育生理)↖↗环境因子（抗性生理）(温、光、水、气)二植物生理学的产生与发展（一）萌芽阶段（16以前世纪）*甲骨文：作物、水分与太阳的关系*战国时期：多粪肥田*西汉：施肥方式*西周：土壤分三等九级 *齐民要术：植物对矿物质及水分的要求轮作法、“七九闷麦法”（1）科学植物生理学阶段1.科学植物生理学的开端（17~18世纪）1627年，荷兰 Van Helmont ，水与植物的关系1699年，英国Wood Ward，营养来自土壤和水18世纪，Hales,植物从大气获得营养1771年，英国Priestley发现植物绿色部分可放氧2年，瑞士 De Saussure，灰分与生长的关系2.植物生理学的奠基与成长阶段（19世纪）Ø1840年，德国Liebig建立矿质营养说。
植物生理学实验教程
植物生理学实验教程
植物生理学实验是一种探索植物生命运行机制的重要手段。
它可以帮助我们深入了解植物的生长发育、光合作用、水分代谢及其他重要特性，从而更好地应用这些特性来种植植物。
植物生理学实验非常重要，这里介绍了一些关于植物生理学实验的基本知识。
首先，要进行植物生理学实验，必须准备好实
验工具，包括植物样本、温度测量仪、光照计、水分计、种子计数计、种子灌浆机、植物摘取器等等。
其次，要了解实验要求。
植物生理学实验的实验要求不同，比如测量光照、温度、水分和其他条件下植物的生长发育、光合作用、水分代谢等。
三，要准备实验材料。
植物生理学实验的实验材料包括植物样本、温度测量仪、光照计、水分计、种子计数计、种子灌浆机、植物摘取器等。
准备完这些实验材料后，就可以开始实验了。
最后，要开展实验，就是要根据实验要求，采取适当的测量方法，以获得准确有效的实验结果。
比如，在测量植物生长发育时，可以用植物摘取器采取植物样本，用水分计测量植物的水分，用光照计测量植物的光照，用种子计数计测量植物的种子数量，用温度测量仪测量植物的温度，用种子灌浆机测量植物的种子发芽率等。
以上就是植物生理学实验的基本流程，它可以帮助我们更好地了解植物的特性，从而更好地保护植物和种植植物。
从而，植物生理学实验在科学研究中具有重要的意义。
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实验一植物组织渗透势的测定(质壁分离法）实验目的：观察植物组织在不同浓度溶液中细胞质壁分离的产生过程及其用于测定植物组织渗透势的方法。
原理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时,细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势.该溶液的浓度称为等渗浓度。
当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的溶液浓度.代入公式即可计算出渗透势。
器材与试剂：1．显微镜、载玻片及盖玻片、镊子、刀片2．100mL浓度为1mol/L蔗糖溶液:用蒸馏水配成0.1、0。
15、0.20、0.25、0。
30、0.35、0。
40、0。
45、0.50mol/L的蔗糖溶液各50mL。
称34。
23g蔗糖用蒸馏水配成100ml,其浓度为1mol/L（母液）。
再配制成下列各种浓度：0.50mol/L：吸母液25ml+水25ml0.45mol/L：吸母液22。
5ml+水27。
5ml0。
40mol/L:吸母液20。
0ml+水30.0ml0.35mol/L：吸母液17。
5ml+水32.5ml0.30mol/L:吸母液15.0ml+水35.0ml0。
25mol/L：吸母液12.5ml+水37。
5ml0。
20mol/L：吸母液10.0ml+水40.0ml0。
15mol/L：吸母液7。
5ml+水42.5ml0。
10mol/L：吸母液5。
0ml+水45。
0ml3．实验材料洋葱鳞茎实验步骤：将带有色素的植物组织（叶片），一般选用有色素的洋葱鳞片的外表皮、紫鸭跖草、苔藓、红甘蓝或黑藻、丝状藻等水生植物，也可用蚕豆、玉米、小麦等作物叶的表皮。
撕取下表皮，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，5—10分钟。
1． 从0.5mol/L 开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片,于低倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。
2． 实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓度,和不引起质壁分离的最高浓度.3． 在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。
在此条件下,细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。
将结果记录下表中。
测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平均值之后，可按下列公式计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。
RTiC s =-ϕs ϕ-为细胞渗透势.R 为气体常数=0。
083×105/L ·P а/mol ·K.T 为绝对温度，单位K,即273℃+t ，t 为实验湿度。
I 为解离系数,蔗糖为1.C 为等渗溶液的浓度，单位为mol/L 。
则：s ϕ-=0。
083×105×（273℃+t )×1×C作业与思考题：1． 绘制细胞质壁分离前后的细胞图。
计算植物细胞的渗透势.实验二植物组织水势的测定（小液流法）实验目的:了解植物组织中水分状况的另一种表示方法及用于测定的方法和它们的优缺点。
实验原理:植物组织的水分状况可用水势来表示。
植物体细胞之间、组织之间以及植物体与环境之间的水分移动方向都由水势差决定。
将植物组织放在已知水势的一系列溶液中，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势）,则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。
组织的吸水或失水会使溶液的浓度、密度、电导率以及组织本身的体积与质量发生变化.根据这些参数的变化情况可确定与植物组织等水势的溶液.可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度的变化，然后根据公式计算渗透势。
仪器药品:试管、毛细滴管、移液管、剪刀、镊子、甲烯蓝、菠菜叶片操作步骤：1．首先配制一系列不同浓度的蔗糖溶液(0。
1、0。
2、0。
3、0.4、0.5、0。
6、0.7、0.8mol/L ）各10ml 注入8支试管中，各管都加上塞子，并编号.按编号顺序在试管架上排成一列，作为对照组。
2．另取8支试管，编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。
然后由对照组的各试管中分别取溶液4ml 移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞子。
3．用剪刀将菠菜叶剪成约0。
5cm 2大小相等的小块60—80片。
向试验组的每一试管中各加相等数目（约10片)的叶片小块，塞好塞子,放置30分钟，在这段时间内摇动数次,到时间后，用大头针沾取少许甲烯蓝粉末加入每一试管中,并振荡，此时溶液呈蓝色。
4．用毛细滴管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许，然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部,缓慢从毛细滴管尖端横向放出一滴蓝色试验溶液，并观察小液滴移动的方向。
如果有色液滴向上移动，说明溶液从细胞液中吸出水分而被冲淡,比重比原来小了；如果有色液向下移动,则说明细胞从溶液中吸了水，溶液变浓，比重变大；如果液滴不动，则说明试验溶液的密度等于对照溶液，即植物组织的水势等于溶液的渗透势。
记录液滴不动的试管中蔗糖溶液的浓度.重复测定一次。
按RTiC w =-ϕ计算水势。
式中w ϕ-为细胞水势。
作业与思考题:1． 计算植物细胞的水势。
为什么蓝色试验液滴不动说明试验溶液的密度等于对照溶液？实验三叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定（纸层析法）实验目的：了解叶绿素提取分离的原理以及它们的光学特性在光合作用中的意义。
实验原理：叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质,主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,可用丙酮提取。
并可根据它们在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，将它们彼此分离开.分离色素的方法有多种，纸层析是其中最简便的一种。
当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合物中各成分在两相（即流动相和固定相）间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的混合物得到分离。
器材与试剂：大试管、台天平、研钵、量筒、烧怀、漏斗、软木层、新华滤纸;丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、碳酸钙、石英砂操作步骤1．称取新鲜叶子2g,放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮5ml,然后以漏斗过滤之，即为色素提取液.2．取准备好的滤纸条(宽2cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm,宽约0。
5cm 的窄条，如图。
3．用毛细管取叶绿素溶液点于窄条的上方,注意一次所点溶液不可过多。
如色素过淡，用电吹风吹干后再点1一2次.4．在大试管中加入四氯化碳3—5ml及少许无水硫酸钠.然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内,使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。
5．经过0.5一1小时后，观察分离后色素带的分布。
最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a,最后的黄绿色为叶绿素b。
6、铜代反应取上述色素丙酮提取液少许于试管中,1滴1滴加浓盐酸，直至溶液出现褐绿色,此时叶绿素分子已遭破坏,形成去镁叶绿素。
然后加醋酸铜晶体少许,慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。
此即形成了铜代叶绿素。
作业与思考题：1．绘制叶绿体色素的柱层析图谱提取叶绿素时为什么要加入少量CaCO3,加多了会出现什么问题?实验四叶绿素a和b含量的测定（分光光度法）实验目的：熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。
实验原理：如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异,但吸收曲线彼此又有些重叠；在这种情况下要分别测定两个组分,可根据Lambert—Beer定律，通过代数方法,计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量.如图叶绿素a和b的吸收光谱曲线,叶绿素a的最大吸收峰在663nrn,叶绿素b在645nrn，吸收曲线彼此又在重叠。
根据Lambert—Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系: A1=Ca·k a1+C b·k b1A2=Ca·k a2+C b·k b2式中：Ca为组分a的浓度，g／L.Cb为组分b的波度，g／L。
A l为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。
A2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时,混合液的吸光度A值。
k al为组分a的比吸收系数,即组分a当浓度为1g/L时,于波长λ1时的吸光度A值.k b2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g／L时，于波长λ2时的吸光度A值.k a2为组分a（浓度为1g/L）在波长λ2时的吸光度A值。
K b1为组分b（浓度为1g/L）在波长λ1时的吸光度A值.从文献中可以查得叶绿素a和b的80％丙酮溶液，当浓度为1g/L时,比吸收系数k值如下：ε：波长（nm）叶绿素a 叶绿素b663 82.04 9.27将表中数值代入上式（1）、(2），则得：A663=82。
04×Ca+9.27×C bA645=16.75×Ca+45。
60×C b经过整理之后，即得到下式：C a=0.0127A663－2.69A645(3）C b=22.9A645－4.68A663（4)C T=C a+C b=8。
02A663+20.21A645(5)（5）式中C T为总叶绿素浓度,单位为mg/L。
利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度。
注：一般大学教学实验室所用的人光光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽值要比中级类型的751型大得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663—645nm)，难以达到精确测定.此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差了.根据公式计算往往会得到叶绿素a∶b值小于1，这就不很奇怪了。
除向学生说明其中原因外，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致.校正可用纯的叶绿素a和b进行，分别在波长650-670nm和630—650nm之间，每隔1—2nm 测定叶绿素a或b的吸光度A，以确定叶绿素a和b的吸收峰的波长。
如果测得的峰值与文献上的峰值663nm和645nm不同，可按照仪器说明书步骤进行校正，或者更方便的方法可以打开仪器盖子,松动波长刻度盘紧固螺丝,调节刻度盘使波长至正确值，而后旋紧螺丝复原仪器.为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的用量是很少的，用纸层析法很快就能分离制得.取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可.然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含0.5%丙醇的石油醚.层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿素的叶绿素b，注意剪时尽量避开有可能遭污染的地区.最后分别浸于80％丙酮中,洗下叶绿素a和b。