第10章 发酵过程的优化和放大
丙酮酸发酵过程优化
营养条件对光滑球拟酵母WSHIP12生产丙酮酸的影响
❖ 酵母粉浓度对丙酮酸发酵的影响 ❖ 蛋白胨浓度对丙酮酸发酵的影响 ❖ 豆饼水解液和无机氮源对丙酮酸发酵的影响 ❖ 分批发酵中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵
丙酮酸发酵过程优化
丙酮酸发酵概述 ❖国外研究水平和发展趋势
➢酵母直接发酵生产丙酮酸 ➢细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸 ➢休止细胞法生产丙酮酸 ➢完整细胞/酶法生产丙酮酸
❖发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题 ❖本章的主要内容
酵母直接发酵生产丙酮酸
❖ 球拟酵母中的营养缺陷型菌株生产丙酮酸 ❖Torulopsis glabrata IFO 0005的代谢途径及遗传
特性 ❖ 嗜盐酵母在高盐环境下生产丙酮酸 ❖ 目前一开始发酵法生产丙酮酸的日本企业
细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸
❖ 能生产丙酮酸的细菌及其遗传特性 ❖ 细菌发酵产丙酮酸的方法
休止细胞法生产丙Байду номын сангаас酸
❖ 利用休止细胞法生产丙酮酸的微生物
完整细胞/酶法生产丙酮酸
❖ 完整细胞法生产丙酮酸的现状
发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题
的影响 ➢ 供氧方式对丙酮酸发酵的影响 ➢ 培养基碳氮比的影响 ❖ 葡萄糖流加培养中氧的供给对丙酮酸发酵的影响 ➢ 氮源的影响 ➢ 培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响
课后思考题
1.丙酮酸生产方法有那些? 2.发酵法生产丙酮酸的放大过程是如何进
行的，常见的放大方法有那些？
发酵工程(潍坊医学院)智慧树知到课后章节答案2023年下潍坊医学院
发酵工程（潍坊医学院）智慧树知到课后章节答案2023年下潍坊医学院潍坊医学院第一章测试1.下列关于发酵工程的说法，错误的是A:发酵工程产品主要是指微生物的代谢产物、酶和菌体本身B:可以通过人工诱变选育新菌株C:环境条件的变化既影响菌种的生长繁殖又影响菌体代谢产物的形成D:培养基、发酵设备和菌种必须经过严格的灭菌答案:培养基、发酵设备和菌种必须经过严格的灭菌2.发酵工程是生物技术实现以下哪项的关键环节A:社会化B:商品化C:产业化D:安全化答案:产业化3.发酵过程的灭菌范围不包括A:发酵设备B:培养基C:操作人员D:发酵工程提供的空气答案:操作人员4.下列不属于发酵工程应用的是A:生产啤酒、果酒和食醋等B:用于化学检测和水质监C:生产抗生素、维生素、药用氨基酸等D:生产各种各样的食品和添加剂答案:用于化学检测和水质监5.如果发酵工程生产的产品是菌体，菌体分离采用的方法是A:萃取B:过滤C:蒸馏D:离子交换答案:过滤6.巴斯德效应是指A:乳酸对微生物的抑制B:氧气对发酵作用的抑制C:酒精对葡萄糖分解的抑制D:氧气对呼吸作用的抑制答案:氧气对发酵作用的抑制7.发酵生产所用的原料主要以农副产品及其加工产品为主，因为这些生物质原料具有可再生的优点。
A:对 B:错答案:对8.发酵过程一般是在高温高压下进行的生物化学反应。
A:错 B:对答案:错9.目前，人们把利用微生物在有氧和无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程称为发酵。
A:对 B:错答案:对10.发酵过程的灭菌范围包括：培养基、发酵设备、发酵工程提供的空气。
A:对 B:错答案:对第二章测试1.细菌、放线菌生长繁殖一般要求的环境是A:中性B:偏酸C:偏碱答案:偏碱2.透明圈法即在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基A:不变B:澄清C:浑浊答案:浑浊3.诱变处理时的所用的出发细胞应处于菌株A:延迟期B:对数生长期C:稳定期D:衰亡期答案:对数生长期4.工业菌种必须具备的条件不包括A:遗传性状稳定B:生长迅速C:经诱变产生变异和遗传D:不能长期保存答案:不能长期保存5.以下属于化学诱变剂剂的是A:快中子B:紫外线C:X-射线D:甲基硫酸乙酯答案:甲基硫酸乙酯6.平板划线分离法不需要下面哪个物品或设备A:电泳仪B:琼脂培养基平板C:超净工作台D:接种环答案:电泳仪7.常作为生产菌种和科研材料的细菌群体，应该是代谢旺盛、个体形态和生理特性比较稳定的。
第八章 发酵过程的放大
“发酵放大是一门艺术，而不是一门科学” —— A.E.Humphrey
就目前为止，生化放大过程一直是一 个难题。
虽然很难用理论分析，但是并不是放大 问题没解决就不能放大，反应器的不足 可以通过工艺及控制手段来弥补，工艺 的欠缺也可以通过改善反应器型式来修 正。
主要内容
2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰 直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时 的菌株损失和菌种的适应性等。
3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面 直接接触。发酵罐是和空气混合接触， 考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。
4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控 制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发 酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决 的。
➢ 第一节 发酵放大的原则及方法 ➢ 第二节 以摇瓶取得数据为依据进行发酵过程和发
酵罐放大 ➢ 第三节 小型罐到大型罐的放大
工业发酵过程的放大
第一阶段 实验室规模，进行菌种的筛选和培养基的研究
第二阶段 中试工厂规模，确定菌种培养的最佳操作条件
第三阶段 工厂大规模生产
第一节 发酵放大的原则及方法
2.供氧方面的阻力
于氧：是k1气难1 膜溶；气体：，气所k12 液以界面即；液膜：处液1的膜k13阻；力是：主发要酵k14阻液力；来由
源；
k3
3.耗氧方面的阻力
传递k：；18 胞k15 外：液为膜耗；氧方：面k菌6、的k1k丝67 阻丛力；主要：来细源k1胞7 ；膜另；外
：胞内 受菌
体生理及培k养8 基成分如pH不适、代谢产物积累等影响。
以kLa为基准的比拟放大法
有的菌种在深层发酵时耗氧速率很快， 因此溶氧速率能否与之平衡就可能成为 生产的限制性因素。耗氧速率可以用实 验法测定。在小型试验发酵罐里进行发 酵过程，用适当的仪器记录发酵液中的 溶氧浓度。
张嗣同 发酵工程第九章：发酵过程优化与放大概论(精品课程)6-4
0.12 0.1
工艺改进前后磷酸果糖激酶的 时序变化
0.05 0.045 0.04 0.035 0.03 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 12h 24h
Δ A/min
0.08 0.06 0.04 0.02 0 12h 24h 36h 40h t / h 44h 48h
►菌体细胞主流代谢流迁移问题是本项目过
程优51篇 出版专著、著作： •多尺度微生物过程优化，化学工业出版社
• Study on Industrial Fermentation Process
on Multi-scale and Its Optimization , Advance Biochemical Engineering/ Biotechnology , 2003 Volume（87） : Biomanufacturing 2004年3月出版
关键技术
跨尺度分析与工艺改进
确定以代谢流由EMP向HMP途径回复迁移为 目标进行过程工艺优化，并以OUR的下降作为 跨尺度操作的相关因子
发现调控因子A加入后短期内OUR的下降速 度就开始放慢，到48小时开始维持稳定直至放 罐，并且发酵后期的糖耗速率也变慢
关键技术
代谢流控制
工艺改进前后的酶活时序变化
Δ A/min
原工艺
新工艺
t / h 原工艺
36h
40h
44h
48h
新工艺
工艺改进前后6-磷酸葡萄糖脱氢酶 的时序变化
0.05 0.045 0.04 0.035 0.03 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 12h 24h 36h
工艺改进前后丙氨酸脱氢酶的 时序变化
发酵工程余龙江版 第章_绪论
.
8
酿造及食品业、抗生素、
氨基酸、核苷酸、有机酸、 饲料添加剂、微生态制剂、 生物农药、生物肥料等
基因工程药物、细胞工
程药物、疫苗；替代石 油工业的大宗量的生物 基化学品等。
.
9
传统大型发酵工 业的中央控制
现代发酵工业 的中央控制
.
10
二 发酵工程在生物技术中的地位
▪ 生物技术：应用自然科学和工程学的原理，依靠生 物及其细胞的催化作用，将物料进行加工以提供产 品或为社会服务的技术。
主要特点：嫌气发酵，非纯种培养 ，产品质 量不稳定
.
15
二、纯培养技术的建立
• Koch首先发明固体培养基，建立细菌的纯粹培 养
• Petri创造一种培养皿(petri dish)用于微生物平 板分离
• Winograsky和 Beijerink发明富集培养法，分离 特定的微生物
• 主要产品：酵母、甘油、乳酸、丙酮丁醇等
带有细胞再循环的单级恒化器连续发酵
4、按菌的种类
单菌种发酵 多菌种混合发酵（混合菌发酵）
.
41
新发展的微生物培养方法
• 载体培养：以天然或人工合成的多孔材料代替麸 皮之类的固态基质作为微生物生长的载体，营养 成分可以严格控制。发酵结束后只须将菌体和培 养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。
• 两步法液体深层培养：在酶制剂生产中，由于微 生物生长与产酶的最适条件往往有很大的差异， 采取两步法培养，将菌体生长条件（营养期）与 产酶条件区分开来，因而更容易控制各个生理时 期的最适条件。
▪发酵工程是生物技术的应用基 础，是生物技术产业的核心。
.
11
优良种株的选育和保 藏（包括菌种筛选、改造， 菌种代谢路径改造等），
演示文稿第八章发酵过程的放大
第1页，共129页。
“发酵放大是一门艺术，而不是一门科学”
—— A.E.Humphrey
第2页，共129页。
就目前为止，生化放大过程一直是一个难 题。
虽然很难用理论分析，但是并不是放大问 题没解决就不能放大，反应器的不足可以 通过工艺及控制手段来弥补，工艺的欠缺 也可以通过改善反应器型式来修正。
为0.33~0.45） （5）恒定的混合时间tM放大
第40页，共129页。
（一）以kLa为基准的比拟放大法
（二）以Po/V相等为准则的比拟放大 （三）其他的比拟放大方法
第41页，共129页。
例： 某厂试验车间用枯草杆菌在100升罐 中进行生产。—淀粉酶试验， 获得良好 成绩。放大至20立方米罐。
单位体积吸收的功率及Kla值成正比关系 虽然摇瓶发酵液有少量的核算类物质漏出，
其漏出率远低于发酵罐。
第25页，共129页。
摇瓶放大培养的结果 溶氧敏感，罐中生产能力可能高于摇瓶；
机械损伤敏感，罐中的生产能力低于摇瓶； 溶氧和机械损伤都敏感，其结果随发酵罐
中的特性而定
第26页，共129页。
如何从摇瓶发酵获得参数用于发酵罐 试验
2. CO2浓度的差异
CO2是微生物的代谢产物
多数微生物适应低CO2浓度 （0.02~0.04%）。当排除的CO2浓度高于 4%时，碳水化合物的代谢及呼吸速度下降，
影响菌体生长、形态及产物合成
第22页，共129页。
摇瓶——常压状态； 发酵——正压状态
在这两种发酵形式中CO2在发酵液中的溶
第42页，共129页。
以KLa为基准的比拟放大
第43页，共129页。
P0——不通气时的搅拌功率
生物化学 第10章糖酵解
肌肉组织提取液亦能完成与酵母提取液十分相似的代谢过程。
并正式提出了糖酵解(glycolysis)这一概念。因此，糖酵解曾 经又称为Embden-Meyerhof途径。
糖酵解反应顺序中所涉及的酶都已被纯化， 并通过X-射线晶体衍射进行了三维结构研究。糖 酵解几乎是所有生物细胞的葡萄糖分解代谢共同 的主要途径，也是一条在有氧和无氧条件下都能 发生的途径。由于生物起源于缺氧的大气层中， 因此葡萄糖的无氧降解可能是生物从有机分子获 取能量的一种最古老的机制。
烯醇化酶在与底物结合之前先与Mg2＋结合成 复合物。该酶在氟离子(F－)和磷酸盐同时存在 下失去活性，因为氟离子与磷酸基形成的氟磷酸 离子能结合Mg2＋。所以氟化物是烯醇化酶的有效 抑制剂。若在酵解途径中加入氟化物，必然造成 磷酸甘油酸以及磷酸甘油积累。
由于反应被抑制，后续过程不能继续进行， 反应(5)生成的NADH没有受氢体，于是转而迫使 磷酸二羟丙酮作为受氢体还原为磷酸甘油。
甘油醛-3-磷酸 ＋ NAD＋ ＋ Pi ←→ 1,3-二磷酸甘油酸 ＋ NADH ＋ H＋ △Go′＝ + 6.3kJ/mol 1,3-二磷酸甘油酸 ＋ ADP ←→ 3-磷酸甘油酸 △Go′＝ ﹣18.5kJ/mol ＋ ATP
这两步的总反应是： 甘油醛-3-磷酸 ＋ NAD＋ ＋ ADP ＋ Pi ←→ 3-磷酸甘油酸 ＋ ATP ＋ NADH + H＋
一
糖酵解的反应顺序
糖酵解从葡萄糖开始，经一系列反应到丙酮酸的生成， 总共包括10个酶促反应步骤。这10步反应可划分成两个反应 阶段。催化糖酵解反应的酶存在于细胞溶质中，这些酶构成 一种可溶性的多酶体系。 （一）葡萄糖（六碳糖）转变成磷酸丙糖（三碳糖）： ①己糖激酶; ②磷酸葡萄糖异构酶; ③磷酸果糖激酶; ④醛缩酶（果糖二磷酸裂解酶）; ⑤磷酸丙糖异构酶催化. 这是一个消耗能量的过程。该过程经历了两次磷酸化反应。 而消耗了2分子ATP.
发酵过程优化原理与技术
发酵过程优化原理与技术嘿，咱今儿就来唠唠发酵过程优化原理与技术这档子事儿。
你说这发酵啊，就好比是一场奇妙的魔法之旅。
咱就想想，那些小小的微生物，在合适的环境里，就开始它们的表演啦！它们一点点地工作着，把原料变成我们想要的好东西，这多神奇呀！要让这场魔法之旅顺顺利利的，那可得掌握好一些关键。
就像咱做饭得掌握火候和调料一样，发酵也有它的门道。
首先呢，那就是得给微生物们提供一个舒舒服服的家，温度啦、湿度啦、营养啦，都得恰到好处。
这就跟咱人一样，谁不想住在舒服的房子里，吃着美味的食物呀，对吧？要是环境不合适，那微生物们可不干啦，它们就不好好工作，那可就糟糕咯！然后呢，时间也是个重要因素。
太短了，发酵不完全，东西没做好；太长了，又可能会出现一些意想不到的问题。
这就好比跑步比赛，跑太快可能会摔倒，跑太慢又拿不到好名次。
还有啊，搅拌也很重要呢！这就像我们炒菜得不停地翻动一样，让微生物和原料充分接触，才能更好地进行反应。
你想想，如果菜都不翻动，那肯定有的地方熟了，有的地方还是生的呀！咱再说说这发酵过程中的监控。
这可太重要啦！就跟咱走路得看着路一样，得随时知道发酵进行到什么程度了，有没有出问题。
要是不监控，那等发现问题的时候可能就晚啦！这就好比你开车不看仪表盘，等油没了才发现，那不就傻眼啦？再来说说原料的选择。
这就好比盖房子得用结实的砖头一样，好的原料才能做出好的产品。
要是用了质量差的原料，那就算技术再好，也很难做出好东西呀！哎呀，说了这么多，其实就是想告诉大家，发酵过程优化可不是一件简单的事儿，但也不是难到没法做。
只要咱用心去了解微生物们的需求，给它们提供最好的条件，时刻关注着发酵的过程，那咱就能让这场魔法之旅变得精彩无比！咱平时吃的好多好吃的、用的好多好东西，可都是通过发酵得来的呢。
所以说呀，这发酵过程优化原理与技术，真的是非常非常重要的呢！咱可得好好重视起来，让这些小小的微生物为我们创造更多的美好呀！你说是不是呢？。
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第10章生物过程的优化和放大
生物过程的研究一般经历
摇瓶培养→小罐培养→中试→生产规模
10.1 生物过程的优化
优化方法
1单次单因子法
2统计法：Plackett-Burman法，部分因子设计法响应面法，响应面法
响应面法：中心组合设计法，Box-Behnken法
3改进单纯形法
统计法一般需要经过以下几步：实验设计；实验结果的数据分析，以得到合适的数学模型；
数学模型的检验，即方差分析；求解最优化值及其校验。
一、Plackett-Burman法
Plackett-Burman法是一种两水平的实验设计方法，它试图用最少的实验次数达到使因子的主
效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个
因子，但无法考察各因子对发酵的相互交叉的影响，因此常作为响应面法的初步实验，用于
确定影响发酵过程的重要因子。
1. 实验设计
Hadamard矩阵
设计的准则为：
1) 若要考察k 个因子，则需要进行N=k+1个实验，为便于进行方差分析，往往要求k 至少
包括1-3个虚构变量，即空项，且k为奇数；
2) 每个因子取两个水平，即用“＋”、“－”分别代表其高、低水平，低水平为原始培养条件，
高水平约取低水平的1.25倍；
3) 矩阵每行含“＋ ”的数目为(k+1)/2，含“-”的数目为(k-1)/2，而每列含“+ ”、“-”的数目相等；
4) 矩阵第一行任意排列，但必须符合上述要求，最后一行全部为“-”；其余行以上一行的最
后一列为该行的第一列，上一行的第一列为该行的第二列，其余类推。
2. 数据分析
3. 方差分析
二、响应面法
1. 实验设计
2. 数据分析
3. 方差分析
4. 优化
10.2 生物过程的放大
不管是微生物细胞、动、植物细胞还是重组质粒，要进行工业化生产，都必须经过放大中试
阶段，生化过程的放大有各种各样的方法和手段，其放大方法和原理林林总总，对具体某一
体系来说，用何种放大模式可以快捷地成功过渡到工业化生产，没有固定模式，必须针对具
体菌种生理生化及培养基及环境条件的放大效应综合考虑，至目前为止，生化过程放大一直
是个长脖子的事。
传统的工业放大，一般要经过四个阶段：实验室摇瓶培养、实验室小型发酵罐培养、中间
工厂和生产工厂。
一、摇瓶与罐培养的差异
摇瓶的试验条件放大到生产罐或小发酵罐的试验条件转移到大发酵罐时，它们所得产物的产
量往往不完全一致，特别是产抗生素的新菌株，差异更大，当然也有一致的巧合。引起这种
差异的原因本质上是由这两种试验规模变化所引起的。它们引起的差异是很复杂的。
引起摇瓶和罐培养的差异主要原因为：
1) 体积氧传递系数(KLa)和溶解氧的差异；Kd在摇瓶发酵和罐发酵中的差异很大，Kd值也可
能差几倍。罐中的(Kd)一般都大于摇瓶。
2) CO2浓度的差异；CO2在水中的溶解度随外界压力的增大而增加。发酵罐处于正压状态，
而摇瓶基本上是常压状态，所以罐中培养液的CO2浓度明显大于摇瓶
3) 菌丝受机械损伤的差异；罐发酵时，菌体，特别是丝状菌，却受到搅拌叶的剪切力的影
响而受损。其受损程度远远大于摇瓶发酵。
综上所述，上述三个原因就可能造成摇瓶发酵和罐发酵结果之间存在着差异。如果菌株要求
较高的KLa值和溶解氧时，罐中生产能力就有可能高于摇瓶，并随KLa和溶氧水平上升而提
高。如果菌株对机械损伤是比较敏感的，则罐中生产能力就会低于摇瓶，并随搅拌强度的增
强而降低。有时菌株对溶氧和搅拌强度都敏感，其结果就随发酵罐的特性而不同。
二、放大的方法
放大的主要任务是在模型罐与大型罐几何相似的前提下，进行大型罐的空气流量、搅拌转速
和搅拌功率消耗的计算。
放大的方法
1单位体积输入功率相等
2保持KLa不变
3单位体积空气流量相同
4空气直线流速相同
1. 几何尺寸放大
在发酵罐放大中，放大倍数实际上是罐的体积增加的倍数，即放大倍m = V2/V1
2. 空气流量的放大
3. 搅拌功率及搅拌转速的放大
思考题
1. 生物过程的研究一般可分为哪几个阶段？
2. 生物过程优化的方法有哪些？
3. 某产物的发酵培养基(g/L)为葡萄糖50 、蛋白胨10、酵母膏10、KH2PO4 2、MgSO4 1，
请设计Plackett-Burman的实验方案。
4. 根据文献报道，在机械搅拌通气发酵罐中，黑曲霉葡萄糖氧化酶发酵生产工艺为
pH5.5-6.0，搅拌转速500rpm，气液比1.0-1.5 vvm，现在某研究人员为了确定自己
筛选获得黑曲霉菌种在5L机械搅拌通气发酵罐中，葡萄糖氧化酶的最佳发酵工艺，
请为其设计改进单纯形法的最初4组实验方案。在完成这4组实验后，若第2组产
葡萄糖氧化酶最差，请问第5组实验方案如何？
5. 摇瓶培养与罐培养有何差异及其原因？
6. 放大的基本原则是什么？放大的准则有哪些？简述主要的放大方法。