菌种培养
菌种培养
菌种培养方法
①菌种投加时间及使用量
菌种投加时间以及用量
第一天投加地点为全池均匀泼洒，以后投加于进水端。
②菌种激活
菌种泼洒前用5L污水溶解菌种，搅拌3~5分钟。
③培养方法
第一天，往池中放满水，停止出水，均匀投加菌种于池内，闷曝（系统不进水、不出水，只曝气）2天。
如果水解酸化池中没有曝气设备，可静泡2天。
第三天停止曝气，静沉2小时后开始连续进水。
起始阶段每天处理量为1/5的设计处理量，可采取连续或间断进水。
根据出水状况及微生物生长情况，逐步增加进水量以及进水浓度。
每次负荷提升应建立在水质变好的基础上，水质变好的标准：好氧池池面泡沫少，黏性小，好氧池出水清澈、透明度增加，COD有良好去除率。
每次所提升水量约为设计水量的20-30%。
④调试期间可能会出现的情况及对策
白色泡沫过多。
调试期间这种状况为正常情况，随着微生物逐步
成熟泡沫会慢慢消失。
溶解氧过高。
可采取间歇曝气来调节溶解氧。
出水COD升高，水质变浑浊。
应及时检测进水COD、氨氮及总磷含量，以及检查进水是否含有有毒物质，如：硫化物、消毒液、重金属等，如发现氮磷缺乏，应加大尿素及磷酸盐投加量，否则应适当减少进水量，待水质恢复后再逐步增大水量。
培养纯菌种可以用哪些方法？
培养纯菌种可以用哪些方法？培养纯菌种可以分为三个步骤，分别是培养母种，培养原种和培养栽培种。
你知道培养纯菌种可以用哪些方法吗？来学习一下吧！一、木棒培养母种这种方法适用于木耳、香菇和银耳等生于段木上的食用菌。
选出菇最多，生长最好的段木，并将其上出菇最多的一节锯下来，长约3厘米，去树皮。
将心木放入75%酒精中消毒2分钟，用蒸馏水冲洗干净，用消毒纱布擦干。
再用刀纵劈成3厘米长的木条，形状像火柴棒，棒中长满了菌丝。
用镊子夹取1条，斜插在试管中马铃薯洋菜培养基的斜面上。
将试管放在25℃的环境中培养，约30天，菌丝长满培养基，就可以得到我们需要的母种了。
这个方法有以下几个特点。
第一个，容易感染杂菌。
因此，段木用75%酒精消毒后，仍应在培养基中加些链霉素、青霉素或金霉素等，其用量是每毫升中加30单位（或1000毫升中加40微克），以抑制杂菌。
第二个，无性繁殖，菌丝为双核菌丝。
第三个，对银耳来说，木条中已有两种菌丝。
接种后，银耳菌丝与香灰菌丝同时生长，香灰菌丝由白色变成浅灰色，培养基由黄变黑，这表明香灰菌丝成熟，而不是杂菌。
二、木塞培养栽培种用打孔器，在桑、榆、槐、乌柏、重阳木、无患子、栗和悬铃木等硬木上打孔，取下圆柱形的木塞，直径约1厘米，长约1.5厘米。
将木塞浸入水中24小时，使其吃透水分，再取出沥水，按其干重的3份比例，加入锯末培养基2份，拌和均匀。
然后进行装瓶，在750毫升的广口瓶中，可装木塞200~300个，其间用锯末培养基填充。
在高压灭菌锅中加压灭菌2小时后，放凉，即可接入原种。
在25℃的室内培养30天，菌丝长满全瓶，即为栽培种。
木塞栽培种，适用于段木栽培香菇、木耳和银耳等。
如果有意识地选择直径10-20厘米的段木，按行距5厘米，株距10厘米的距离，梅花形打孔取木塞，培养成栽培种，则在接种时，将木塞从栽培种瓶中取出来，直接放回原来的孔中，木塞中长满了菌丝，即生入段木中。
菌种瓶中充满着锯末培养基，也是栽培种，可在段木上砍花接种。
菌种扩大培养的一般流程
菌种扩大培养的一般流程菌种扩大培养是微生物学实验中常见的一项操作，其目的是在较小的培养基中培养并扩大菌种数量，以满足后续实验的需要。
下面将介绍一般的菌种扩大培养流程，以帮助读者了解和掌握这一技术。
第一步：选择适当的培养基菌种扩大培养的第一步是选择适当的培养基。
不同的菌种对培养基的要求不同，因此选择合适的培养基是非常重要的。
一般来说，培养基应包含适当的营养物质，如碳源、氮源、矿物质和水等，以满足菌种生长的需要。
第二步：制备培养基制备培养基是菌种扩大培养的关键步骤之一。
一般情况下，制备培养基需要将适量的培养基粉末溶解在适量的蒸馏水中，并进行加热煮沸，以杀灭其中的细菌和其他微生物。
然后，将煮沸的培养基倒入无菌培养皿或试管中，并在冷却后加入适量的菌种。
第三步：接种菌种接种菌种是菌种扩大培养的关键步骤之一。
接种菌种时，首先需要将菌种从原始培养基中转移到新的培养基中。
这可以通过采用无菌的接种环、接种针等工具，将菌种从原始培养基中接种到新的培养基中完成。
为了确保接种的无菌性，可以在接种后进行密封和贴标。
第四步：培养菌种在接种菌种后，需要将培养基置于适当的环境条件下进行培养。
一般来说，菌种的生长需要适宜的温度、湿度和氧气条件。
因此，在培养过程中需要注意保持适宜的培养环境，并定期观察菌落的生长情况。
第五步：检测菌种的生长情况在培养一定时间后，需要检测菌种的生长情况。
这可以通过肉眼观察菌落的形态、颜色和大小等特征来判断。
同时，也可以采用显微镜观察菌落的细胞形态和结构，以进一步确定菌种的生长情况。
第六步：收获菌种在菌种生长到一定程度后，可以进行菌种的收获。
一般来说，菌种可以通过离心、过滤和冻干等方法进行收获。
收获后的菌种可以用于后续的实验操作或保存在冷冻库中。
菌种扩大培养的一般流程包括选择适当的培养基、制备培养基、接种菌种、培养菌种、检测菌种的生长情况和收获菌种等步骤。
通过掌握和熟练操作这一流程，可以有效地扩大菌种数量，并满足后续实验的需要。
某污水站菌种培养方法
某污水站菌种培养方法污水站菌种培养是指利用合适的培养基和培养条件来培养和富集污水中的微生物种群。
以下是一种常用的污水站菌种培养方法：一、样品采集和处理：1.在污水站的取样点取得约100mL的污水样品。
2.将样品放入一个无菌50mL离心管中，并密封好。
3. 在取样点进行尺寸为1cm x 1cm的样品现场培养板以便监测即时采样。
二、菌种培养流程：1.无菌操作台上，准备好所有必需的培养基和试管、瓶子、培养皿等。
2.在无菌条件下，将100mL的污水分散均匀地滴在含有70mL的无菌盐基液（如贝尔顿液）中。
3.将加入污水的盐基液用容积为9mL的离心管分装成10份，并标记好。
4.把每份盐基液分别振摇均匀后，在无菌条件下将每份分装到无菌联合无菌袖珍型筒状培养皿中。
5.将培养容器放入28~30°C的恒温培养箱内，培养24小时。
三、菌落鉴定：1.根据需要，分别将菌落培养在无菌琼脂平板、马铃薯蔗糖平板等不同培养基上进行纯化。
2.根据菌落的形态、颜色和其他特征，观察菌落的外形和微观形态，并进行初步判断。
3.进行生化鉴定和生理特性的测试，如氧需求情况、酸碱度耐受性等。
4.进一步进行分子鉴定，如16SrRNA基因序列分析等。
四、结果分析：根据鉴定结果，对菌株进行分类和鉴定。
可以根据鉴定结果，对污水站的水质状况进行初步评估，并制定相应的控制措施。
五、注意事项：1.在所有操作中都要保持无菌条件，以防止样品受到外界污染。
2.在培养菌种的过程中要严格控制温度、湿度和氧气含量等培养条件。
3.需要使用防护设备，如手套、面罩和实验室大气过滤器等，以降低可能的感染风险。
总结：对于污水站菌种的培养方法来说，采样和处理、菌种培养流程、菌落鉴定和结果分析都是非常重要的步骤。
只有通过严格保持无菌条件并控制合适的培养条件，才能获得具有代表性的菌种样品，并进一步对其进行鉴定分析。
这样的培养方法可以帮助我们更好地了解和控制污水站中的微生物群落，以提高废水处理的效果。
污水处理培养菌种方法
污水处理培养菌种方法一、引言污水处理是保护环境和人类健康的重要措施之一。
在污水处理过程中，菌种的使用起着至关重要的作用。
本文将详细介绍污水处理中常用的菌种培养方法。
二、菌种的选择在污水处理中，常用的菌种包括厌氧菌、好氧菌和兼性厌氧菌。
厌氧菌可在缺氧条件下生长，好氧菌需要氧气进行代谢，而兼性厌氧菌则可在缺氧和有氧条件下生长。
根据不同的处理需求，选择合适的菌种进行培养。
三、菌种培养方法1. 厌氧菌培养方法（1）制备培养基：将适量的蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵等溶解于蒸馏水中，加热煮沸后冷却，加入适量的硫酸镁、氯化钠等，调整pH值至7.0左右。
（2）接种培养基：将污水样品取适量加入培养基中，摇匀后封闭。
（3）培养条件：将培养基置于恒温培养箱中，温度控制在35℃左右，保持缺氧状态。
（4）观察和收获：培养一段时间后，观察菌落的生长情况，根据需要收获菌种。
2. 好氧菌培养方法（1）制备培养基：将适量的蛋白胨、葡萄糖、氯化钠等溶解于蒸馏水中，加热煮沸后冷却，调整pH值至7.0左右。
（2）接种培养基：将污水样品取适量加入培养基中，摇匀后封闭。
（3）培养条件：将培养基置于恒温培养箱中，温度控制在25℃左右，保持有氧状态。
（4）观察和收获：培养一段时间后，观察菌落的生长情况，根据需要收获菌种。
3. 兼性厌氧菌培养方法（1）制备培养基：将适量的蛋白胨、葡萄糖、硫酸铵等溶解于蒸馏水中，加热煮沸后冷却，加入适量的硫酸镁、氯化钠等，调整pH值至7.0左右。
（2）接种培养基：将污水样品取适量加入培养基中，摇匀后封闭。
（3）培养条件：将培养基置于恒温培养箱中，温度控制在30℃左右，保持缺氧和有氧交替状态。
（4）观察和收获：培养一段时间后，观察菌落的生长情况，根据需要收获菌种。
四、菌种培养的注意事项1. 严格控制培养条件：包括温度、光照、氧气浓度等，以保证菌种的正常生长。
2. 选择合适的培养基：不同的菌种对培养基的要求不同，应根据菌种的特性选择适宜的培养基。
菌种分离与培养
菌种分离与培养（1）人们采取无菌操作的方法，把某种食用菌从混杂的微生物中，单独地分离开来，这个过程叫做菌种分离。
从分离过程中得到的菌丝体纯化后，就是纯菌种。
在实验室条件下，以人工使纯菌种大量生长和繁殖的方法，叫做培养。
一、母种培养(一)菌种分离菌种分离通常采用的方法有孢子分离法、组织分离法和寄主分离三种方法，三种方法各有特点，可根据不同的菌类和生产条件选择使用。
1.孢子分离法孢子分离法，是利用成熟子实体的有性孢子能自动从子实体层中弹射出来的特性，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，而获得纯种的一种方法。
(1)孢子的采集①种菇的选择用作分离菌种的种菇，应选择出菇早、朵型好、个体肥大、生长健壮、无病虫害、八成熟的菇体。
一进入出菇期，就要注意观察选择，并作好标记。
不同的食用菌选择的具体要求是：香菇菇型圆整，菇体肥大，柄细而短，菌盖呈深褐色，出菇早，无病虫害，一般为八成熟的子实体。
双孢蘑菇菇型圆整，光滑直立，颜色洁白，柄粗盖厚，无病虫害，生长快而健壮的单生菇。
草菇菇型端正，肥大健壮，包被未破，无病虫害的单生菇。
平菇出菇早，菌盖厚实，重叠丛生，菌柄粗短，色泽鲜亮，尚未散发孢子，八成熟而无病虫害的子实体。
木耳选朵大、耳片厚、色黑、生长健壮、褶皱多、无病虫害的春耳。
银耳朵大肉肥、色泽洁白、展片良好、朵型美观、八成熟、无病虫害的子实体。
猴头形状正常、颜色洁白、出菇早、生长健壮、菌刺丰满、无病虫害的子实体。
金针菇出菇早而均匀、生长健壮、朵型正常、菌柄长短适中、无病虫害的子实体。
②种菇的消毒子实体采回后要及时切除基部，并进行表面消毒。
对子实体层未外露的种菇(如蘑菇等)，可浸入0.1%升汞溶液中消毒约1分钟，用镊子捏出后经无菌水冲洗数次，再用无菌纱布将表面水吸干；对于子实层裸露的种菇(如香菇等)，只能用75%酒精揩擦菌盖及菌柄表面；而对于银耳、木耳类子实体，却千万不能接触消毒剂，只能置于烧杯中用无菌水洗涤，然后捏起再经无菌水冲洗数次，同样用无菌纱布吸干表面水。
菌种培养过程中常见的问题
在菌种培养过程中，可能会遇到一些常见问题。
以下是一些可能出现的问题以及可能的解决方法：1. 污染：污染是菌种培养中最常见的问题之一。
可能的污染源包括空气、培养基、仪器设备等。
为了防止污染，可以采取以下措施：- 严格的无菌操作：使用无菌技术进行培养操作，包括洗手、穿戴无菌手套、喷雾消毒操作台等。
- 使用高质量的培养基和试剂：选择经过验证和检测的培养基，并确保其无菌。
- 定期检查培养物：观察培养物是否有异常的颜色、形态或气味等变化提示污染发生。
2. 生长不良：菌种在培养过程中可能会出现生长缓慢、生长不均匀或无生长等问题。
解决方法可能包括：- 检查培养条件：检查温度、湿度、氧气和二氧化碳浓度等培养条件是否适合该菌株的生长要求。
- 营养补充：检查培养基中的营养物浓度是否适当，并考虑添加合适的营养物以提供必要的生长要素。
- 检查菌种质量：确保菌种的纯度和活力，可以进行冻存备份或重新分离培养。
3. 发生菌株突变：在长期培养过程中，菌株可能发生突变，导致菌株特性的改变。
要解决这个问题，可采取以下措施：- 定期进行感性检查：定期检查培养基中的菌株特性，如形态、生长速度、代谢产物等。
- 保存原始菌株：在培养初期获得的原始菌株可以保存备份，以备将来恢复原始性状或与突变菌株进行比较。
4. 产物产量低：如果所期望的产物产量低于预期，可能是由于某些因素的影响。
解决方法可能包括：- 优化培养条件：例如，调整温度、pH值、培养基组分等，以最大程度地促进产物的合成和积累。
- 改进培养策略：例如，采用特定的培养方式（如批量培养、连续培养、补料策略等）来提高产物产量。
- 改进菌株选择：有时候，通过筛选和选育新的高产株系或采用遗传工程手段来改进产物产量。
5. pH 值偏离理想范围：菌种在培养基中的生长和代谢通常对pH 值敏感。
如果pH 值偏离了菌种所需的理想范围，可以采取以下措施：- 调整培养基的pH 值：通过添加酸或碱来调整培养基的pH 值，使其适应菌种的生长要求。
生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
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第一章无菌操作技术第一节灭菌技术一、干热灭菌1.1、灼烧灭菌【总操作程序】主要分两个步骤：点燃火源灼烧2～3次。
具体操作如下：①点燃火源一般使用酒精灯或煤气灯，点燃酒精灯或煤气灯。
②灼烧2～3次一般右手持待灭菌的器具，在火焰的外焰上来回灼烧2～3次。
【达标标准】灭菌后的器具干燥，所有的微生物被杀死。
【注意事项】①正确使用火源，防止失火。
使用酒精灯时，先要检查灯芯，如果灯芯顶端不平或已烧焦，需要剪去少使其平整，然后检查灯里有无酒精，灯里酒精的体积应大于酒精灯容积的1/4，少于2/3。
在使用酒精灯时，应注意，绝对禁止用酒精灯引烧另一盏酒精灯，而应用燃着的火柴或木条来引燃；用完酒精灯，必须用灯帽盖灭，不可用嘴去吹灭，否则可能将火焰沿灯颈压入灯内，引起着火或爆炸。
不要碰倒酒精灯，万一洒出的酒精在桌上燃烧起来，不要惊慌，应立即用湿抹布扑盖。
灼烧时应用火焰的外焰②主要用于实验室接种针、接种环、试管口和玻璃棒等的灭菌。
涂布平板用的玻璃棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
【相关知识】干热灭菌的原理：热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
1.2、干热灭菌【总操作程序】主要分五个步骤：装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物。
具体操作如下：①装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱内，关好箱门。
②升温接通电源，拨动开关，打开电热干燥箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升，当温度上升到100℃时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；此时如果还未达到所需的160～170℃,则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，知道达到所需温度。
③恒温当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，恒温2h。
④降温切断电源，自动降温。
⑤开箱取物待电热干燥箱内温度降到70℃以后，打开箱门，取出灭菌物品。
【达标标准】灭菌后的物品经无菌检测结果符合要求。
一般不需要检测，因为SAL值一般大于12。
SAL（Sterility assurance level）值是无菌保证值，无菌保证值为灭菌产品后微生物残存率的负对数，表示物品被灭菌后的无菌状态。
【注意事项】①一般用于培养皿、试管、枪头等的灭菌，灭菌时各种器皿用纸包好，培养皿可直接装入金属制的培养皿筒内，移液管可以放入移液管筒中。
②灭菌期间，要有专人看管，切勿同时干其他事情，以免发生事故。
③物品不要放得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触点燃干燥箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦着火。
④干热灭菌过程中，严防恒温调节器的自动控制失灵而造成安全隐患事故。
⑤干热灭菌温度不能超过180℃，否则包装纸和棉塞就会烧焦，甚至燃烧。
⑥温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
⑦灭菌后的器皿，在使用前勿打开包装纸，以免被空气中的杂菌污染。
【相关知识】电热干燥箱的使用操作方法，参照产品使用说明书。
二、湿热灭菌2.1常压间歇灭菌【总操作程序】主要分4步：装入待灭菌物品灭菌灭菌后的物品放置室温下连续3d 具体操作如下：①装入待灭菌物品需要灭菌的物品包装好后放置于蒸汽灭菌器或蒸笼中。
②灭菌加热100℃，保持30min。
③灭菌后的物品放置于室温下取出灭菌后的物品放置于室温下18～24h。
④连续3d第二天再加热100℃，灭菌30min，灭菌后的物品取出放置于室温下，第三天再同样处理一遍，可达到完全灭菌的目的。
【达标标准】物品应达到完全灭菌，如果是灭菌培养基放在37℃温箱培养24h，无杂菌生长，即可待用。
【注意事项】①不能用于怕受潮物品的灭菌。
②适用于不易用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。
③灭菌后的器皿，在使用前勿打开包装纸，以免被空气中的杂菌污染。
【相关知识】①根据情况，湿热灭菌也可以采用煮沸灭菌，时间为10～15min,这样可以杀死细菌所有营养细胞和部分芽孢。
如延长煮沸时间，并在水中加入1%碳酸氢钠或2%石碳酸，效果更好。
②灭菌一次30min，只能杀死微生物的繁殖体、真菌的孢子和细菌的部分芽孢，而不能杀死所有的芽孢。
当把第一次灭菌后的物品放置室温下时，物品上残存的芽孢就会萌发，变成繁殖体，繁殖体对热力的抵抗力远远弱于芽孢的抵抗力。
因此，当第二次灭菌时，又可以杀死芽孢形成的繁殖体。
这样进行三次，即可达到完全灭菌的目的。
③湿热灭菌是用饱和水蒸汽、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法的灭菌效率要比干热法高。
2.2、高压蒸汽灭菌【总操作程序】主要分8个步骤：加水装料加盖排气升压保压降压灭菌后的处理。
具体操作如下：①加水首先将锅内层取出，再向外层锅内加适量的水，使水面与三角架持平为宜，水应用蒸馏水。
②装料放回内层锅，待灭菌物品包装好后放入灭菌锅内。
③加盖将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，旋紧锅盖，打开排气阀。
④排气用电炉或煤气加热，或用自动高压蒸汽灭菌锅，使水沸腾以排除锅内的冷空气，冷空气排净完，关闭排气阀。
一般小型排气5min，大型的10min。
⑤升压排气阀关闭后，压力上升。
⑥保压当锅内压力升到所需压力时，保持热源，维持压力至所需要的时间。
⑦降压灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内的温度自然下降，待压力降到零位时，打开盖子，取出灭菌物品。
⑧灭菌后的处理每次灭菌完毕，必须倒掉锅内的剩水，按原样放置。
灭菌培养基在37℃条件下放置24h，无杂菌生长，即可待用。
【达标标准】无菌物品经无菌检测合格后即可烘干备用。
【注意事项】①灭菌时要有专人负责，每次灭菌前都要检测安全阀性能是否良好，以防锅内压力过高，发生爆炸。
灭菌时应严格按操作程序进行，避免发生事故。
②各种培养基、溶液、玻璃器皿、金属器械、工作服、橡胶用品等均可用高压灭菌器灭菌。
一般灭菌条件为121℃，20min。
③瓶装液体灭菌时，要用玻璃纸和纱布包扎瓶口，如用橡皮塞，应插针头排气。
灭菌物品摆放不应该太拥挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果，三角瓶和试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
④灭菌的各种包裹都不应过大、过紧，一般应小于55cm×33cm×22cm。
⑤灭菌时高压锅内冷空气要排除干净。
⑥务必等压力降到零时，才可以打开锅盖，否则因锅内压力突然下降，使培养基或其他液体会发生再次沸腾，液体冲上瓶口沾湿棉塞。
⑦已灭菌的物品应做好标记，以便识别，灭菌后的物品在使用前勿打开包装纸，以免空气中的杂菌污染。
【相关知识】不同的高压蒸汽锅的使用方法不同，参照说明书。
三、过滤除菌【总操作程序】主要有5个步骤：组装、灭菌连接压滤无菌检测清洗。
具体操作如下：①组装、灭菌微孔滤膜过滤除菌时，首先将滤膜与滤器组装好，包装灭菌后待用。
其他过滤装置，过滤前应将过滤器和收集滤液的试管组装好，抽滤瓶口应塞一段棉塞以阻止空气中的细菌进入滤瓶中，用纸包装好进行加压灭菌，在121℃下灭菌20min。
②连接将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作的方式连接于装有待滤液的注射器上，将针头与出口连接并插入带有橡皮管的无菌试管中。
③压滤将注射器中的待滤液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。
④无菌检查无菌操作吸取除菌滤液0.1mL于肉汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置37℃室温下培养24h，检查有无菌生长。
⑤清洗弃去滤膜，清洗干净滤器，换上新的滤膜组装好灭菌待用。
【达标标准】无菌操作吸取除菌滤液0.1mL于肉汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置37℃室温下培养24h，检查有无菌生长，无菌生长即可。
【注意事项】①许多材料，例如血清、抗生素及糖溶液等原料，用加热消毒灭菌方法，均会被破坏，因此通常采用过滤除菌的方法。
②压滤时，用力要适当，不可以太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。
③过滤时应避免各种连接处出现渗透现象。
④过滤除菌时每次过滤必须用新的滤板。
⑤发酵工业上也可以用过滤的方法制备大量的无菌空气。
【相关知识】①过滤除菌的原理。
②微生物的大小。
③滤膜孔径大小的选择。
④应用最广泛的过滤器：蔡氏过滤器和微孔滤膜过滤器。
四、化学药品灭菌【总操作程序】主要分两个步骤：配制溶液喷洒或浸泡、气体熏蒸、擦拭等。
具体操作如下：①配制溶液根据需要配制不同浓度的化学药品灭菌剂。
②喷洒或浸泡、气体熏蒸、擦拭根据灭菌对象的不同，选择不同的灭菌方式。
【达标标准】环境或手上检测无菌。
【注意事项】①通常用于生产环境灭菌，接种操作前双手的灭菌。
②注意各种化学灭菌剂的用途、使用浓度及使用方法。
【相关知识】①化学药品灭菌的原理主要有：使蛋白质变性、脱水、改变细胞壁的通透性等。
②环境灭菌时常用甲醛、乙醇、来苏尔、新洁尔灭、漂白粉、过氧乙酸等。
③环境中微生物的分布状况和微生物的检测。
④甲醛（37%）：将此溶液直接加热，产生气态甲醛用于无菌室的灭菌5；新洁尔灭：可用于擦拭工作台，或浸泡手5min。
溶液可以反复使用40次；漂白粉（0.3%～0.5%）可灭空气中的微生物；过氧乙酸：喷雾或蒸汽灭菌（0.1～0.2mg/L），浸泡器具灭菌（5%，20min）。
乙醇（75%～80%）：擦拭或浸泡，可用于皮肤表面、操作台及其相关器具的灭菌。
⑤环氧乙烷：可用于物料灭菌和受热易破坏的培养基灭菌。
把所需灭菌的物料置于不透气的囊袋中，充入环氧乙烷-二氧化碳，密闭进行灭菌。
将培养基温度降至10℃以下，加入1%（V/V）环氧乙烷，将容器密闭1～2h灭菌后，升温至37～45℃，保温数小时或过夜，使环氧乙烷汽化逸出。
五、射线灭菌5.1单用射线灭菌【总操作程序】主要分3个步骤：灭菌前的准备灭菌检查。
具体操作如下：①灭菌前的准备将无菌室内或在接种室内（如果用于培养基的灭菌，应提前把盛有培养基的培养皿放进来）打开射线电源开关。
②灭菌照射30min，将开关关闭。
③检查将盛有培养基的平皿打开15min,然后盖上皿盖。
置37℃培养24h，共做三套。
检测每个平皿生长的菌落数。
如果不超过4个，说明灭菌效果良好；否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。
【达标标准】无菌室检查，一般培养基无菌检测时，菌落不超过4个。
【注意事项】①由于紫外对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。
②紫外线的穿透力低，只能用于表面灭菌，对固体物料灭菌不彻底，不能用于液体物料灭菌，一般用于无菌室、接种箱、培养间等的空间灭菌。
【相关知识】①射线灭菌的原理。
②可以利用的有紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子。
③紫外线波长在200～300nm，具有杀菌作用，其中以265～266nm杀菌力最强。
此波长的紫外线易被细胞中的核酸吸收，造成细胞损伤而杀菌，紫外线灭菌在微生物工作及生产实践中应用广泛，无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。