Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)
Western Blot实验指导教程
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB）一、蛋白提取与样本制备（一）操作步骤1.提前解冻RIPA（蛋白裂解液），一定要完全融化；2.根据样本数配制混合溶液：PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）：RIPA=1：100，现用现配）；3.裂解组织：每个样品称取50mg，加1ml混合液，在冰上用组织剪剪减为碎屑，电动匀浆后4 ℃静置2h使其充分裂解，离心12000g，4 ℃15min，取上清；4.蛋白定量：1)取少量上清稀释10倍：2ul上清，加18ul生理盐水；2)标准品按5ug/ul至0.3125ug/ul的梯度进行倍比稀释（制作平行样的标准曲线：5mg/ml标准品取80ul + 生理盐水80ul）；3)配制显色剂BCA混合液：a液：b液=50:1。
配制量=200ul*（孔数+6）；4)加入稀释完成的各样到酶标板的孔中及BCA混合液200ul/孔；5)贴上封口胶，37℃震荡混匀30min；6)562nm波长处测吸光度OD；7)根据数据制图、添加趋势线、方程及R2。
5.样品OD值带入方程，计算出各样本原液蛋白浓度；6.样本蛋白浓度均一化（一般样品蛋白浓度为3-4mg/ml）；7.100℃变性5min。
8.分装并存于-20 ℃，避免反复冻融。
二、配置相关试剂（一）10%的SDS（戴口罩称取）：试剂剂量SDS （g）10双蒸水（ml）80用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。
室温保存，如在长期保存中出现沉淀，加温溶化后，仍可使用。
（二）1.5M Tris/HCl（pH8.8）试剂剂量Tris base （g）18.17双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH 8.8，最后定容至100ml。
室温下保存。
（三）0.5M Tris/HCl（pH6.8）试剂剂量Tris base （g） 6.06双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH6.8，最后定容至100ml。
室温下保存。
（四）丙/双丙（戴口罩称取）试剂剂量丙烯酰胺（Acr）（g）75亚甲双丙烯酰胺（g） 2去离子水（ml）230加热溶解后，定容至250ml，4℃棕色瓶避光保存。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)培训讲学
W e s t e r n b l o t步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全)(1)Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2014年6月第一部分细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程 (碧云天试剂盒)一、原理在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。
分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。
约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。
抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。
本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。
最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。
本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。
二、注意事项1.需自备PMSF。
PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。
可以抽提的组织样品数通常不足100个。
4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。
Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)
Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2014年6月第一部分细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒)一、原理在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。
分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。
约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。
抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。
本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。
最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。
本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。
二、注意事项1.需自备PMSF。
PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。
可以抽提的组织样品数通常不足100个。
4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。
但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
western blot步骤
蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析Western Blot基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot应用：目的蛋白的表达特性分析，目的蛋白与其它蛋白的互作，目的蛋白的组织定位，目的蛋白的表达量分析。
Western Blot 流程：蛋白样品的制备，制胶，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗杂交，二抗杂交，底物显色。
（一）蛋白样品的制备：提取总蛋白:所有操作在冰上进行,且所有操作要对着容器壁操作，防治将细胞吹落；操作前先用PBS将细胞洗2变。
1.将原瓶/皿中放入5ml生理盐水或PBS，根据细胞团块大小加入100-300μl RIPA裂解液，吹匀后，4℃摇床30min。
2. 4℃，12000×g 15min，离心后取上清，测浓度。
BCA蛋白浓度测定方法：原理碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在570nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
特点1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1-20微升。
2. 在50-2000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。
步骤(标准品为BSA，标准品稀释液为生理盐水)①50体积BCA试剂A（碧云天）加1体积BCA试剂B（碧云天）（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；②完全溶解蛋白标准品(即BSA)，取10微升稀释至100微升(生理盐水稀释) ，使终浓度为0.5mg/ml；③将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20微升加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升(此时浓度分别为0 0.5 1 2 4 6 8 10);④加适当体积样品(1微升)到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升;⑤各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟;⑥测定570nm处的波长也可接受。
(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n 封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
Western blot 试剂配制及实验步骤
Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L Tris·HClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
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Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2014年6月第一部分细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒)一、原理在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。
分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。
约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。
抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。
本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。
最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。
本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。
二、注意事项1.需自备PMSF。
PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。
可以抽提的组织样品数通常不足100个。
4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。
但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
三、使用说明1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。
取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。
取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍）2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%处理5min）处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。
离心（1400 r/min 5min）收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
3. 对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
4. 每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。
(对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。
)5. 最高速剧烈涡旋震荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。
(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长震荡时间。
)（时间可稍长，保证细胞破碎）6. 冰浴10-15分钟。
7. 加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。
最高速剧烈V ortex 5秒，冰浴1分钟。
8. 最高速剧烈V ortex 5秒，4℃12,000-16,000g离心5分钟。
9. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。
可以立即使用，也可以冻存。
(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。
)10. 对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。
(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。
)11. 最高速剧烈V ortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。
然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈V ortex 15-30秒，共30分钟。
12. 4℃12,000-16,000g离心10分钟。
13. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。
可以立即使用，也可以-70℃冻存。
14. 对于新鲜组织：A. 把组织尽可能切成非常细小的碎片。
按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。
并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。
按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。
匀浆需在冰浴或4℃进行。
B. 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。
C. 4℃1,500g离心5分钟。
把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。
(吸上清时千万不要触及沉淀。
)D. 对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。
接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。
抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14C中抽提得到的细胞浆蛋白合并。
第二部分蛋白定量-BCA 法(南京建成试剂盒)一、实验仪器：试管、微量移液器、旋涡混匀器、37℃水浴箱（气浴箱）、可见分光光度计（562nm）二、适用范围：本试剂盒可测各种动物血清（浆）、组织、培养细胞、细胞培养上清及植物等样本中的蛋白含量。
三、试剂组成及配制试剂一：粉剂2支、稀释液12.5 ml 2瓶试剂一应用液的配制：取试剂一粉剂1支与试剂一稀释液1瓶混匀，溶解完全后4度待用。
试剂二：250μl 2支工作液的配制：按试剂一应用液：试剂二=50:1的比例配制，混匀后待用，用多少配多少。
试剂三：终止剂储备液20ml 1瓶终止剂应用液：取终止剂储备液用双蒸水5倍稀释后备用，4度冷藏试剂四：563 ug/ml 蛋白标准液0.2ml 1支，4度保存1个月（可分装-20冷冻）四、操作步骤：1、样本前处理：①、动物组织样本：准确称取组织重量，按重量（g）：体积(ml)=1:9 的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500 转/分，离心10 分钟，取上清液，待测。
②、植物组织样本：准确称取组织重量，按重量（g）：体积(ml)=1:9 的比例，加入9 倍体积的匀浆介质，冰水浴条件下机械匀浆，3500 转/分，离心10 分钟，取上清液，待测。
③、血清（浆）样本：按血清（浆）︰生理盐水=1︰49的比例稀释，待测。
④、其它液体样本：按比例稀释，测定范围为20～2000μg/ml，（不同的样本稀释度不一样），请在批量测试前先做1～2 个样本的预实验。
2、操作表：空白管标准管测定管双蒸水（μl）20 0 00 20 0563μg/ml 标准品（μl）待测样本（μl）0 0 20工作液（μl）250 250 250漩涡混匀，37℃孵育30 分钟终止剂应用液（μl）750 750 750漩涡混匀，静置5 分钟，562nm 波长，水调零，0.5cm 光径测各管OD 值五、计算公式：六、测定原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，562nm 处有最大吸收峰，依据吸光度与浓度成比例，通过测吸光度即可计算待测蛋白的浓度。
七、检测范围检测浓度下限达到20μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，在20~2000μg/ml 浓度范围内有良好的线性关系。
标准曲线范围：标准品浓度（μg/ml）绝对OD值0~2500 0~0.499Western blot相关试剂配制A．30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37℃水浴助溶，定容至100mL。
0.45μm滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。
B．10%十二烷基硫酸钠（SDS）：SDS，10g；H2O，80mL。
68℃加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。
C．10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。
避光，4℃保存。
（4℃2周）D．分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。
E．浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。
F．电泳缓冲液（10×）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。
调节pH至8.3，定容至1L，4℃保存（用时稀释为1×）。
G．5×SDS-PAGEloadingBuffer（5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；溴酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。
充分混匀，分装成500μL/份，室温保存。
使用前每份加入25μLβ-巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。
H．考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇，室温保存I．考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。
室温保存。
J．考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存K．膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；加H2O 600mL充分溶解，加200mL甲醇，混匀，定容至1L，室温保存。
L．TBS缓冲液：NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入约800 H2O搅拌溶解，定容至1L，4℃保存。
M．TBST缓冲液：NaCl，8.8g；1M Tis-HCL(pH 8.0)，20ml，加入约800 H2O 搅拌溶解，加入0.5 ml Tween 20后充分混匀，去离子水定容至1L，4℃保存。
N．1M Tis-HCL(pH 8.0)：Tris 121.1g 置于1L烧杯，加入约800ml去离子水，充分搅拌，加入浓HCL约42ml ，定容至1L，高压灭菌，室温保存。
Western blot电泳、转膜及显色过程1、清洗将玻璃板洗净，用ddH2O冲洗，然后晾干。
封板时保证支架与底座胶条契合，固定时两边同时均匀用力旋动齿轮把手，固定即可，不要用力过大以免压碎玻璃。
封好后可装ddH2O试试，确定不漏后再灌胶。
2、制胶①SDS-PAGE分离胶配方表（12% Gel）各种组分名称各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml)10 ml 15 ml 20 mlH2O 3.3 4.9 6.630%Acrylamide4.0 6.0 8.01.5MTris-Hcl(pH8.8)2.53.8 5.010% SDS 0.1 0.15 0.210%过硫酸铵（AP）0.1 0.15 0.2TEMED 0.004 0.006 0.008②SDS-PAGE浓缩胶（5% Acrylamide）配方表各种组分名称各种凝胶体积对应的各种组分的取样量(ml)4 ml5 ml6 mlH2O 2.7 3.4 4.1 30%Acrylamide0.67 0.83 1.01.0MTris-Hcl(pH6.8)0.5 0.63 0.7510% SDS 0.04 0.05 0.06 10%过硫酸铵（AP）0.04 0.05 0.06TEMED 0.004 0.005 0.0063、封胶①按前面方法配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。